VI. VIABILITAS DAN EFISIENSI KOLONISASI SPERMATOGONIA DARI TESTIS IKAN GURAMI PASCAPRESERVASI DINGIN PADA LARVA IKAN NILA

Transkripsi

1 VI. VIABILITAS DAN EFISIENSI KOLONISASI SPERMATOGONIA DARI TESTIS IKAN GURAMI PASCAPRESERVASI DINGIN PADA LARVA IKAN NILA ABSTRAK Pada aplikasi transplantasi, ketersediaan sel donor sering tidak sinkron dengan ketersediaan resipien sedangkan testis tidak dapat bertahan lama di luar tubuh. Oleh karena itu dibutuhkan upaya preservasi jaringan testis sebagai sumber sel donor sebelum transplantasi dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk : 1) mengevaluasi viabilitas spermatogonia dari testis pascapreservasi, dan 2) mengevaluasi efisiensi kolonisasi sel donor dari testis yang dipreservasi. Testis dipreservasi pada larutan NaCl fisiologis pada suhu 4 o C selama 6, 12, 24, dan 48 jam. Testis didisosiasi dalam larutan PBS (phosphate buffered solution) dengan 0,5% trypsin dan 3% DNase 10 IU/µL, 5% FBS (fetal bovine serum), 25 mm HEPES dan 1 mm CaCl 2 untuk mendapatkan suspensi sel testikular. Parameter yang diamati adalah viabilitas spermatogonia (diameter sel > 10 µm) dan kerusakan sel akibat preservasi. Viabilitas sel dianalisis dengan trypan blue sedangkan kerusakan sel dan jaringan dianalisis secara histologis. Suspensi sel testikular dari 24 dan 48 jam preservasi dilabel dengan PKH26 dan ditransplantasikan ke larva ikan nila umur 3 hari pascamenetas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa viabilitas sel mulai menurun pada preservasi 12 jam (P<0,05), dan pada preservasi 48 jam viabilitas sel mencapai 54,48±8,33%. Kerusakan histologis yang ditemukan berupa disintegrasi jaringan dan inti piknotik. Efisiensi kolonisasi rata-rata tidak berbeda nyata antara donor tanpa preservasi (61,11%) dan yang dipreservasi selama 24 jam (55,56%) dan 48 jam (55,56%). Hal ini berarti testis yang dipreservasi pada suhu 4 o C hingga 48 jam masih dapat digunakan sebagai sumber sel donor bagi kegiatan transplantasi sel testikular ikan gurami ke ikan nila. Kata kunci: preservasi, spermatogonia, ikan gurami, viabilitas, efisiensi kolonisasi

2 76 VI. THE VIABILITY AND COLONIZATION EFFICIENCY OF SPERMATOGONIA ISOLATED FROM GIANT GOURAMI COLD PRESERVED TESTIS IN NILE TILAPIA LARVAE ABSTRACT In practice of germ cell transplantation, recipient and donor cell may not be immediately available at the same time whereas the testis can not be survive longer when it is outside of the body. Therefore, preservation of testis tissue may be required before transplantation. The research was conducted to evaluate 1) the viability of spermatogonia isolated from short term preserved testis and 2) colonization efficiency of preserved donor cells after transplantation. Testis was preserved in physiological NaCl solution at 4 o C for 6, 12, 24, and 48 hours. Testis were dissociated in 0.5 % trypsin and 3% DNase 10 IU/µL in PBS (phosphate buffered solution) complemented with 5% FBS ( fetal bovine serum), 25 mm HEPES and 1mM CaCl 2 to obtain testicular germ cell suspension. Parameters observed were viability of spermatogonia (cell diameter > 10 µm) and cell damaged caused by preservation. The viability was analyzed using trypan blue exclusion dye meanwhile cell and tissue damaged were analyzed histologically. Testicular germ cell isolated from 24 and 48 hours preservation and labeled with PKH 26 membrane fluorescent dye then transplanted into 3 days post hatched tilapia recipient. The results showed that the viability of spermatogonia started to decrease significantly in 12 hours preservation (P<0.05) and in 48 hours preservation, the amount of viable cells was only 54,48±8,33%. Histological study showed there were disintegration of interstitial tissue and picnotic nucleus found at the testicular tissue preserved for 6 until 48 hours. Two months post transplantation, the efficiency of colonization were analyzed in recipient and the result showed insignificant difference of efficiency colonization between recipient transplanted with testicular tissue preserved 24 and 48 hours (55,56% each) and without preservation (61,11%). In conclusion, preserved testicular tissue at 4 o C could be used as the source of donor cell for testicular germ cell transplantation of giant gourami into Nile tilapia. Key words: preservation, spermatogonia, giant gourami, viability, efficiency colonization. PENDAHULUAN Selama dua dekade terakhir, teknologi transplantasi sel germinal telah berhasil dilakukan pada beberapa jenis ikan (Takeuchi et al. 2004, Okutsu et al. 2006b, Lacerda et al. 2008, Majhi et al. 2009). Dari penelitian-penelitian yang telah dilakukan, beberapa yang menggunakan donor dan resipien yang berbeda

