Isolasi bakteri kitinolitik dari Sumber Air Panas. Penentuan Isolat Terpilih

Transkripsi

1 Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian Isolasi bakteri kitinolitik dari Sumber Air Panas Pengukuran Indeks kitinolitik Penentuan Isolat Terpilih Penentuan Waktu Produksi Enzim Kitinase Sampai hari ke-8 Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase dan Perhitungan Kadar Protein pada Produksi Enzim Kitinase Hari ke-4 Presipitasi Enzim Kitinase pada Beberapa Konsentrasi Amonium Sulfat Presipitasi Enzim Kitinase pada Konsentrasi 50% Amonium Sulfat (Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase dan Perhitungan Kadar Protein) Dialisis Penentuan suhu dan ph optimum Penentuan nilai K m dan V maks Identifikasi Isolat Terpilih berdasarkan Gen Penyandi 16S rrna

2 Absorbansi Lampiran 2. Kurva Standard N-Acetyl-D-Glukosamin (GlcNAc) GLcNAc Absorbansi (µgram) 0 0, , , , ,3650 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = -0,007x + 0,6539 R² = 0, konsentrasi GlCNAc

3 Absorbansi Lampiran 3. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA) BSA (µgram) Abs terkoreksi ,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 y = 0,0044x + 0,0266 R² = 0, Konsentrasi BSA

4 Lampiran 4. Pembuatan Larutan Schales Potasium Ferisianida 0,25 g Na 2 CO 3 26,4975 g Dilarutkan dalam 500 ml akuades Distirer Dituang ke dalam botol kaca Disimpan dalam kulkas

5 Lampiran 5. Uji Aktivitas Kitinase Modifikasi Spindler (1997) Substrat Sampel Kontrol Koloidal Kitin 0,3 % 300 μl 300 μl Penyangga fosfat μl 200 μl mm Enzim 100 μl 0 μl Diinkubasi pada suhu 37 ᴼC selama 30 menit Keterangan Enzim yang setelah dipanaskan selama 10 menit Kontrol 100 μl Dididihkan 10 menit Disentrifuge rpm selama 5 menit Substrat Sampel Kontrol Blanko Campuran enzim diambil 300 μl 300 μl - Akuades 700 μl 700 μl 1000 μl Schales 1000 μl 1000 μl 1000 μl Vortex Dididihkan pada suhu 100 ᴼC selama 10 menit Didinginkan Diukur λ = 420 nm Hasil

6 Rumus : Aktivitas enzim = ((konsentrasi sampel konsentrasi blanko) (Konsentrasi kontrol konsentrasi blanko)) X 600 : Enzim Akhir X 1000 : Enzim awal X 1 : menit X 1 : BM kitinase. Total aktivitas enzim : aktivitas enzim (Unit/mL) x volume enzim (ml) Total protein : protein (mg/ml) x volume enzim (ml) Aktivitas spesifik Unit/mg = Total aktivitas enzim (Unit/mL) Total protein (mg/ml) Hasil % = Total aktivitas n X 100 Total aktivitas 0 Tingkat kemurnian (kali) = Aktivitas spesifik n Aktivitas spesifik 0

7 Lampiran 6. Metode Penentuan Kadar Protein (Bradford, 1976). Pereaksi Blanko (ml) Sampel (ml) Akuades 0,5 0 Enzim 0 0,5 Reagen Bradford 0,75 0,75 Divorteks Campuran diukur pada λ 595 nm

8 Lampiran 7. Komposisi Reagen Bradfrod & Pembuatan Ragen Bradford A. Larutan Stock Bradford Comassie Blue G-250 Etanol 95% H 3 Po 4 88% 70 mg 20 ml 40 ml Distirer Disaring dengan kertas saring B. Pembuatan Reagen Bradford 425 ml akuades 15 ml 95% Etanol 35 ml 88% fosfat 30 ml larutan Stock Distirer Disaring dengan kertas saring Dimasukkan dalam Botol Kaca Disimpan dalam kulkas

9 1/ V Lampiran 8. Perhitungan Parameter K m dan V maks 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 y = 0,0045x + 0,014 R² = 0, /s PERSAMAAN LINEAWER-BURK= X /V maks = V maks = K m /V maks = K m = kemiringan= /<s>= 0, 1/v 0, /K m = 3.1 (-)1/K m, 1/v=0 (-)0.321,0

10 Lampiran 9. Data Hasil Sequencing Identifikasi Isolat JP2 dengan Menggunakan Gen Penyandi 16S rrna GGGGGCAAGGGGCTGCTCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG TAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATG CTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTTCA AGATGGACCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCG ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTC TGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTT GTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAA GCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGA TGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAG TGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGC GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG ATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTA AGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACC TTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGG GCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCA CTCTAAGGTGACTGCCCGGTGACAAACCCGAAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAA ATCATCATGGCCCCTTATGACCTGGGGCTACCCACCGGGTACAATGGGCAGAAC AAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTC GGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAT CAGCATGCGGGGGGGGGT