V. ANALISIS PROLIFERASI SEL SPERMATOGONIA IKAN GURAMI PADA GONAD IKAN NILA

Transkripsi

1 V. ANALISIS PROLIFERASI SEL SPERMATOGONIA IKAN GURAMI PADA GONAD IKAN NILA ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis kemampuan proliferasi sel spermatogonia ikan gurami yang terkolonisasi pada gonad ikan nila. Analisis proliferasi dilakukan menggunakan pendekatan molekular. Penelitian ini terdiri atas 5 tahap, yaitu 1) transplantasi sel testikular ikan gurami secara intraperitoneal ke larva ikan nila umur 3 hari pascamenetas (hpm), 2) isolasi DNA larva ikan nila 24 jam pascatransplantasi (pt), dan gonad dari ikan nila resipien yang terdeteksi membawa sel donor berlabel PKH 26 pada umur 1,2, 3 bulan pt, 3) amplifikasi PCR cetakan DNA dengan primer spesifik gen hormon pertumbuhan ikan gurami, 4) pembuatan kurva standar DNA produk PCR dari supensi campuran sel testikular ikan gurami dan ikan nila pada berbagai rasio, dan 5) kuantifikasi pita DNA hasil elektroforesis menggunakan program unscan IT gel 6.1. Parameter yang diamati adalah konsentrasi DNA produk PCR ikan gurami pada resipien nila umur 24 jam serta 1, 2, dan 3 bulan pt. Hasil penelitian menunjukkan telah terjadi peningkatan konsentrasi DNA dan estimasi jumlah sel donor secara nyata (P<0,05) dari resipien yang berumur 1 bulan pt ke resipien umur 2 bulan pt atau 3 bulan pt dengan persentase peningkatan 3,42 kali, sedangkan dari umur 2 bulan pt ke 3 bulan pt tidak berbeda nyata (P>0,05). Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa sel donor spermatogonia ikan gurami yang ditransplantasikan mampu berproliferasi pada gonad ikan nila resipien. Kata kunci : spermatogonia, proliferasi, hormon pertumbuhan, konsentrasi DNA, jumlah sel.

2 60 V. THE PROLIFERATION ANALYSIS OF GIANT GOURAMI SPERMATOGONIA IN NILE TILAPIA GONAD ABSTRACT The research was conducted to analyze the proliferation of giant gourami spermatogonia as donor cells that had been colonized in Nile tilapia as recipient. The analysis were done using molecular approach. The research comprised of 5 stages, those are, 1) the intraperioneally transplantation of giant gourami testicular germ cell into 3 dph tilapia larvae, 2) the DNA isolation of 24 hours post transplantation (pt) larvae and positive colonized gonads of 1, 2, and 3 months pt recipient, 3) the amplification of DNA with PCR using giant gourami growth hormone gene as specific primer, 4) the determination of standard curve of DNA PCR product upon some ratios of mix number of giant gourami and Nile tilapia testicular germ cell to estimate the number of cell colonized in recipient gonad, and 5) the quantification of DNA band in electrophoresis gel using unscan IT gel 6.1 software. Parameter observed was the DNA concentration of 24 hours, 1 month pt, 2 month pt and 3 month pt recipient. The result showed that the DNA concentration and the amount of colonized cells increased 3.42 times significantly from 1 month pt recipient to 2 or 3 month pt recipient (P<0.05), meanwhile, there were no significant different concentration of DNA and amount of cells from 2 month pt recipient to 3 month pt recipient (P>0.05). In conclusion, the transplanted giant gourami spermatogonial cells could proliferated in tilapia gonad. keywords : spermatogonia, proliferation, growth hormone, DNA concentration, number of cell. PENDAHULUAN Gametogenesis adalah serangkaian proses transformasi sel-sel germinal menjadi sel yang terspesialisasi, yaitu sel telur pada betina (oogenesis) dan spermatozoa pada jantan (spermatogenesis). Selama proses gametogenesis, sel bakal gonad akan melewati tiga tahap, yaitu tahap proliferasi, tahap meiosis dan tahap spermiogenik (Jiang & Short 1998, Nakamura et al. 1998). Selama tahap proliferasi, sel bakal gonad atau dikenal sebagai primordial germ cell (PGC) akan melakukan perbanyakan diri (self renewal) secara mitotik untuk mempertahankan jumlah sel punca dan juga untuk memproduksi spermatogonia terdiferensiasi yaitu spermatogonia B (SpB). Selanjutnya terjadi proliferasi secara aktif sehingga jumlah sel meningkat dengan pesat. Peningkatan jumlah sel oleh proliferasi