3 77 spesies yang dikenal dengan istilah xenotransplantasi (Saito et al. 2008, Yazawa et al. 2010). Pada vertebrata tingkat tinggi, xenotransplantasi ini masih banyak terbatasi oleh penolakan sistem imun dari resipien terhadap sel donor yang berbeda spesies. Oleh karena itu xenotransplantasi pada ikan memiliki peluang lebih besar untuk dikembangkan termasuk pengembangan beberapa aplikasi teknik yang mendukung keberhasilan transplantasi seperti preservasi sel donor, identifikasi dan kultur sel donor, transgenesis dan lain-lainnya (Johston et al. 2000, Hills & Dobrinski 2006). Pada aplikasi teknik transplantasi, sering ditemui beberapa kendala diantaranya adalah sinkronisasi ketersediaan sel donor dengan resipien. Terkadang sel atau jaringan donor sudah tersedia namun resipien belum siap ditransplantasi. Sementara itu, jika donor tersebut berupa jaringan testis maka testis setelah dikeluarkan dari tubuh ikan akan beresiko mengalami kerusakan jika tidak segera diproses. Oleh karena itu untuk mengatasi kendala ini dibutuhkan teknik penyimpanan (preservasi) untuk menghindari kerusakan sel-sel gamet pada testis sebelum transplantasi dilakukan dan sekaligus menambah daya tahan hidup gamet. Terdapat dua macam teknik preservasi yaitu penyimpanan jangka panjang dengan suhu penyimpanan di bawah 0 o C dan preservasi jangka pendek dengan suhu penyimpanan di atas 0 o C (Browne et al. 2001). Umumnya penyimpanan jangka panjang dilakukan pada suhu beku (biasa dalam nitrogen cair) dikenal dengan istilah kriopreservasi dengan menggunakan krioprotektan tertentu. Pada beberapa vertebrata tingkat tinggi, kriopreservasi testis dengan tingkat kematangan yang tidak merata terkadang menurunkan viabilitas sel terutama bagi sel spermatogonia atau PGC, bahkan menurunkan kemampuan kolonisasi setelah ditransplantasikan pada tubuli seminiferi (Jahnukainen et al. 2006, Ehmcke & Schlatt 2008). Pada ikan, proses penyimpanan testis baru dilakukan pada ikan rainbow trout. Kriopreservasi testis ikan rainbow trout pada berbagai jenis krioprotektan dan berbagai konsentrasi krioprotektan menghasilkan viabilitas sel tertinggi sekitar 50%, menurun sekitar 40% dari kontrol atau tanpa kriopreservasi (Kobayashi et al. 2007). Efek yang ditimbulkan oleh kriopreservasi tersebut

