KARAKTERISASI PROTEASE DARI EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L 3 Ascaridia galli

Transkripsi

1 28 KARAKTERISASI PROTEASE DARI EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L 3 Ascaridia galli ABSTRAK Protease mengkatalis reaksi biologik, termasuk metabolisme protein dan reaksi imun. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakter protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli. L 3 diperoleh dari usus halus 100 ekor ayam tujuh hari setelah pemberian dosis 6000 L 2 melalui oesofagus ayam. Sebanyak 5 10 ekor L 3 dikultur secara in vitro dalam setiap ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), ph 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37 o C dan 5% CO 2 selama 3 hari. Ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L 3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur. Aktivitas protease diuji pada kasein 2%. Aktivitas protease dikaji terhadap sensitivitas inhibitor, temperatur, dan ph optimum. Konsentrasi protein dihitung mengikuti metode Bradford. Berat molekul protease diestimasi melalui sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). Hasil penelitian menunjukkan bahwa L 3 melepaskan protease yang dihambat oleh PMSF 0,5 mm. Temperatur dan ph optimum enzim berturutturut 70 o C dan 7. Aktivitas dan aktivitas spesifik enzim adalah 0,625 U/ml dan 4x10 3 U/mg. Estimasi berat molekul enzim pada 28 kda. Hasil tersebut mencerminkan bahwa protease yang diekskresi/sekresikan oleh stadium L 3 A. galli mengandung protease serin. Kata kunci: Ascaridia galli, nematoda, protease, ekskretori/sekretori ABSTRACT Protease catalyse a broad spectrum of important biological reactions, including protein metabolism and immune reactions. A study was carried out to characterize protease from exretory/secretory of A. galli L 3 stage. A. galli L 3 were recovered from intestines of 100 heads chickens 7 days after oesophagus inoculation with 6000 L 2. L 3 recovered in this manner were cultured (5 10 ml 1 ) in flasks containing rosswell park memorial institute (RPMI) 1640 media, ph 6.8, without phenol red. Cultures were incubated at 37 0 C in 5% CO 2 and culture fluid was collected after 3 days in culture. Excretory/secretory was prepared from metabolic product of L 3 released in culture medium. The protease activity was assayed against casein 2%. Inhibitor sensitivity, temperature, and ph optimum on protease activity were studied. Protein concentrations were counted as described in Bradford method. The molecular weight of protease was estimated with sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). The result showed that L 3 released protease which is inhibited by PMSF 0.5 mm. Temperature and ph optimum of the enzyme are 70 o C and 7, respectively. The enzyme activity and protease specific activity are 0,625 U/ml and 4x10 3 U/mg, the molecular weight is estimated as 28 kda. The results indicate that the excretory/secretory secreted by L 3 A. galli contained serine protease. Key words: Ascaridia galli, nematode, protease, excretory/secretory,

2 29 PENDAHULUAN Protease atau enzim proteolitik adalah enzim yang memiliki daya katalitik yang spesifik dan efisien terhadap ikatan peptida dari suatu molekul polipeptida atau protein. Protease dapat diisolasi dari tumbuhan (papain dan bromelin), hewan (tripsin, kimotripsin, pepsin, dan renin), mikroorganisme seperti bakteri, kapang, virus, dan cacing parasitik seperti cestoda, trematoda, dan nematoda. Protease yang diekskresi/sekresikan oleh cacing esensial untuk proses perkembangan dan kelangsungan hidup seperti penetasan telur, molting, dan exsheathment parasit. Protease yang dihasilkan cacing nematoda parasitik memainkan peranan penting pada proses penetrasi dan migrasi parasit ke jaringan inang definitif. Todorova (2000) menyatakan bahwa enzim proteolitik yang disekresikan parasit untuk invasi ke jaringan terdiri dari dua jenis protease, yaitu protease serin dan metal. Kehadiran kedua jenis protease tersebut di dalam produk yang disekresikan cacing nematoda telah dibuktikan oleh Cock et al. (1993) pada Ostertagia ostertagi, Todorova (2000) pada Trichinella spiralis, Rhoads et al. (1997 dan 2001) pada Ascaris suum, dan Iglesias et al. (2005) pada Anisakis simplex. Karakterisasi protease sudah luas dilakukan dari berbagai stadium secara in vitro pada cacing nematoda, termasuk stadium infektif (L 3 ) dan stadium dewasa cacing Trichostrongylus colubriformis dan Haemonchus contortus (Hadas dan Stankiewicz 1997). Karakter protease yang disekresikan cacing nematoda penting diketahui sebagai pengetahuan dasar biologi parasit. Berdasarkan activesite region pada protease sangat memungkinkan untuk merancang inhibitor spesifik sebagai strategi pengendalian dan tindakan terapi terhadap cacing parasitik. Protease yang dilepaskan selama perkembangan parasit berperan sebagai antigen yang potensial untuk memicu imunitas inang definitif. Saat ini, belum ada informasi yang tersedia tentang karakter protease pada stadium L 3 A. galli. Oleh karena itu, fokus penelitian ini adalah karakterisasi protease dari produk ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui karakter protease murni yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli.