3 61 mitosis tersebut merupakan indikasi terjadinya spermatogenesis. Sel SpB yang terbentuk selanjutnya berdiferensiasi dengan pembelahan meiosis menjadi spermatosit primer hingga ke tahap perkembangan berikutnya yaitu spermatid. Spermatid selanjutnya akan mengalami tahap spermiogenik hingga akhirnya membentuk spermatozoa (Jiang & Short 1998, Hess & Franca 2007). Pada bab IV telah dibuktikan bahwa sel germinal spermatogonia ikan gurami mampu berkoloni dengan sel-sel testikular pada gonad ikan nila. Hal ini mengindikasikan bahwa sel donor ikan gurami dapat hidup pada gonad ikan nila tanpa penolakan sistem imun dari ikan nila seperti yang terjadi pada umumnya dalam xenotransplantasi. Hasil ini merupakan awal dari keberhasilan teknologi xanotransplantasi sel germinal jantan ikan gurami pada ikan nila. Namun demikian, untuk mendapatkan sel gamet ikan gurami dari ikan nila sebagai induk pengganti maka sel donor yang telah terkolonisasi harus mampu bergametogenesis. Dari pengamatan sel donor yang telah dilabel PKH 26 pada gonad resipien (bab IV) diduga adanya indikasi sel spermatogonia yang terkolonisasi mengalami proliferasi pada resipien berdasarkan adanya kumpulan-kumpulan sel yang terlabel PKH 26 pada resipien yang berumur lebih dari 2 bulan. Di samping itu, berdasarkan pengamatan gonad resipien di bawah mikroskop fluoresens ditemukan pula perbedaan intensitas warna PKH 26 dari resipien umur 2 bulan pascatransplantasi (pt) ke resipien umur 3 bulan pt. Untuk membuktikan indikasi proliferasi sel donor ikan gurami pada resipien ikan nila maka pada penelitian ini dilakukan analisis proliferasi sel spermatogonia ikan gurami pada gonad ikan nila. Berbagai macam cara digunakan oleh para peneliti untuk menganalisis proliferasi sel. Proliferasi sel dapat dianalisis secara tidak langsung dengan parameter yang diamati adalah aktivitas senyawa tertentu yang berperan dalam proses pembelahan sel tersebut. Cara ini dapat ditempuh dengan teknik ELISA, western blots atau imunohistokimia. Parameter lain adalah dengan mengukur peningkatan jumlah sintesis DNA sebagai tanda terjadinya proses replikasi. Untuk tujuan tersebut, maka pada DNA biasanya dilakukan pelabelan (Roche 2003). Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah peningkatan jumlah sel

