II. MATERI DAN METODE PENELITIAN. 1. Materi Penelitian, Lokasi dan Waktu Penelitian

Transkripsi

1 5 II. MATERI DAN METODE PENELITIAN 1. Materi Penelitian, Lokasi dan Waktu Penelitian 1.1. Materi Penelitian Alat Alat yang digunakan adalah akuarium berukuran 40 X 60 X 60 cm 3 dan ketinggian air adalah 40 cm, aerator, heater, timbangan dengan ketelitian 0,1 g, ember, seser, baki, alat bedah, homogeniser listrik, sentrifugator, spektrofotometer, botol film,tabung reaksi, tabung eppendorf, rak tabung, lemari pendingin, inkubator, pipet tetes, micro pipette dan pipette tip Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V.) ukuran ±30 gram, pellet dengan kandungan protein 25% (Merk dagang TAKARI ), larutan kasein 1% dalam air, akuades, 50 mm Tris-HCl buffer (ph 7,2-8,0), larutan protein standar (0,05 mg/ml 1,0 mg/ml kasein), pereaksi A (2 % Na2CO₃ dalam 0,1 M NaOH), pereaksi B (0,5 % CuSO ₄. 5H₂O dalam 1 % Na-K tartat), pereaksi C (campuran 50 ml pereaksi A dengan 1 ml pereaksi B), pereaksi D (larutan 1 N pereaksi Folon Ciocalteu), larutan 0,05 M Na₂HPO₄ buffer (ph 8,0 9,0), larutan 1 % (w/v) kasein, larutan 8 % (w/v) trichloroacetic acid (TCA), larutan tyrosine standard (10 μg/ml 250 μg/ml), larutan pati 1% dalam 20 mm natrium fosfat buffer ph 6,9, mengandung 6,0 mm NaCl sebagai substrat, dan sampel enzim (0,5 ml) dan 0,5 ml dinitrosalicylic acid (DNS).

2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas Biologi Unsoed.Uji aktivitas protease dan amilase dilakukan di laboratorium Riset Unsoed. Penelitian dilaksanakan selama 6 bulan dari bulan Juni 2013 hingga Januari Teknik Pengambilan Sampel 2.1. Pengambilan Sampel Metode yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode survey. Dengan menggunakan Teknik Pengambilan Sampel. Ikan nilem dikelompokan kedalam empat kelompok yaitu kelompok 1 pada jam 06:00 WIB (P1); kelompok 2 pada jam 12:00 WIB (P2); kelompok 3 pada jam 18:00 WIB (P3); dan kelompok 4 pada jam 24:00 WIB (P4 ). Pengambilan intestin dilakukan sebanyak 4 kali dengan selang waktu 6 jam sekali Variabel yang diamati Variabel yang diamati, terdiri dari variabel bergantung yaitu waktu pembedahan untuk mengisolasi organ pencernaan dan variabel bebas yaitu perubahan aktivitas enzim digesti protease dan amilase padaikan Nilem (O. hasselti C.V.) dalam kurun waktu 24 jam. Parameter yang diukur adalah banyaknya mikrogram maltosa dan tirosin yang dihasilkan per menit, parameter pendukungnya adalah kadar protein ikan nilem.

3 Cara kerja Cara Kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut Persiapan Akuarium Akuarium yang digunakan dalam penelitian adalah akuarium fiber berukuran 40 x 60 x 60 cm³ yang di isi air tawar sebanyak 100 liter, dilengkapi dengan heater 28 0 C sistem air dan diaerasi Pengadaan Ikan Uji Ikan uji untuk percobaan ini diperoleh dari mitra kerja yaitu Mina Artha, Sumbang, Banyumas dengan bobot sebesar ±30 g/ekor. Sebelum digunakan untuk percobaan ikan terlebih dahulu diaklimasi selama 14 haridi Laboratorium Fisiologi Hewan untuk penyesuaian terhadap kondisi laboratorium dan kualitas pakan uji. Selama aklimasi ikan Nilem diberi pakan buatan (pe let) dengan kandungan protein 25% dan dilakukan pengaturan media pemeliharaan untuk mendukung kebutuhan hidup ikan Penebaran dan Pemberian Pakan Ikan Uji Ikan Nilem (O. hasselti C.V.) ditebar ke dalam akuarium dengan padat penebaran sebanyak 10 ekor tiap akuarium yang terlebih dahulu diukur berat dan panjangnya. Ikan Nilem diberi pakan sebesar 3% dari dari berat biomasa ikan dan diberikan sebanyak dua kali yaitu pada pagi ( WIB) dan sore hari ( WIB). Pengambilan sisa pakan dilakukan pada keesokan harinya dan sisa pakan diambil dengan cara penyiponan.