3 30 METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Helmintologi, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, dan Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor. Waktu Penelitian berlangsung dari bulan Desember 2005 sampai Mei Rancangan Penelitian Seratus ekor ayam hysex Brown digunakan sebagai ayam donor untuk menghasilkan L 3 A. galli. Tiaptiap ekor ayam diinokulasi dengan dosis 6000 L 2 A. galli. Tujuh hari kemudian, ayam dinekropsi dan L 3 yang berkembang di dalam saluran cerna disaring dan tiaptiap L 3 A. galli diinkubasi dalam sumur cell culture plate yang berisi 5 ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, SigmaAldrich), ph 6,8, tanpa merah fenol yang ditambahkan 100 unit/ml penisilin G, 100 µg/ml streptomisin, 5 µg/ml gentamisin, dan 0,25 µg/ml kanamisin dalam inkubator CO 2 selama 3 hari. Campuran medium dengan ekskretori/sekretori L 3 A. galli disentrifus pada g dengan temperatur 4 o C selama 5 menit (Tiuria et al. 2003). Protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori L 3 A. galli dikarakterisasi berdasarkan aktivitas enzim terhadap inhibitor dan aktivator, temperatur dan ph optimum, pengaruh logam dan inhibitor, konsentrasi dan berat molekul enzim. Pengukuran Aktivitas Enzim Aktivitas protease diuji terhadap casein. Campuran 500 µl 0,6% casein dalam Tris mm (ph 8,0) dan 100 µl enzim diinkubasi selama 2 jam pada temperatur 40 o C. Reaksi dihentikan dengan penambahan 500 µl asam trichloroacetic 0,4 M dan diinkubasikan pada 40 o C selama 10 menit. Setelah sentrifus, 200 µl supernatan dicampur dengan 1 ml sodium carbonate dan 200 µl reagen FolinCiocalteu dan diinkubasikan pada 40 o C selama 20 menit. Jumlah degradasi ditentukan dari absorbansi

4 31 pada 578 nm (Kong et al. 2000; dan Balqis et al. 2006). Aktivitas 1 unit enzim ditetapkan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menguraikan 1µg tyrosine dari casein di dalam 1 ml volume reaksi per menit (Walker 1984). Pengukuran aktivitas enzim mengikuti metode Bergmeyer (Rukayadi dan Suhartono 1999) seperti yang disajikan pada Tabel 3. Untuk setiap sampel yang dianalisis, harus disertai dengan blanko dan standar, dengan perincian sebagai berikut. Tabel 3. Prosedur pengukuran aktivitas protease mengikuti metode Bergmeyer (Rukayadi dan Suhartono 1999) Pereaksi Sampel (ml) Blanko (ml) Standart (ml) Buffer TrisHCl (0,2M), ph 8 Substrat musin 1%, ph 8,0 Enzim dalam CaCl 2 (2mmol/l) Tirosin standar Akuades Inkubasi pada suhu 70 0 C selama 10 menit TCA (0,1 M) Akuades Enzim dalam CaCl 2 (2 mmol/l) 0,20 2,00 0,2 Didiamkan pada suhu 37 0 C selama 10 menit, dan sentriguge 6000 rpm selama 10 menit Filtrat Na 2 CO 3 Pereaksi lain 1,5 5,00 Didiamkan selama 20 menit pada suhu 37 0 C Diukur dengan spektrometer pada λ=578 nm 2,00 0,2 1,5 5,00 0,20 2,00 0,2 1,5 5,00 Pengaruh Inhibitor Tujuan dari karakterisasi ini adalah untuk mengetahui ionion divalen dan monovalen yang mengaktifkan dan menghambat aktifitas enzim, juga untuk mengetahui golongan enzim. Inhibitor yang digunakan adalah inhibitor protease phenil methanyl