4 78 menyebabkan teknik ini dikatakan tidak efisien untuk penyimpanan jangka pendek (Jahnukainen et al. 2006). Dalam dunia kedokteran, penyimpanan (preservasi) jangka pendek merupakan protokol tetap atau protokol intermediet sebelum melakukan transplantasi organ atau jaringan. Testis yang dipreservasi pada suhu 4 o C (preservasi dingin) terlebih dahulu ternyata tidak mempengaruhi kemampuan kolonisasi sel donor pada tubuli seminiferi bahkan dapat mempercepat spermatogenesis bagi testis prepubertal pada resipien (Jahnukainen et al. 2008, Honaramooz & Yang 2011). Pada hewan vertebrata, Eriani et al. (2008) melakukan preservasi duktus deferens dan epididimis kucing pada suhu 4 o C, dan hasil penelitiannya menunjukkan bahwa sel gamet jantan masih bisa diselamatkan hingga 6 hari. Namun pada ikan, teknik preservasi testis pada suhu 4 o C belum pernah dilakukan. Lahnsteiner et al. (1977) menyatakan bahwa selain untuk tujuan sinkronisasi sel gamet jantan dan betina, preservasi jangka pendek juga digunakan untuk menyelamatkan plasma nutfah selama proses pengangkutan atau transportasi. Dalam pengembangan xenotransplantasi sel germinal, faktor ketersediaan sel punca spermatogonia atau spermatogonia belum berdiferensiasi juga menjadi faktor pembatas (Grisswold et al. 2001). Okutsu et al. (2006a) menyatakan bahwa hanya spermatogonia yang belum berdiferensiasi saja (spermatogonia A) yang memiliki kemampuan terkolonisasi pada resipien dan tipe sel ini jumlahnya paling sedikit dibandingkan tipe sel-sel testikular lainnya (Olive & Cuzin 2005, Lacerda et al. 2006, Oatley et al. 2006). Oleh karena itu ketersediaan spermatogonia sebagai sel donor juga menjadi suatu tantangan dalam mengembangkan teknologi transplantasi spermatogonia. Dengan teknik preservasi dingin selama proses transportasi ini, ketersediaan sel dapat diantisipasi dengan pemanfaatan limbah-limbah testis pada tempat-tempat pemotongan ikan atau restoran-restoran yang menyajikan ikan gurami. Untuk mengevaluasi potensi spermatogonia dari testis ikan gurami pascapreservasi dingin (4 o C), dilakukan transplantasi sel testikular yang diisolasi dari testis pascapreservasi pada beberapa lama waktu penyimpanan.

5 79 BAHAN DAN METODE Preservasi Jaringan Testis Ikan Gurami Sebanyak 5 pasang testis diisolasi dari ikan gurami jantan dewasa berukuran g. Setiap testis dimasukkan ke dalam larutan fisiologis NaCl 0,7% pada cawan petri steril dan dipreservasi pada suhu 4 o C dengan masa penyimpanan masing-masing 0, 6, 12, 24 dan 48 jam. Larutan fisiologis NaCl 0,7% sebelumnya diberi antibiotik gentamycin 1,25 µl/ml. Setelah masa penyimpanan selesai, testis selanjutnya dikeluarkan dari lemari/kotak pendingin. Sepasang testis tersebut dibagi menjadi dua bagian, satu bagian testis didisosiasi dan satu bagian lainnya diproses secara histologis. Penelitian ini diulang sebanyak 3 kali. Disosiasi Testis Ikan Gurami Pascapreservasi Sebanyak ±20 mg dari jaringan testis yang telah dipreservasi diambil untuk didisosiasi menurut metode disosiasi yang optimum pada bab III. Untuk menghilangkan aktivitas tripsin, suspensi sel dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali. Parameter yang diamati adalah viabilitas spermatogonia. Sebanyak 10 µl dari 1 ml suspensi sel hasil disosiasi diwarnai dengan trypan blue 0,4% (1:1). Sel yang mati akan terwarnai oleh trypan blue sehingga terlihat berwarna biru; sedangkan yang hidup akan tetap terlihat transparan. Jumlah total spermatogonia dan jumlah spermatogonia yang mati dihitung menggunakan hemositometer di bawah mikroskop. Persentase viabilitas dihitung berdasarkan jumlah spermatogonia yang hidup per jumlah total spermatogonia dikalikan seratus. Pembuatan Preparat Histologis Testis Pascapreservasi Preparat histologis jaringan testis dibuat untuk mengamati adanya perubahan morfologi sel spermatogonia sebelum dan sesudah preservasi. Testis yang telah dipreservasi difiksasi dalam larutan Bouin selama 24 jam dan selanjutnya diproses mengikuti metode Kiernan (1990). Potongan jaringan testikular diwarnai dengan Hematoksilin-Eosin. Perubahan dan kerusakan morfologi yang terjadi pada jaringan atau spermatogonia diamati pada 10 potongan melintang preparat histologis per perlakuan. Perubahan histologi testis