4 62 donor pada resipien umur 1, 2 dan 3 bulan pt. Teknik yang digunakan untuk mengestimasi terjadinya peningkatan jumlah sel donor adalah teknik polymerase chain reaction (PCR) dengan marka molekuler gen growth hormone (GH) ikan gurami. Dengan marka molekuler gen GH ikan gurami, sel donor ikan gurami pada gonad resipien ikan nila dapat diidentifikasi. Ketebalan pita pada gel elektroforesis menunjukkan besarnya konsentrasi DNA donor pada gonad resipien. Peningkatan tebal pita DNA pada gel elektroforesis hasil PCR gonad ikan nila umur 1 bulan, 2 bulan dan 3 bulan pt diharapkan dapat menunjukkan terjadinya proliferasi sel donor ikan gurami pada resipien ikan nila. BAHAN DAN METODE Transplantasi Sel Testikular Ikan Gurami ke Larva Ikan Nila Transplantasi sel testikular ikan gurami ke larva ikan nila dilakukan mengikuti prosedur yang telah dijelaskan pada bab IV. Testis ikan gurami dengan kisaran bobot tubuh sekitar g didisosiasi untuk mendapatkan suspensi sel donor. Sebelum disuntikkan, suspensi sel dihitung untuk menentukan volume label PKH 26 yang dibutuhkan untuk mewarnai sel donor dan untuk mengetahui jumlah sel spermatogonia (diameter 15 µm) yang berpeluang terkolonisasi. Jumlah sel dihitung menggunakan hemositometer di bawah mikroskop CX10 (Olympus). Pelabelan sel testikular ikan gurami dengan PKH 26 fluorescent membrane dye dilakukan berdasarkan protokol yang telah disajikan pada bab IV. Transplantasi sel testikular ikan gurami dilakukan secara i.p pada 45 ekor larva ikan nila yang berumur 3 hpm dengan jumlah sel yang disuntikkan sekitar sel/0,5 µl medium L15. Pemeliharaan resipien dilakukan hingga mencapai umur analisis yaitu 24 jam, 1 bulan, 2 bulan dan 3 bulan pt. Untuk isolasi DNA dari larva yang berumur 24 jam pt digunakan 3 ekor larva yang dipilih secara acak. Untuk isolasi DNA dari larva umur 1, 2 dan 3 bulan pt digunakan masing-masing 6 ekor resipien yang positif membawa sel donor.

5 63 Isolasi DNA DNA diekstraksi dari sampel: 1) larva ikan nila pada 24 jam pt sebanyak 3 ekor yang dipilih secara acak, 2) gonad dari ikan nila umur 1, 2 dan 3 bulan pt yang positif membawa sel donor sebanyak masing-masing 6 ekor, 3) suspensi campuran sel testikular ikan gurami dan ikan nila, 4) suspensi sel-sel testikular ikan gurami sebagai kontrol positif, dan 5) gonad ikan nila tanpa transplantasi umur 3 bulan sebagai kontrol negatif. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan kit dari Puregene (Gentra, Minneapolis, USA). Sampel dimasukkan ke dalam 200 μl cell lysis solution yang berisi 1,5 μl Proteinase K (20 mg/ml). Sampel diinkubasi pada suhu 55 C selama semalam. Setelah sel terlisis sempurna, ditambahkan 1,5 μl RNase (4 mg/ml) dan diinkubasi pada 37 o C selama 60 menit. Kemudian ke dalam tabung sampel ditambahkan 100 μl protein precipitation solution (Gentra, Minneapolis, USA), disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam mikrotub yang berisikan 300 μl isopropanol. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, kemudian ditambahkan 300 μl etanol 70% dingin ke dalam mikrotub berisi pelet DNA. Sampel disentrifugasi kembali dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet DNA dikeringudarakan dan ditambahkan 20 μl sterille destillated water (SDW). DNA disimpan dalam freezer suhu -20 o C hingga digunakan. Kuantifikasi hasil ekstraksi DNA dilakukan dengan spektrofotometer GeneQuant. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 (λ 260 ) nm. Kemurnian DNA diketahui dengan melihat rasio DNA pada perbandingan absorbansi panjang gelombang 260 nm dengan panjang gelombang 280 nm. Kandungan DNA ditentukan dari pengukuran pada λ 260. Amplifikasi DNA dengan PCR Pereaksi PCR dibuat berdasarkan jumlah sampel yang akan diamplifikasi. Volume total pereaksi PCR adalah 10 µl untuk setiap sampel yang terdiri atas 4 µl SDW, 1 µl masing-masing primer forward dan reverse, 1 µl dntps mix, 1 µl LA Taq buffer, 1 µl MgCl 2, 0,05 µl LA Taq polimerase (Takara Bio, Shiga, Japan), 1 µl DNA cetakan. Primer yang digunakan adalah GH ikan gurami dan