5 32 methane sulfonyl fluoride (PMSF) 0,5 dan 1 mm, ethylene diamine tetraacetic (EDTA) 1 dan 10 mm, 1,10phenanthroline 1 mm, pepstatin A 1 µg/ml, dan E64 (10 µg/ml dan 50 µg/ml). Uji pengaruh inhibitor dilakukan dengan cara sebagai berikut: enzim, buffer TrisHCl 10 mm, ph 8, dan inhibitor dipreinkubasi pada suhu kamar (25 C) selama 1 jam. Larutan tersebut diuji aktivitas enzimmya. Reaksi diawali dengan penambahan substrat musin. Aktivitas enzim tersebut dibandingkan dengan aktivitas enzim non inhibitor (Kong et al. 2000). Uji Konsentrasi Protein Analisa diawali dengan pembuatan larutan Bradford dan larutan bovine serum albumin (BSA). Larutan Bradford dibuat dengan cara berikut: sebanyak 100 mg coomasie brilliant blue G250 dilarutkan dalam 50 ml etanol 95%. Setelah itu 100 ml asam fosfat 85% (w/v) ditambahkan. Terakhir larutan diencerkan dengan akuadest sampai 1 liter. Larutan disaring menggunakan kertas saring dan diencerkan 4 kali. Larutan standar segar dibuat dengan menggunakan BSA. Sebanyak 100 mg BSA ditimbang dan ditambahkan 25 ml akuadest. Larutan dibiarkan larut perlahanlahan (tidak dikocok), setelah larut diencerkan sampai 50 ml. Konsentrasi akhir larutan stock untuk standar ini 2 mg/ml. Setelah semua pereaksi siap, langkah selanjutnya adalah memipet masingmasing larutan dalam tiap tabung sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang bersih. Untuk metode makro assay, sebanyak 5 ml pereaksi Bradford ditambahkan kedalam masingmasing tabung reaksi, sedangkan untuk mikro assay pereaksi Bradford ditambahkan 1 ml. Blanko dibuat dengan cara mencampurkan 1,0 ml dan direaksikan 5 ml (makro assay) atau 1 ml (mikro assay) pereaksi Bradford. Setelah sekitar 5 menit, masingmasing campuran reaksi diukur absorbannya pada λ=595 nm. Standart, blanko, dan sampel masingmasing dimasukkan kedalam tabung kuvet untuk dilihat hasil absorbansinya dengan menggunakan spectrophotometer (Rukayadi dan Suhartono 1999). Tahap terakhir membuat kurva dengan absorbansi sebagai ordinat (sumbu Y) dan konsentrasi protein sebagai absis (sumbu X). Berdasarkan kurva tersebut dapat ditentukan konsentrasi protein sampel.