4 Pembedahan ikan Empat kelompok ikan yaitu kelompok jam 06:00; 12:00; 18:00; dan 24:00 dibedah masing-masing pada jam yang telah ditentukan mulai dari lubang anus sepanjang garis medio-ventral tubuh ke arah depan sampai dekat sirip dada. Pengguntingan dilakukan secara hati-hati agar organ yang terletak di sebelah dalam tidak ikut tergunting, kemudian daging bagian atas dibuka dengan pinset,ambil bagian viscera ikan, lalu saluran pencernaan ikan diisolasi, setelah saluran pencernaan diperoleh lalu dimasukan kedalam botol film Preparasi homogenate intestine (Natalia et al., 2004) Saluran pencernaan ikan yang telah diisolasi lalu dibersihkan diatas lempengan es, kemudian intestin ikan dilumatkan atau dihancurkan menggunakan homogeniser listrik dalam 50 mm Tris-buffer (ph 7,2-8,0) dingin dengan rasio 1 : 4 (w/v), homogenat yang diperoleh kemudian disentrifugasi menggunakan sentrifuse elektrik bersuhu -4 C pada kecepatan ( rpm selama 10 menit atau rpm selama 20menit) fraksi lipid yang mengambang dikeluarkan dan cairan supernatan ditampung untuk digunakan uji aktivitas enzim (Natalia et al., 2004). Kadar protein supernatan ditentukan dengan metode Lowry et al., (1951 dalamfurne et al., 2005).Larutan ekstrak enzim harus disimpan pada suhu dibawah 0 C atau dalam lemari es Penentuan kadar protein supernatan dengan metode Lowry(Furne et al., 2005) Disiapkan 5 buah tabung reaksi untuk larutan protein standar (kasein).masing-masing tabung diisi 0,5 ml larutan standar dengan

5 9 konsentrasi berurut-urut 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,50 mg/ml, dan 1,0 mg/ml. Disiapkan 1 tabung untuk larutan sampel, ke dalam tabung sampel dimasukkan 0,5 ml larutan sampel (ekstrak vicera) yang kadarnya kira-kira di bawah 0,25 mg/ml. Kesemua tabung (5 tabung standar dan semua tabung sampel) ditambah 5 ml pereaksi C, kocok dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah 10 menit ditambahkan 0,5 ml pereaksi D, kocok segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit. Diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm, dicatat hasilnya dan dibuat kurva standarnya. Kadar protein sampel ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar Pengukuran Aktivitas Protease Digesti menggunakan Metode Hidrolisis Kasein (Hidalgo et al., 1999) Disiapkan 7 buah tabung reaksi, masing-masing tabung diberi label. Satu buah tabung untuk sampel, satu buah tabung untuk kontrol, satu buah tabung untuk blanko dan 4 buah tabung keempat untuk standar dengan konsentrasi (larutan 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml dan 0,25 mg/ml) larutan tirosin 1%. Masukkan ke dalam tabung sampel 0,35 ml larutan kasein 1%, 0,30 ml larutan buffer dan 0,10 ml larutan ekstrak kasar enzim. Diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 C, dan dihentikan reaksi dengan menambahkan 0,75 ml larutan tricholoacetic acid (TCA) 8%. Tabung kontrol diisi larutan buffer sebanyak 0,30 ml, 0,10 ml akuades dan tambahkan 0,75 ml TCA 8%, inkubasi selama 60 menit pada suhu 37 C. Setelah inkubasi tambahkan larutan kasein sebanyak 0,35 ml. Tabung blanko diisi dengan 0,30 ml buffer, 0,45 ml akuades, selanjutnya

6 10 diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 C. setelah inkubasi ditambahkan dengan 0,75 ml TCA. Tabung standar diisi dengan 0,35 ml larutan tirosin standar, lalu ditambahkan 0,30 ml buffer, 0,10 ml akuades, dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 C. Semua tabung dimasukkan kedalam refrigerator selama 1 jam, campuran reaksi disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 280 nm. Hasilnya dicatat dan dibuat kurva standarnya. Aktivitas enzim ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar Pengukuran Aktivitas Amilase dengan metode Somogy-Nelson (Hidalgo et al., 1999) Disiapkan 7 buah tabung reaksi, masing-masing tabung diberi label. Satu buah tabung untuk sampel, satu buah tabung untuk kontrol, satu buah tabung untuk blanko dan 4 buah tabung untuk standar dengan konsentrasi (larutan 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,10 mg/ml dan 0,25 mg/ml) larutan maltosa 1%. Masing-masing tabung standar diisi dengan 0,70 ml larutan maltosa standar 1%, kemudian ditambah 0,10 ml akuades. Ke dalam tabung sampel diisi 0,70 ml amilum 1% dan ekstrak kasar enzim 0,10 ml, ke dalam tabung blanko diisikan 0,80 ml akuades, tabung kontrol diisi dengan 0,10 ml akuades dan ditambahkan 0,70 ml dinitrosalicylic acid (DNS). Masing-masing tabung (standar, sampel, kontrol dan blanko) diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Setelah inkubasi ditambahkan 0,70 ml dinitrosalicylic acid (DNS) 2% ke dalam masingmasing tabung, kecuali pada tabung kontrol ditambahkan 0,70 ml amilum

7 11 1%. Semua tabung dimasukkan ke dalam air mendidih selama 5 menit, setelah dingin campuran disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Ukur absorbansin aktivitas amilase pada panjang gelombang 540 nm, hasilnya dicatat dan dibuat kurva standarnya. Aktivitas enzim ditentukan dengan cara memplotkan angka absorbansi sampel ke dalam kurva standar.

8 12 3. Metode Analisis Metode analisis yang dilakukan untuk mengetahui aktivitas protease dan amilase adalahdenganone way analysis of variance (ANOVA) menggunakan SPSS versi Windows software. Aktivitas protease dan amylase tidak menunjukkan adanya beda nyata oleh karena itu tidak dilanjutkan uji BNT.