6 64 β-aktin ikan nila. Suhu annealing dan lama waktu ekstensi untuk primer GH dan β-aktin masing-masing adalah 58 o C dan 45 detik untuk primer GH serta 61 o C dan 30 detik untuk primer β-aktin. Sedangkan, suhu predenaturasi, denaturasi. dan ekstensi akhir sama untuk kedua primer yaitu masing-masing 94 o C selama 3 menit, 94 o C selama 30 detik, dan 72 o C selama 3 menit dengan siklus amplifikasi sebanyak 35 siklus. Hasil amplifikasi selanjutnya divisualisasikan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% dengan volume DNA sebesar 7 µl dan loading dye (10x loading buffer, Takara bio, Japan) sebesar 3 µl. Pembuatan Kurva Standar Konsentrasi DNA Ikan Gurami dalam Gonad Ikan Nila Untuk mengetahui jumlah sel testikular minimal yang dapat terdeteksi dengan metode PCR jika berada dalam gonad ikan nila maka dibuat suspensi campuran sel testikular ikan gurami dan sel testikular ikan nila dengan rasio yang berbeda yang selanjutnya disebut larutan standar konsentrasi. Sebagai langkah awal dilakukan isolasi sel testikular ikan gurami dan ikan nila yang didisosiasi berdasarkan metode yang telah dijelaskan pada bab IV. Testis ikan gurami ukuran sekitar 700 g didisosiasi dan dihitung jumlah total sel yang dihasilkan. Demikian halnya testis ikan nila umur 2,5 bulan sebanyak tiga ekor juga masing-masing didisosiasi dengan metode yang sama lalu dihitung jumlah selnya. Nilai rata-rata jumlah sel testikular ikan nila diasumsikan sebagai nilai A. Selanjutnya dibuat suspensi campuran sel testikular ikan gurami dan ikan nila dengan perbandingan rasio yang berbeda yang diformulasikan sebagai berikut: Standar : (A-10 1 ) Standar : (A-10 2 ) Standar : (A-10 3 ) Standar : (A-10 4 ) Standar : (A-10 5 ) DNA dari sel hasil pencampuran tersebut diisolasi dan selanjutnya digunakan dalam proses PCR dengan metode seperti dijelaskan oleh Achmad (2009). Sebagai kontrol internal loading DNA, digunakan primer β-aktin DNA. Hasil PCR dielektroforesis dan ketebalan atau intensitas pita DNA pada gel

7 65 diukur menggunakan program unscan UT Gel 6.1 sehingga diperoleh konsentrasi DNA untuk setiap pita yang terbentuk. Hasil konsentrasi DNA tersebut kemudian dikorelasikan dengan jumlah sel testikular ikan gurami sehingga terbentuk kurva konsentrasi terhadap jumlah sel. Kurva ini akan menjadi kurva standar dan persamaan dari kurva standar tersebut digunakan untuk mengestimasi jumlah sel donor ikan gurami dalam gonad resipien ikan nila. Analisis Proliferasi Sel Donor pada Resipien Resipien larva ikan nila umur 24 jam pt dan dari gonad ikan nila umur 1 bulan pt, 2 bulan pt dan 3 bulan pt diekstraksi menggunakan kit isolasi DNA (Gentra, Minneapollis-USA) dengan prosedur seperti dalam manual. PCR dilakukan menggunakan marka molekular spesifik GH ikan gurami dengan program seperti dijelaskan oleh Achmad (2009) dan sebagai kontrol internal loading DNA digunakan primer β-aktin DNA. Pita DNA gurami hasil elektroforesis dikuantifikasi menggunakan program unscan UT Gel 6.1. Hasil kuantifikasi atau digitasi berupa konsentrasi DNA dari pita yang terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar konsentrasi DNA yang telah dibuat untuk mengestimasi jumlah sel donor yang terdapat pada gonad resipien. Peningkatan tebal pita DNA atau meningkatnya konsentrasi DNA hasil digitasi gel dalam selang periode waktu 1, 2 dan 3 bulan pt menunjukkan adanya peningkatan jumlah sel donor atau telah mengalami proliferasi. Analisis Data Data kualitatif disajikan secara deskriptif dalam bentuk elektroforegram dan grafik sedangkan data kuantitatif dalam bentuk nilai tengah diuji secara statistik menggunakan ANOVA (analysis of variance), dan dilanjutkan dengan uji beda nyata Duncan multiple range test. Analisis dilakukan menggunakan program SPSS 17.0 for windows dan MS Office Excell 2007.