6 33 Penentuan Berat Molekul Protease Penentuan berat molekul enzim dilakukan dengan menggunakan sodium dodecyl polyacrylamid gel electrophoresis (SDSPAGE) mengikuti metode Laemmli (1970). Konsentrasi SDS yang digunakan dalam analisa ini adalah 10% (w/v). Metode dalam analisa ini terdiri atas 3 tahap, yaitu pembuatan gel, running sampel dan fiksasi. Tahap pertama, pembuatan gel dengan dua lempeng kaca yang merupakan cetakan gel dari alat elektroforesis yang dihimpitkan dan diantaranya diletakkan pemisah pada bagian tepi cetakan. Bahan yang digunakan untuk pembuatan gel terdiri dari larutan akrilamid 30%, larutan stok amonium persulfat, buffer reservoir dan buffer pemisah. Tahap kedua, enzim protease yang dicampur dengan pelarut sampel dengan perbandingan 1:1. Campuran dipanaskan dengan air mendidih selama 5 menit, begitu pula dengan larutan marker (Sigma). Sampel selanjutnya dimasukkan dalam sumur dengan volume tertentu, kemudian elektroforesis dijalankan dengan arus sebesar 20 ma serta voltase 40 volt. Marker yang digunakan adalah phosphorilase b (97 kda), albumin (66 kda), ovalbumin (45 kda), carbonic anhydrase (30 kda) tripsin inhibitor (20,1 kda) dan αlactalbumin (14,4 kda). Tahap ketiga, setelah elektroforesis berakhir gel direndam dalam larutan pewarna coomassie brilliant blue sambil diaduk perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan menaruh gel pada larutan pemucat metanol dan asam asetat sambil diaduk perlahan hingga latar belakang gel tampak jernih. Visualisasi berat molekul protease dilakukan dengan SDS PAGE menggunakan arus listrik tegangan 40 volt dengan kuat arus 12 ma pada suhu kamar selama 2 jam. Pada elektroforesis ini disiapkan dengan poliakrilamid 12,5%, gel pengumpul 4%, buffer elektroda dan buffer sampel. Penanda molekul dan sampel masingmasing dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Gel diwarnai dengan Comassie blue R 250 (Serva Germany) selama 30 menit dan dipucatkan dengan larutan pencuci sampai pitapita protein tampak jelas (Laemmli 1970).

7 34 HASIL PENELITIAN Aktivitas Enzim Hasil uji pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim protease crude yang diekskresi/sekresikan oleh stadium L 3 A. galli disajikan pada Gambar 5. Temperatur yang digunakan adalah 27 o C, 37 o C, 40 o C, 50 o C, 60 o C, 70 o C dan 80 o C. Aktivitas enzim terlihat pada temperatur 27 o C dan terjadi peningkatan bertahap sampai pada temperatur 60 o C. Aktivitas enzim sangat meningkat pada suhu 70 o C, dan menurun pada suhu 80 o C. Berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui bahwa temperatur optimum untuk aktivitas enzim pada crude ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli adalah 70 o C Aktivitas enzim (U/ml) Temperatur ( o C) Gambar 5. Pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli Aktivitas enzim diuji terhadap perubahan ph. Aktivitas enzim terlihat pada ph 6 dan sangat meningkat pada ph 7. Aktivitas enzim menurun pada masingmasing ph 8, ph 9 dan ph 10. Berdasarkan hasil yang diperoleh, ph yang paling sesuai untuk aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli adalah ph 7, sehingga semua pengujian berikutnya dilakukan pada ph 7. Hasil uji pengaruh ph terhadap aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli disajikan pada Gambar 6.

