III. METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2006 hingga Agustus Penangkapan polen dilakukan di kecamatan Pasar Minggu Jakarta Selatan dan analisa selanjutnya dilakukan di Laboratorium Biologi Tumbuhan, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB Metode Penelitian Penangkapan Polen Penangkapan polen dilakukan dengan menggunakan alat penangkap polen yang dibuat dengan menempelkan double tip pada salah satu sisi kaca objek. Alat ini kemudian dipasang di sekitar tanaman yang sedang berbunga di kebun binatang Ragunan dan di pemukiman penduduk yang menjadi pasien puskesmas kecamatan Pasar Minggu. Penangkapan polen di udara ini dilakukan untuk mengetahui jenis polen yang beterbangan di udara bebas Pasar Minggu Jakarta Selatan Identifikasi Polen pada Alat Penangkap Polen Polen yang tertangkap diamati menggunakan mikroskop cahaya tanpa memberikan pewarna atau media tertentu terlebih dahulu pada polen. Pengamatan dilakukan dengan membandingkan polen yang tertangkap dengan polen kontrol dari tumbuhan segar. Polen yang berhasil tertangkap oleh alat penangkap polen kemudian ditetapkan sebagai polen yang digunakan untuk analisis selanjutnya Pengumpulan Polen Jenis polen yang tertangkap di atas dikumpulkan berdasarkan metode Chew et al. (2006). Semua jenis polen dikumpulkan langsung dari bunganya sekitar pukul wib. Polen jagung, pinus, dan kelapa genjah sawit diambil dari infloresen antesis dan diayak pada saringan bertingkat sehingga polen terpisah dari bagian-bagian bunga lainnya. Polen kelapa genjah diambil berdasarkan

2 18 modifikasi dari Santos et al. (1995). Polen kelapa genjah dikumpulkan dari infloresen antesis. Infloresen tersebut kemudian dikeringanginkan pada suhu 19 C selama 2 hari. Selanjutnya polen dikumpulkan dengan mengayak bunga di atas saringan bertingkat sehingga polen terpisah dari bagian-bagian bunga lainnya. Polen yang telah dikumpulkan disimpan dalam kotak berisi silika gel pada suhu 20 C hingga pemakaian selanjutnya Pengekstrakan Polen Polen dimasukkan dalam tabung reaksi ml dan sebagian mulut tabung ditutup dengan alumunium foil. Selanjutnya ke dalam tabung tersebut dituangkan nitrogen cair dan secepatnya mulut tabung yang masih terbuka ditutup dengan alumunium foil. Penggunaan tabung reaksi dan alumunium foil tersebut untuk mencegah polen beterbangan. Polen kemudian dipindahkan ke dalam mortar dan ditumbuk hingga homogen. Setelah homogen, polen ditimbang sebanyak 1 gram, kemudian dilarutkan ke dalam 10 ml PBS. Campuran tersebut kemudian dikocok selama 3 jam pada suhu 4 C dan selanjutnya disentrifugasi pada perangkat sentrifuse Himac CF 15D2 Hitachi dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan disterilkan dengan menyaringnya melalui filter 0,22 m, kemudian disimpan pada suhu -20 C Analisis Kadar Protein dan Penentuan Berat Molekul Protein Kadar protein diukur dengan menggunakan metode Bradford (1976). Standar protein yang digunakan adalah BSA dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, dan 500 ppm. Volume pereaksi Bradford yang ditambahkan adalah 2,5 ml. Kadar protein diukur absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm. Berat molekul protein ditentukan dengan metode SDS-PAGE (modifikasi Laemmli 1970) dengan standar protein BM rendah berasal dari Amersham Bioscience, 10% gel pemisah, dan 4% gel penahan. Gel di-running dalam 600 ml buffer elektroforesis ph 8,3 yang mengandung 192 mm glisin; 0,1% SDS; 24,8 mm Tribase (Trishidroksiaminometan). Sebelum dimasukkan ke dalam sumur, sampel dan marker ditambah dengan buffer sampel dengan rasio 4:1 dan