8 66 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil amplifikasi DNA genom yang diisolasi dari suspensi campuran sel testikular ikan gurami dan ikan nila dengan berbagai rasio sel dapat dilihat pada elektroforegram DNA produk PCR pada Gambar 14. Hasil amplifikasi dengan PCR menggunakan marker spesifik gen GH ikan gurami tersebut menunjukkan bahwa rasio sel ikan gurami terendah yang dapat dideteksi jika berada dalam gonad ikan nila adalah 1: 4999 (satu sel testikular ikan gurami di dalam suspensi yang berisi 4999 sel testikular ikan nila). Hal ini berarti bahwa sel donor ikan gurami pada gonad ikan nila hanya bisa dideteksi dengan teknik molekular ini jika jumlah sel donor ikan gurami yang terkolonisasi pada gonad ikan nila yang berumur 2,5 bulan adalah lebih besar dari 100 sel (jumlah sel testikular rata-rata dari tiga ekor ikan nila umur 2,5 bulan adalah ±46.825, dibulatkan menjadi untuk memudahkan penghitungan). Gambar 14 Elektroforegram DNA produk PCR dari sel testikular ikan gurami dan ikan nila yang diamplifikasi menggunakan marker spesifik GH gurami (340 bp) dan β aktin (150 bp) sebagai kontrol internal. Ket : M = marker; N=sampel DNA gonad ikan nila; G= sampel DNA sel testikular ikan gurami. Selain untuk mengetahui jumlah minimal sel donor yang dapat terdeteksi oleh mesin PCR, pembuatan suspensi campuran sel testikular ikan gurami dan ikan nila dengan rasio yang berbeda-beda juga bertujuan untuk menganalisis hubungan antara konsentrasi DNA hasil amplifikasi PCR dan jumlah sel donor yang terkolonisasi. Oleh karena itu elektroforegram yang diperoleh pada

9 67 Gambar 14 dikuantifikasi dan dibuatkan kurva standar konsentrasi DNA ikan gurami dalam gonad ikan nila menggunakan program unscan IT Gel 6.1. Hasil penyebaran titik jumlah sel donor (y) terhadap konsentrasi DNA sel donor (x) menghasilkan persamaan regresi linear y= x dan R 2 =0,99. Persamaan ini selanjutnya digunakan sebagai model penduga yang menggambarkan hubungan jumlah sel dan konsentrasi DNA hasil kuantifikasi gel (Gambar 15). Jumlah sel (x1000) y x , , , , ,00 Gambar 15 Kurva standar konsentrasi DNA produk PCR dari DNA genom sel testikular ikan gurami dalam suspensi sel testikular ikan nila. Kuantifikasi DNA Ikan Gurami pada Resipien Ikan Nila Pascatransplantasi Hasil transplantasi sel testikular ikan gurami kepada larva ikan nila yang berumur 3 hpm menunjukkan bahwa sintasan larva 24 jam pt pada penelitian ini adalah sebesar 91,11% (41/45). Kemampuan kolonisasi yang dianalisis melalui pengamatan mikroskop fluoresens dari seluruh total larva yang hidup hingga 3 bulan pt adalah 54,54 % (18/33). Jumlah larva yang membawa sel donor pada pemeriksaan 1 bulan, 2 bulan dan 3 bulan pt adalah masing-masing 6 (13), 6 (12) dan 6 (8) ekor. Perbandingan jumlah jantan dan betina dari resipien yang berumur 2 dan 3 bulan pt yang dapat diidentifikasi dari morfologi gonadnya masingmasing 4:2 dan 3:3 (jantan:betina). Sedangkan pada resipien yang berumur 1 bulan pt, gonad belum dapat diidentifikasi. Beberapa resipien yang teridentifikasi membawa sel donor berlabel PKH 26 dapat dilihat pada Gambar 16.