6 80 atau testis pascapereservasi diamati pada tiga bagian utama dari testis yaitu jaringan interstisial, tubulus dan sista spermatogonia. Perubahan histologis tersebut mengacu pada Pieterse (2004) yang meliputi disintegrasi jaringan interstisial, disorganisasi dan degenerasi lobul atau tubulus serta degenerasi sista dan kondensasi nukleus dari spermatogonia yang dikenal dengan istilah piknotik. Inti piknotik pada spermatogonia juga dapat dikenali dari rasio diameter sel dan inti sel yang melebihi rasio rata-rata diameter sel dan inti sel spermatogonia normal pada bab II. Transplantasi Sel Testikular yang Diisolasi dari Testis Ikan Gurami Pascapreservasi Kelayakan testis pascapreservasi sebagai sumber sel donor diuji melalui pendekatan transplantasi sel. Testis yang digunakan sebagai sumber donor adalah testis yang dipreservasi selama 24 dan 48 jam serta testis tanpa preservasi sebagai kontrol. Testis yang dipreservasi selama 6 jam tidak diuji kelayakannya dalam penelitian ini karena viabilitas selnya tidak berbeda nyata dengan testis tanpa preservasi sedangkan testis yang dipreservasi selama 12 jam tidak diuji karena viabilitas selnya tidak berbeda nyata dengan testis yang dipreservasi 24 jam. Resipien yang digunakan adalah yang optimum untuk kegiatan transplantasi berdasarkan penelitian sebelumnya yaitu larva umur 3 hpm sebanyak 20 ekor per perlakuan. Setiap perlakuan diulang sebanyak tiga kali. a. Persiapan sel donor Testis diisolasi dari ikan gurami jantan dewasa dengan bobot tubuh g dan dipreservasi pada larutan fisiologis NaCl 0,7% di dalam cawan petri steril pada suhu 4 o C selama 0 jam, 24 jam dan 48 jam. Testis didisosiasi menurut metode disosiasi optimum pada bab III. Setelah suspensi sel dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali, jumlah sel selanjutnya dihitung menggunakan hemositometer di bawah mikroskop CX10 (Olympus) untuk menentukan volume pewarna atau label PKH 26 yang digunakan. Untuk visualisasi, sel donor dilabel dengan PKH 26 fluorescent membrane dye menurut metode pelabelan pada bab IV. Jumlah sel spermatogonia yang diameter selnya 15 µm dihitung menggunakan hemositometer. Suspensi sel

7 81 selanjutnya dipadatkan hingga konsentrasi /0,5 µl lalu disimpan pada suhu dingin dan tanpa cahaya hingga digunakan. b. Transplantasi sel donor ke dalam rongga genital larva resipien dan analisis kolonisasi sel donor pada gonad resipien Transplantasi sel donor ke dalam rongga genital mengikuti metode transplantasi pada bab IV. Suspensi sel yang diinjeksikan sebanyak 0,5 µl dengan jumlah sel testikular sebanyak sel. Resipien larva nila dipelihara dalam aquarium (60x60x60) cm 3 hingga siap dianalisis. Untuk mengevaluasi inkorporasi dari sel donor pada gonad resipien, gonad resipien ikan nila 2 bulan pascatransplantasi diamati di bawah mikroskop fluoresens Nikon Ellips E600. Jumlah resipien yang diperiksa sebanyak 6 ekor per perlakuan. Parameter keberhasilan transplantasi dihitung dari efisiensi kolonisasi yaitu persentase rasio jumlah resipien yang membawa spermatogonia gurami+pkh26 jumlah resipien yang diperiksa. Analisis Data dengan total Semua data kualitatif disajikan secara deskriptif, sedangkan data kuantitatif dalam bentuk nilai tengah diuji secara statistik menggunakan ANOVA (analysis of variance), dan dilanjutkan dengan uji Duncan multiple range test untuk menentukan beda nyata antar perlakuan. Analisis menggunakan program SPSS 17.0 for windows dan MS Office Excell Perbedaan karakter morfologis diuji secara deskriptif. HASIL DAN PEMBAHASAN Viabilitas Spermatogonia dari Jaringan Testis Ikan Gurami Pascapreservasi Viabilitas hasil disosiasi testis pascapreservasi 0 (kontrol jaringan testis segar), 6, 12, 24 dan 48 jam dapat dilihat pada Tabel 5. Berdasarkan hasil analisis ragam (Lampiran 11) menunjukkan bahwa lama preservasi dingin (4 o C) jaringan testis dalam larutan NaCl fisiologis berpengaruh nyata terhadap viabilitas sel spermatogonia (P<0,05). Perbedaan nyata mulai terlihat pada lama penyimpanan 12 jam yang mana viabilitas sel telah menurun dan berada di bawah