8 35 Aktivitas protease (U/ml) ph Gambar 6. Pengaruh ph terhadap aktivitas enzim Sampel enzim untuk penentuan temperatur dan ph optimum aktivitas protease diperoleh dari hasil kromatografi kolom gel filtrasi matriks Sephadex G100. Aktivitas protease terukur mulai dari temperatur 20 o C sampai 80 o C. Temperatur optimum protease ini adalah 70 o C (Gambar 5), dan stabil selama 30 menit pada 50 o C tetapi aktivitasnya menurun 20% pada inkubasi selama 10 menit dengan temperatur 55 o C. Aktivitas protease dipertahankan pada antara ph 6,0 8,0. Protease aktif pada ph (6,0 10,0), dengan ph optimum 7,0 (Gambar 6). Pengaruh Inhibitor/aktivator Senyawa PMSF merupakan inhibitor spesifik bagi protease serin secara sempurna menghambat aktivitas protease. Aktivitas enzim menurun sebesar 98,2% setelah penambahan inhibitor 0,5 mm PMSF dan aktivitasnya hilang 100% setelah penambahan 1 mm PMSF. Sebaliknya, penambahan inhibitor/aktivator jenis yang lain yaitu EDTA dan phenantrolin spesifik untuk protease metal, pepstatin A spesifik untuk protease asam dan E64 spesifik untuk protease sistein, tidak menghambat aktivitas enzim protease crude ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli. Berdasarkan hasil yang diperoleh, maka enzim crude ekskretori/sekretori digolongkan sebagai enzim protease serin. Persentase aktivitas protease terhadap inhibitor/aktivator disajikan dalam Tabel 4.

9 36 Tabel 4. Pengaruh inhibitor atau aktivator terhadap aktivitas protease Inhibitor/aktivator Konsentrasi akhir Aktivitas (%) Kontrol 100,0 Inhibitor serin: PMSF 0,5 mm 1,8 1 mm 0 Inhibitor metal: EDTA 1 mm 107,1 10 mm 96,7 1,10phenanthroline 1 mm 91,4 Inhibitor aspartat: Pepstatin A 1 µg/ml 109,4 Inhibitor sistein: E64 10 µg/ml 93,1 50 µg/ml 98,2 Visualisasi berat molekul melalui sodium dodecyl sulphate polyacrylamid gel electrophoresis (SDS PAGE) pewarnaan gel dengan coomassie blue tidak menunjukkan pitapita protein. Hasil pewarnaan gel dengan pewarnaan silver menunjukkan bahwa pada crude terdapat 5 pita protein dengan estimasi masingmasing 17, 25, 28, 45 dan 66 kda. Hasil kromatografi anion exchage menunjukkan berat molekul masingmasing protein adalah 17, 28, 45 dan 60 kda. Hasil kromatografi gel filtrasi menunjukkan satu pita protein dengan estimasi berat molekulnya adalah 28 kda (Gambar 7). A kda M B 28 kda Gambar 7. Visualisasi pitapita protein. A = Hasil SDS PAGE. B= interpretasi dari gambar A. M= marker, 1= purifikasi filtrasi gel, 2= purifikasi anion exchange, dan 3 = crude

10 37 PEMBAHASAN Aktivitas protease pada penelitian ini terukur mulai dari temperatur 20 o C sampai 80 o C. Temperatur optimum protease ini adalah 70 o C (Gambar 5), dan stabil selama 30 menit pada 50 o C tetapi aktivitasnya menurun 20% pada inkubasi selama 10 menit dengan temperatur 55 o C. Peranan temperatur pada reaksi enzimatik adalah untuk menjaga agar enzim dapat menjalankan aktivitas katalitik terbaiknya (Palmer 1991). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa aktivitas protease dipertahankan pada ph antara 6,0 8,0. Protease aktif pada ph 6,0 10,0 dengan ph optimum 7,0 (Gambar 6). Nilai ph yang diperoleh dari hasil penelitian ini sesuai dengan laporan Rhoads et al. (1997) pada L 3 L 4 Ascaris suum aktivitas protease pada rentang ph 6,0 8,5, dengan ph optimum 7,0. Berdasarkan ph optimum dan sensitivitas inhibitor protease dengan menggunakan azocasein dan elastinorcein sebagai substrat protein, Cock et al. (1993) mengkarakterisasi protease dari berbagai stadium cacing parasitik pada sapi, yaitu stadium L 3, L 4, dan stadium dewasa O. ostertagi. Aktivitas protease ekskretori/sekretori L 4 O. ostertagi cenderung meningkat pada suasana basa, sedangkan ekstrak tubuh O. ostertagi cenderung meningkat pada suasana asam. Todorova (2000) melaporkan bahwa aktivitas serin, sistein, dan metalloprotease pada larva Trichinella spiralis dapat dikarakterisasi berdasarkan ph optimum pada kisaran 5 7. Inhibitor yang digunakan pada penelitian ini adalah inhibitor protease PMSF 0,5 dan 1 mm, EDTA 1 dan 10 mm, 1,10phenanthroline 1 mm, pepstatin A 1 µg/ml, dan E64 (10 µg/ml dan 50 µg/ml). Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan PMSF menyebabkan penurunan aktivitas enzim yang sangat besar. Seperti yang disajikan pada Tabel 3 terlihat bahwa aktivitas proteolitik sangat dihambat oleh PMSF. Semakin tinggi kadar PMSF semakin besar pula daya hambatnya. Penambahan PMSF 0,5 mm menyebabkan aktivitas yang tersisa tinggal 1,8%, sedangkan pada penambahan PMSF 1 mm tidak ada aktivitas enzim yang tersisa (0%). Penghambatan aktivitas enzim oleh PMSF menunjukkan bahwa enzim yang diekskresi/sekresikan oleh stadium L 3 A. galli diklasifikasikan ke dalam jenis protease serin (Kong et al dan Ford et al. 2005).