10 68 Gambar 16 Gonad resipien ikan nila yang membawa sel donor ikan gurami yang terlabel oleh PKH 26 (kepala panah). Garis putus-putus menunjukkan batas gonad. A,C,E,I,J: pengamatan dengan mikroskop fluoresens, B,D,F: pengamatan tanpa fluoresens. A,D: resipien umur 1 bulan pascatransplantasi (pt), E,F: resipien jantan umur 2 bulan pt, G,H(insersi): kumpulan sel donor pada resipien jantan umur 3 bulan pt, I,J(insersi): kumpulan sel donor pada resipien jantan umur 2 bulan pt.

11 69 Pada resipien yang berumur 1 bulan pt, jumlah sel donor yang dapat diamati sangat sedikit (Gambar 16A-D). Tidak demikian halnya dengan resipien umur 2 bulan pt (Gambar 16E,16F) dan 3 bulan pt (Gambar 16G,16H), beberapa sel donor dapat ditemukan di sepanjang gonad ikan bahkan beberapa di antaranya menyerupai kumpulan sel. Seperti yang telah dikemukakan pada bab IV bahwa selama pengamatan gonad resipien di bawah mikroskop fluoresens ditemukan beberapa pendaran PKH 26 yang menyerupai kumpulan sel. Menurut Takeuchi et al. (2003) salah satu indikasi terjadinya proliferasi adalah sel donor yang terkolonisasi membentuk kumpulan sel pada jaringan gonad resipien. Kumpulan sel berpendar yang terdapat pada Gambar 16J dengan ukuran sel yang bervariasi menunjukkan bahwa SSC yang terkolonisasi pada gonad resipien tidak hanya melakukan pembelahan dalam rangka memperbanyak diri, tetapi juga diduga telah berproliferasi menjadi sel-sel derivat SSC. Berdasarkan hasil pemeriksaan secara molekular menggunakan marka GH ikan gurami dengan jumlah sampel masing-masing 6 ekor resipien yang membawa sel donor berdasarkan pemeriksaan fluoresens, terdapat 2 ekor resipien yang berumur 1 bulan pt, 6 ekor resipien yang berumur 2 bulan pt dan 5 ekor resipien yang berumur 3 bulan pt yang terdeteksi membawa sel donor ikan gurami atau sebanyak 72,22% (13/18) yang dapat dideteksi secara molekular (Gambar 17). Terdapat dua ekor resipien yang berumur 1 bulan pt tidak dilanjutkan ke proses PCR karena dari hasil penghitungan gen, diperoleh kandungan DNA= 0 atau dengan kata lain tidak mengandung DNA (Lampiran 8). Pada Gambar 17 tampak bahwa ketebalan pita yang dihasilkan sangat bervariasi yang menunjukkan bahwa jumlah sel yang terdapat pada gonad ikan nila juga sangat bervariasi. Kuantifikasi pita DNA menggunakan program unscan IT Gel 6.1 dilakukan untuk mendapatkan prediksi berapa konsentrasi sel gurami yang terdapat pada gonad ikan nila (data luaran unscan IT Gel dapat dilihat pada Lampiran 9).