8 82 80%. Viabilitas menurun drastis pada jaringan testis yang dipreservasi selama 48 jam. Hampir separuh dari spermatogonia mengalami kematian yang ditandai dengan sel berwarna biru (Gambar 19). Tabel 5 Jumlah dan viabilitas rata-rata sel spermatogonia hasil disosiasi jaringan testis ikan gurami pascapreservasi pada lama inkubasi berbeda Lama preservasi (jam) Jumlah rata-rata spermatogonia/mg testis Viabilitas spermatogonia (%) ± ,77 ± 3,23 a ± ,37 ± 3,79 a ± ,70 ± 3,01 b ± ,30 ± 5,41 b ± ,48 ± 8,33 c Huruf superskrip yang berbeda setelah angka pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata (P<0,05). Preservasi adalah suatu cara untuk menyimpan bahan (organ, jaringan, atau sel) yang bertujuan untuk pengawetan, pemeliharaan dan menjaga agar tidak terjadi kerusakan pada bahan tersebut. Preservasi dapat berupa penyimpanan pada suhu rendah atau penyimpanan menggunakan bahan-bahan kimia. Preservasi dalam bentuk penurunan suhu di atas suhu beku dan dibawah suhu tubuh dapat menurunkan aktivitas metabolik, kebutuhan akan oksigen, konsumsi energi dan karenanya preservasi ini dapat memperpanjang viabilitas sel (Honaramooz & Yang 2011). Namun, jika pendinginan dilakukan terlalu lama akan merusak keseimbangan dan homeostasis seluler sehingga sel mengalami kematian. Umumnya suhu penyimpanan untuk jangka pendek adalah suhu refrigerator 4 o C. Ketidakseimbangan pada sel juga dipengaruhi oleh adanya peran reactive oxygen species (ROS), yaitu agen oksidatif yang termasuk dalam kategori radikal bebas hasil turunan metabolisme oksigen selama proses respirasi sel berlangsung (Sikka 1996). Aitken & Baker (2006) mengatakan bahwa produk ROS berupa senyawa-senyawa radikal bebas seperti O 2-, H 2 O 2, OH - dapat menurunkan viabilitas sel. Selama proses preservasi organ/jaringan/sel terus melakukan metabolisme untuk tetap hidup dengan melakukan proses oksidasi. Jika produk ROS pada sel dalam kondisi tidak terkendali akan berakibat negatif pada sel.

9 83 Gambar 19 Hasil disosiasi jaringan testikular ikan gurami. A. Tanpa preservasi, B. Pascapreservasi 24 jam, C. Pascapreservasi 48 jam. Kepala panah merah menunjukkan sel spermatogonia yang mati terwarnai oleh trypan blue, sedangkan kepala panah hitam menunjukkan sel spermatogonia hidup. Skala : 50 µm. Deskripsi Histologis Jaringan Testis Pascapreservasi Perubahan histologis semakin banyak ditemukan dengan semakin bertambahnya lama waktu preservasi. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa testis yang tidak dipreservasi dan dipreservasi selama 6 jam belum memperlihatkan disintegrasi jaringan interstisial (Gambar 20C,20D). Demikian halnya pada testis yang dipreservasi selama 12 jam, meskipun pada perlakuan ini tampak jaringan interstisial sudah mengalami kerusakan (Gambar 20E,20F). Selsel Leydig dan sel-sel somatik yang terdapat pada jaringan interstisial masih terlihat jelas pada jaringan interstisial. Sedangkan pada testis yang dipreservasi selama 24 jam ditemukan beberapa batas antara tubulus yang sudah tidak terlihat dengan jelas atau dengan kata lain telah terjadi disintegrasi jaringan interstisial (Gambar 20G,20H). Disintegrasi jaringan interstisial sangat jelas terlihat pada sebagian besar area testis yang dipreservasi selama 48 jam sehingga jaringan interstisial antar tubulus tidak dapat dikenali lagi bahkan tubulus utuh sulit ditemukan (Gambar 20I,20J). Fenomena lain yang juga terjadi akibat dari preservasi 24 dan 48 jam tersebut adalah adanya disorganisasi lobul atau tubulus sehingga sel-sel pada jaringan interstisial seperti sel-sel darah dan sel Leydig yang seharusnya berada pada jaringan interstisial sering ditemukan di dalam tubulus (Gambar 20H,20J). Pada preparat histologis jaringan testis preservasi 48 jam, sista sel germinal tidak terlihat dengan jelas.