3 19 kemudian diinkubasi dalam air mendidih selama 1 menit. Buffer sampel mengandung 1 gram SDS; 2 ml gliserol 50%; 2 ml bromofenol biru 0,1%; dan 1,25 ml TrisCl 1 M ph 6,8 yang dilarutkan dalam akuades hingga 10 ml. Volume marker dan sampel yang dimasukkan dalam sumur adalah 20 l. Kondisi elektroforesis adalah 100mA, 100 volt selama 1 jam. Deteksi pita menggunakan CBB selama 1 jam yang dilakukan dalam penangas. Pewarna tersebut dibuat dengan melarutkan 40% metanol; 10% asam asetat; dan 0,1% CBB R-250 ke dalam 100 ml akuades. Larutan peluntur mengandung 40% metanol dan 10% asam asetat. Pelunturan dilakukan selama 2 jam dan kemudian dibilas dengan akuades Uji Alergenisitas Polen pada Tikus wistar Alur kerja pengujian alergenisitas polen pada tikus wistar dapat dilihat pada Tabel 1 dan penjelasan lengkapnya pada langkah hingga Tabel 1 Alur kerja pengujian alergenisitas polen pada tikus wistar Hari ke- -5 hingga -1 (Pengadaptasian) Perlakuan kontrol - kontrol + polen 0 (Pengenalan alergen I) Penyuntikan PBS Penyuntikan Hist Penyuntikan EP 7 (Pengenalan alergen II) Penyuntikan PBS Penyuntikan Hist Penyuntikan EP (Pemaparan alergen ke SP I) Penetesan PBS ke SP Penetesan Hist ke SP Penetesan EP ke SP 23 (Pemaparan alergen ke SP II) Penetesan PBS ke SP Penetesan Hist ke SP Penetesan EP ke SP PBS : Phosphate Buffer Saline, Hist : Histamin, EP : ekstrak polen; SP: Saluran pernapasan Penyiapan dan Pengadaptasian Binatang Uji Binatang uji yang digunakan adalah tikus wistar jantan berumur minggu berjumlah 18 ekor. Kontrol negatif dan positif masing-masing menggunakan 3 ekor tikus dan 12 ekor tikus dipergunakan untuk perlakuan 4 jenis

4 20 polen yang berbeda. Tikus diadaptasi selama 5 hari, dan selama adaptasi tikus ditimbang. Tikus dipelihara dalam kandang konvensional (modifikasi dari Arts et al. 1996) Pengenalan Alergen pada Tikus Pada hari ke-0 dan ke-7, tikus yang telah diadaptasi disuntik dengan 150 l larutan PBS (tikus kontol negatif), histamin (tikus kontrol positif), dan ekstrak polen (tikus perlakuan polen). Penyuntikan dilakukan pada bagian subkutan telapak kaki kanan belakang (modifikasi Arts et al. 1998), bertujuan untuk mengenalkan alergen pada tikus wistar. Satu jam setelah penyuntikan, inflamasi yang terbentuk diamati dengan membandingkan respon pembengkakan yang terjadi pada kaki yang disuntik dengan ekstrak polen terhadap kaki yang disuntik dengan PBS dan histamin Pemaparan Alergen pada Saluran Pernapasan Tikus Pada hari ke-21 dan ke-23, saluran pernapasan masing-masing tikus ditetesi 300 l larutan yang sama dengan pada saat pengenalan alergen (modifikasi Arts et al. 1998) Berat Badan, Organ, serta Histopatologi Laring dan Paru-paru Tikus Perubahan berat badan tikus selama perlakuan diketahui dengan menimbangnya pada hari ke- 0, 7, 14, 21, dan 23. dilakukan satu jam setelah pemaparan alergen pada hari ke-23. Tikus dibius dengan eter kemudian dibedah dan diambil paru-paru dengan laring dan trakeanya. Organ ini kemudian masing-masing ditimbang untuk mengetahui pembengkakan yang terjadi akibat reaksi inflamasi pada saluran pernapasan.organ tersebut kemudian secepatnya difiksasi dalam larutan asam pikrat:formalin:asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1 selama 24 jam. Dehidrasi dilakukan dengan alkohol 70% selama 1 jam kemudian disimpan dalam alkohol 80% hingga pengamatan selanjutnya.

5 21 Histopatologi laring dan paru-paru tikus dilakukan dengan membenamkan organ tersebut ke dalam parafin dan diiris. Hasil irisan (dengan ketebalan 5 m) kemudian diwarnai dengan hematosilin dan eosin. Pengamatan jaringan dilakukan di bawah mikroskop cahaya. Pengamatan ditujukan terhadap sekresi mukus, pembengkakan membran mukosa, dan erupsi sel-sel leukosit.