12 70 Gambar 17 Elektroforegram DNA produk PCR dari gonad resipien ikan nila 1, 2 dan 3 bulan pascatransplantasi (pt) menggunakan marka molekuler spesifik GH ikan gurami (340 bp) dan primer β-aktin ikan nila (150 bp) sebagai kontrol internal. Ket : L1-L3:DNA resipien 24 jam pt, 12-15:DNA gonad resipien 1 bulan pt, 21-26:DNA gonad resipien 2 bulan pt, 31-36:DNA gonad resipien 3 bulan pt, M: marker, G: DNA suspensi sel testikular ikan gurami, N: DNA gonad ikan nila tanpa transplantasi, (K-): kontrol negatif bahan PCR. Untuk menduga berapa banyak sel ikan gurami yang terdapat pada gonad ikan nila, digunakan model penduga yang telah diperoleh dari kurva standar konsentrasi DNA sehingga diperoleh estimasi jumlah sel seperti terdapat pada Gambar 18. Hasil pemeriksaan DNA genom larva 24 jam pt pada Gambar 18 menunjukkan konsentrasi DNA dan jumlah sel testikular ikan gurami yang berhasil masuk ke dalam rongga peritoneal larva ikan nila sangat bervariasi dengan nilai konsentrasi rata-rata sebesar 37,41±27,47 ng/µl dan jumlah sel rata rata sebesar ± Besarnya variasi konsentrasi sel pada 24 jam pt tersebut diduga disebabkan oleh besarnya variasi tipe sel testikular yang terdapat dalam suspensi sel yang disuntikkan sehingga meskipun jumlah sel yang disuntikkan sekitar sel, tetapi memiliki kandungan DNA yang berbeda-beda. Suresh et al. (1992) menyatakan bahwa konsentrasi DNA genom sel-sel testikular berbeda-beda. Sel testikular yang dalam keadaan diploid (spermatogonia, spermatosit) memiliki jumlah DNA yang lebih besar dari sel haploid (spermatosit sekunder, spermatid,

13 71 spermatozoa). Dugaan lain adalah adanya perbedaan kekuatan isap dari mikromanipulator sehingga mengakibatkan perbedaan jumlah sel yang disedot ke dalam jarum mikroinjeksi. Gambar 18 Estimasi jumlah sel donor ikan gurami pada gonad resipien ikan nila berdasarkan konsentrasi DNA hasil kuantifikasi pita DNA produk PCR menggunakan program Unscan IT Gel 6.1. Sementara itu nilai rerata konsentrasi DNA hasil kuantifikasi pita DNA maupun jumlah sel hasil pendugaan model persamaan linear menunjukkan adanya peningkatan konsentrasi DNA yang nyata dari umur 1 bulan pt ke 2 bulan pt maupun 1 bulan pt ke 3 bulan pt (P<0,05) (Tabel 4 dan Lampiran 10). Jika nilai konsentrasi DNA ini dimasukkan ke dalam model pendugaan persamaan y= x, di mana y=jumlah sel dan x=konsentrasi DNA, maka terjadi peningkatan jumlah sel sekitar 3,42 kali dari umur 1 bulan pt ke 2 bulan pt atau ke 3 bulan pt (sampel yang tidak teramplifikasi diabaikan).