10 84 Gambar 20 Penampang melintang preparat histologis jaringan testis ikan gurami. A,B: tanpa preservasi, C,D: pascapreservasi 6 jam, E,F: pascapreservasi 12 jam, G,H: pascapreservasi 24 jam, I,J: pascapreservasi 48 jam. Gambar sebelah kanan adalah perbesaran dari kotak hitam di sebelah kiri. Keterangan: sel spermatogonia normal (kepala panah hitam), inti spermatogonia piknotik (kepala panah kuning), disintegrasi jaringan (DiJr), batas antar tubulus (Tb), sel Leydig (SL), sel sertoli (SS), sel darah (SD). Pewarnaan : Hematoksilin-Eosin.

11 85 Disintegrasi jaringan interstisial dan disorganisasi tubulus tersebut mengindikasikan bahwa telah terjadi proses enzimatik baik pada jaringan interstisial maupun pada tunika albuginea dari tubulus meskipun telah dipreservasi pada suhu 4 o C. Menurut Pieterse (2004) disintegrasi jaringan interstisial dan disorganisasi lobul (tubulus) dapat menyebabkan hilangnya spermatogonia, tidak dijelaskan mekanismenya, namun diduga sista spermatogonia utamanya yang berada pada daerah tepi tubulus dan sel-sel yang ada di dalamnya mengalami disintegrasi yang berakibat pada kematian sel spermatogonia. Perubahan histologis lain yang dapat diamati pada penelitian ini adalah beberapa inti sel spermatogonia mengalami penyusutan yang dikenal dengan istilah inti piknotik. Menurut Pieterse (2004) inti piknotik merupakan pertanda kematian sel yang dicirikan oleh berkumpulnya kromatin dan terjadi kondensasi kromatin. Hal inilah yang menyebabkan inti terlihat mengkerut dan berwarna sangat pekat. Inti sel piknotik mulai teramati pada testis yang dipreservasi selama 6 jam (Gambar 20D) dan semakin banyak ditemukan dengan semakin bertambahnya lama waktu preservasi (Gambar 20F,20H,20J). Analisis Kolonisasi Sel Spermatogonia Ikan Gurami yang Diisolasi dari Testis Pascapreservasi yang Ditransplantasikan pada Larva Ikan Nila Sebelum suspensi sel testikular disuntikkan secara i.p ke larva ikan nila, jumlah sel testikular dan viabilitas sel spermatogonia diamati (Tabel 6). Viabilitas sel spermatogonia terlihat mengalami penurunan seiring dengan semakin lamanya testis dipreservasi. Tabel 6 Jumlah dan viabilitas rata-rata sel spermatogonia dalam sel testikular ikan gurami yang disuntikkan pada larva ikan nila Periode preservasi Jumlah spermatogonia/ sel testikular Viabilitas sel testikular (%) Viabilitas spermatogonia (%) 0 jam ± ,47 ± 1,06 92,63 ± 4,11 24 jam ± ,76 ± 2,51 79,84 ± 2,06 48 jam ± ,68 ± 2,18 66,94 ± 3,74

12 86 Dari tiga kali ulangan dengan jumlah larva yang disuntik masing-masing 20 ekor diperoleh sintasan larva ikan nila 24 jam dan 1 bulan pt tidak berbeda nyata antara ketiga kelompok perlakuan periode preservasi 0, 24 dan 48 jam (P>0,05) (Gambar 21). Tingkat kelangsungan hidup di atas 90% pada 24 jam pt pada penelitian ini menegaskan kembali bahwa resipien ikan nila yang berumur 3 hpm secara fisik layak digunakan sebagai sel donor. Gambar 21 Sintasan resipien ikan nila pada 24 jam dan 1 bulan pascatransplantasi. Keterangan gambar : tanpa preservasi ( ), preservasi 24 jam ( ), preservasi 48 jam ( ). Hasil identifikasi sel donor pada gonad resipien berumur sekitar 2 bulan pt menunjukkan bahwa sel spermatogonia baik yang berasal dari testis yang dipreservasi dingin selama 24 jam maupun 48 jam mampu bermigrasi dan terkolonisasi pada gonad resipien. Efisiensi kolonisasi rata-rata sel spermatogonia dari testis yang dipreservasi sedikit lebih rendah dibandingkan tanpa preservasi, namun dari hasil uji statisik menunjukkan bahwa efisiensi kolonisasi sel spermatogonia baik yang berasal dari testis yang dipreservasi maupun tanpa preservasi tidak menunjukkan adanya perbedaan nyata (P>0,05) (Gambar 22, Lampiran 12). Sel spermatogonia dari sumber donor yang dipreservasi mampu bermigrasi dan terkolonisasi pada resipien sama halnya dengan yang berasal dari testis tanpa preservasi. Hal ini menunjukkan bahwa preservasi dingin pada suhu 4 o C tidak menghilangkan respon sel spermatogonia terhadap kemoatraktan yang