11 38 Penambahan inhibitor EDTA 1 dan 10 mm, 1,10phenanthroline 1 mm, pepstatin A 1 µg/ml, dan E64 (10 µg/ml dan 50 µg/ml) tidak terlalu berpengaruh terhadap aktivitas proteolitik (Tabel 3). EDTA dan 1,10 phenanthroline adalah inhibitor spesifik terhadap enzim metalloprotease, sedangkan pepstatin A adalah inhibitor spesifik untuk enzim aspartil protease sehingga inhibitor tersebut tidak mampu menghambat aktivitas enzim proteolitik jenis serin (Cock et al. 1993). Suhartono (1989) menyatakan bahwa senyawa inhibitor adalah senyawa yang dapat mengubah kemampuan enzim dalam mengikat substrat sehingga menyebabkan perubahan daya katalisator enzim. Perubahan ini disebabkan oleh struktur enzim yang mengalami perubahan fisik kimiawi sedemikian rupa sehingga aktivitas hayatinya menjadi berubah. Menurut Palmer (1991) protease serin memiliki sisi katalitik yang terdiri dari asam amino serin, histidin, dan aspartat. Inhibitor PMSF akan bereaksi dengan gugus OH dari serin yang menyebabkan terjadinya efek penghambatan yang irreversible. Adanya penghambatan aktivitas enzim oleh PMSF menunjukkan bahwa enzim proteolitik ini termasuk dalam kelompok protease serin. Pada penelitian ini, berat molekul protien divisualisasikan dengan elektroforesis. SDS PAGE merupakan teknik elektroforesis yang paling banyak digunakan untuk analisis campuran protein. Pada mekanisme SDS PAGE, protein bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks yang bermuatan negatif. Protein akan terdenaturasi dan terlarut membentuk kompleks berikatan dengan SDS, berbentuk elips atau batang, dan berukuran sebanding dengan berat molekul protein. Protein dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif ini terpisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel poliakrilamid. Berat molekul protein dapat diukur dengan menggunakan protein standar yang telah diketahui berat molekulnya. Hasil pengukuran berat molekul protease serin yang diperoleh melalui visualisasi SDS PAGE pada penelitian ini adalah 28 kda (Gambar 7). Peneliti terdahulu menyatakan bahwa berat molekul protease yang dilepaskan cacing nematoda berbedabeda tergantung pada jenis dan stadium kehidupannya. Berat molekul aminopeptidase adalah 293 kda (Rhoads et al. 1997), hyaluronidase adalah 47,8 dan 55,0 kda dilepaskan L 3 L 4 A. suum (Rhoads et al. 2001). Hadas dan