14 72 Tabel 4 Konsentrasi DNA (ng/µl) dan jumlah sel hasil kuantifikasi DNA produk PCR sel donor ikan gurami dalam gonad resipien ikan nila umur 1, 2 dan 3 bulan pascatransplantasi (pt) Umur resipien (pt) Konsentrasi DNA (ng/µl) Jumlah sel 1 bulan 1,66 ± 1,93 a ± a 2 bulan 11,64 ± 4,07 b ± b 3 bulan 9,15 ± 5,57 b ± b Huruf superskrip yang berbeda setelah angka pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata (P<0,05). Peningkatan konsentrasi DNA produk PCR ikan gurami tersebut menunjukkan bahwa kemungkinan telah terjadi proses proliferasi spermatogonia ikan gurami dalam gonad resipien setelah resipien berumur lebih dari 1 bulan meskipun tidak diketahui secara jelas berapa kali sel mengalami pembelahan karena jumlah awal sel yang terkolonisasi tidak diketahui. Namun demikian dapat diduga bahwa telah terjadi peningkatan jumlah sel spermatogonia pada umur 1 bulan pt karena dari sel testikular yang disuntikkan, terdapat 2.006±158 sel yang berada pada tahap spermatogonia belum terdiferensiasi (SSC dan SpA). Jika semua sel spermatogonia ini terkolonisasi maka telah terjadi penambahan jumlah sel testikular rata-rata minimum 2 kali lipat. Beberapa penelitian transplantasi sel spermatogonia pada spesies ikan juga memberikan hasil bahwa dari sekitar jumlah sel yang disuntikkan, jumlah sel yang dapat bermigrasi dan terkolonisasi pada tahap awal larva hanya sedikit yaitu berkisar 1 hingga 9 sel pada ikan rainbow trout yang berumur 20 hari pt (Okutsu et al. 2006b) dan sel pada ikan nibe 21 hari pt (Yazawa et al. 2010), setelah itu proliferasi terjadi lebih cepat. Menurut Kobayashi et al (2000), pada ikan nila oogenesis mulai terjadi saat berumur hpm. Sedangkan Kobayashi et al (2010) menyatakan bahwa pada umur 35 hari mulai terlihat fase meiosis dan saat itu oogonia akan berkembang menjadi oosit primer dan membelah menjadi satu oosit sekunder dan polar body. Namun, pada ikan yang memijah secara parsial seperti ikan nila, proses meiosis tidak terjadi sekaligus sehingga oogonia masih sering ditemukan di antara folikelfolikel ovari (Takashima & Hibiya 1995). Sedangkan pada jantan proliferasi baru terjadi pada umur 50 hpm dan meiosis pertama kali teramati pada umur 85 hpm (Kobayashi 2010). Proses mitosis dan meiosis pada jantan berlangsung secara

15 73 terus-menerus. Jika sel donor mengikuti proses spermatogenesis pada ikan nila, peningkatan jumlah sel dari umur 1 bulan pt ke 2 bulan pt atau 1 bulan pt ke 3 bulan pt sangat mungkin terjadi. Sementara itu, konsentrasi DNA rata-rata pada umur 2 bulan pt dan 3 bulan pt tidak terlihat perbedaan nyata bahkan terlihat adanya penurunan konsentrasi DNA ikan gurami pada gonad ikan nila dari umur 2 bulan pt ke 3 bulan pt. Terdapat beberapa kemungkinan penyebab penurunan konsentrasi DNA tersebut yaitu 1) kemampuan primer GH mendeteksi sel donor yang berkurang diakibatkan oleh konsentrasi sel endogen lebih besar yang disebabkan oleh sel testikular ikan nila yang terlalu besar dibandingkan sel donor pada gonad ikan nila umur 3 bulan sehingga sensitivitas PCR dalam mendeteksi gen target menjadi berkurang. Berat rata-rata gonad ikan nila 3 bulan yang diekstraksi adalah 0,0127±0,0068 g sedangkan berat rata-rata gonad ikan nila 2 bulan adalah 0,0047±0,0044 g Menurut Kuske et al. (1998) DNA pengganggu (background DNA) dapat mempengaruhi sensitivitas PCR. Kemungkinan kedua adalah jumlah sel testikular yang berhasil masuk ke rongga peritoneal pada individu berbeda. Hal ini bisa terlihat dari hasil kuantifikasi DNA genom ikan gurami dalam larva ikan nila 24 jam pt yang sangat bervariasi (Gambar 18) sehingga jumlah sel spermatogonia yang berpeluang terkolonisasi juga sangat bervariasi. Terdapat pula dugaan terjadinya penolakan sistem imun resipien terhadap sel donor pada umur 3 bulan pt namun menurut Ali (1987) jaringan limfoid yang berperan terhadap respon imun ikan nila sudah terbentuk pada umur 5 hpm dan sel-sel limfoid terbentuk pada umur 14 hpm. Pengamatan terhadap respon imun ikan nila pada 56 hpm menunjukkan bahwa respon imun telah berfungsi secara normal. Fenomena respon imun ini menunjukkan bahwa sel donor ikan gurami tidak ditolak oleh respon imun ikan nila sebagai resipien. KESIMPULAN 1. Sel donor spermatogonia ikan gurami mampu berproliferasi pada gonad resipien ikan nila. 2. Proliferasi sel donor terjadi setelah 1 bulan pascatransplantasi.