13 87 dikeluarkan oleh lingkungan mikro termasuk sel-sel somatik di area gonad resipien sehingga sel spermatogonia ikan gurami tersebut tetap mampu bermigrasi hingga ke saluran gonad larva ikan nila. Periode preservasi (jam) Gambar 22 Efisiensi kolonisasi sel spermatogonia ikan gurami yang diisolasi dari testis pascapreservasi 0, 24 dan 48 jam pada resipien ikan nila. Hasil pengamatan gonad resipien di bawah mikroskop fluoresens juga menunjukkan bahwa sel spermatogonia yang diisolasi dari testis yang dipreservasi tidak hanya terkolonisasi pada gonad resipien jantan (testis) melainkan juga pada gonad betina atau ovari (Gambar 23). Hal ini menunjukkan bahwa proses preservasi testis pada suhu 4 o C hingga 48 jam tidak menghilangkan kemampuan development plasticity dari sel spermatogonia ikan gurami sehingga sel spermatogonia ikan gurami yang terkolonisasi dapat berkembang menjadi sel germinal jantan maupun betina selama niche dari resipien dapat mendukung perkembangan tersebut. Seperti yang telah diungkapkan pada bab IV bahwa diferensiasi kelamin lebih banyak dipengaruhi oleh sel-sel somatik pada jaringan gonad dibandingkan kontrol dari sel eksogen itu sendiri (Yoshizaki et al. 2010). Teknik preservasi dingin merupakan teknik preservasi jangka pendek. Teknik ini sangat mudah diaplikasikan di lapangan karena hanya membutuhkan kotak pendingin (cool box) dan larutan fisologis. Daniel (1971) mengatakan bahwa larutan garam fisiologis selain digunakan sebagai cairan pembilas dari

14 88 organ, juga dapat menjadi medium buffer dan mempertahankan ph fisiologis (7,2 7,6) serta menyediakan lingkungan cairan ionik untuk metabolisme sel. Lensa fluoresens Tanpa lensa fluoresens Lensa fluoresens Tanpa lensa fluoresens Gambar 23 Gonad resipien ikan nila yang membawa sel donor ikan gurami dari testis pascapreervasi dan tanpa preservasi. A C: testis, D F: ovari, A,D: tanpa preservasi, B,E: preservasi 24 jam, C,F: preservasi 48 jam. Tanda panah menunjukkan sel germinal ikan gurami yang terkolonisasi. Skala: 100 µm.

15 89 Dengan dibuktikannya kemampuan kolonisasi sel donor yang diperoleh dari testis pascapreservasi dan dengan teknik isolasi yang optimum maka beberapa permasalahan teknis yang berkaitan dengan prosedur transplantasi dapat teratasi. Telah dipaparkan sebelumnya bahwa tujuan utama dari preservasi jaringan testikular ikan gurami pada suhu 4 o C adalah sinkronisasi ketersediaan sel donor dan resipien dalam kegiatan transplantasi spermatogonia pada ikan gurami. Dengan teknik preservasi dingin ini, limbah testis dari tempat-tempat pemotongan ikan gurami juga akan berpotensi untuk diselamatkan dan digunakan sebagai sumber donor sehingga masalah ketersediaan sel donor yang selama ini menjadi faktor pembatas dalam kegiatan transplantasi juga dapat teratasi. Teknik preservasi ini juga dapat berperan bagi upaya penyelamatan sel gamet ikan-ikan yang hampir punah yang mungkin saja ditemukan jauh dari lokasi laboratorium. KESIMPULAN 1. Testis ikan gurami dapat dipreservasi dingin pada suhu 4 o C. 2. Viabilitas sel menurun menjadi 55% pada preservasi selama 48 jam. 3. Sel testikular hasil preservasi dingin selama 48 jam dapat digunakan dalam transplantasi.