12 39 Stankiewicz (1997) melaporkan bahwa aktivitas protease pada L 3 Haemonchus contortus dan Trichostrongylus colubriformis dengan berat molekul 32,6 53 kda, dan dua pita protein dalam batasan kda. Beberapa enzim yang bercirikan protease berukuran kda diidentifikasi oleh Todorova (2000) pada larva T. spiralis. Enzim proteolitik (protease) sudah banyak dikarakterisasi pada berbagai jenis dan spesifisitas stadium cacing. Secara in vitro, cacing nematoda yang melepaskan protease diantaranya adalah Ostertagia ostertagi pada sapi (Cock et al. 1993), Strongyloides spp., Ancylostoma spp., Onchocerca spp., Toxocara canis pada anjing dan Ascaris suum pada babi (Rhoads et al. 1997). Nematoda penting pada ruminansia, seperti O. circumcincta, Haemonchus contortus, dan Trichostrongylus spp. juga mensekresikan protease secara in vitro. Berdasarkan pengetahuan reaksi katalis dan hidrolisa substrat, protease diketahui terlibat dalam nutrisi parasit, metabolisme, penetrasi barrier jaringan inang, dan pengaturan respons imun inang terhadap parasit. Karakterisasi protease serin inhibitor dari nematoda parasitik pada manusia, stadium L 3 O. volvulus, dibuktikan oleh Ford et al. (2005) bahwa protease serin inhibitor tersebut berperan multifungsi di dalam perlindungan parasit terhadap protease intestinal inang definitif dan pengembangan parasit, termasuk molting, establishment, embriogenesis, dan reproduksi. Protease serin inhibitor dari O. volvulus bersifat imunogenik, diketahui terlibat di dalam pengaturan respons imun, dan dianggap sebagai salah satu kandidat vaksin terhadap O. volvulus. Pada Paragonimus westermani paling tidak terdapat 6 jenis protease sistein dengan ukuran 53, 34, 28, 27, 17, dan 15 kda yang telah dikarakterisasi dari telur, metacercariae, cacing muda, dan dewasa. Molekul 28 dan 27 kda dilepaskan oleh metacercariae yang memiliki ciri biokimia yang sama seperti cathepsin L pada F. hepatica. Enzim tersebut diyakini berperan penting dalam proses excystment metacercaria, migrasi ke jaringan, dan pengaturan dari mekanisme respons imunitas inang. Yun et al. (2000) berhasil mengkarakterisasi protease sistein dengan berat molekul 28 kda dari P. westermani. Ekspresi molekul 28 kda secara spesifik diobservasi pada cacing muda dan dewasa yang berlokasi di dalam epitel intestinal yang mengindikasikan molekul tersebut terlibat pada proses nutrisi dan modulasi imun.

13 40 Menurut Berasain et al. (1997) pelepasan protease serin oleh cacing trematoda Fasciola hepatica ditujukan untuk mendegradasi matriks ekstraselular dan komponen membran dasar agar parasit berhasil menginvasi ke jaringan. Pelepasan protease serin oleh L 3 A. galli mungkin berkaitan dengan proses invasi larva ke jaringan untuk menjalani fase histotrofik, dimana stadium L 3 A. galli melangsungkan fase histotrofik harus menembus pertahanan selaput lendir untuk establish pada jaringan mukosa saluran cerna inang definitif. Durasi fase histotrofik yang dibutuhkan larva A. galli adalah 3 54 hari pascainfeksi (Permin dan Hansen 1998). KESIMPULAN Dari hasil penelitian dapat disimpulkan: 1. Ekskretori/sekretori yang dilepaskan L 3 A. galli mengandung enzim proteolitik dengan ph dan temperatur optimum pada 7 dan 70 o C. 2. Aktivitas enzim dihambat oleh PMSF 0,5 mm sehingga digolongkan sebagai protease serin. 3. Protease serin yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori stadium L 3 A. galli mempunyai berat molekul 28 kda. Saran Dari hasil penelitian ini dapat disarankan bahwa perlu dilakukan penelitian selanjutnya untuk mengetahui kemungkinan protease serin yang dilepaskan oleh L 3 A. galli sebagai pemicu respons pertahanan mukosa usus halus ayam petelur.