Lampiran 1 Persiapan sebelum tahapan kuantitasi DNA dengan RT-PCR. a. Penempatan larutan di dalam well sebelum DNA dikuantitasi dengan RT- PCR

Transkripsi

1 55 Lampiran 1 Persiapan sebelum tahapan kuantitasi DNA dengan RT-PCR. a. Penempatan larutan di dalam well sebelum DNA dikuantitasi dengan RT- PCR Keterangan : Std 1 Std 1 1A EC Std 2 Std 2 1 B Std 3 Std 3 1 C NTC 1 Std 4 Std 4 1 D 3 D NTC 2 Std 5 Std 5 Std 6 Std 6 Std 7 Std 7 Std 8 Std 8 2 D Std 1-8 : Larutan standar dengan urutan konsentrasi tertentu. 1 A, 1B, 1C : Larutan DNA + larutan glikogen ulangan I, II dan III 1 D,2 D,3D : Larutan DNA (tanpa larutan glikogen) = blanko presipitasi DNA. EC : Extraction Control = blanko ekstraksi DNA. NTC : Non Template Control = larutan buffer TE. b. Pembuatan larutan standar DNA manusia untuk membuat kurva standar konsentrasi DNA femur yang terpresipitasi Konsentrasi (ng/µl) Dilution Factor Standar Campuran 5µL(200ng/µL stok)+15µl buffer Std 1 50,00 TE 4x Std 2 16,70 5µL(Std 1)+10µL buffer TE 3x Std 3 5,56 5µL(Std 2)+10µL buffer TE 3x Std 4 1,85 5µL(Std 3)+10µL buffer TE 3x Std 5 0,62 5µL(Std 4)+10µL buffer TE 3x Std 6 0,21 5µL(Std 5)+10µL buffer TE 3x Std 7 0,068 5µL(Std 6)+10µL buffer TE 3x Std 8 0,023 5µL(Std 7)+10µL buffer TE 3x

2 56 Lampiran 2 Nilai rataan asam amino temilok. Hasil (% berat protein) No. Jenis asam amino Rataan Standar I II deviasi Treonina Valina Metionina Isoleusina Leusina Fenilalanina Lisina Histidina Arginina Asam aspartat Asam glutamat Serina Glisina Alanina Prolina Tirosina Sisteina 0,387 1,293 0,596 0,337 1,251 1,195 1,821 1,005 1,839 2,854 3,663 1,285 1,662 1,651 0,418 0,719 0,423 0,360 1,287 0,518 0,349 1,243 1,179 1,795 1,016 1,761 2,841 3,432 1,236 1,820 1,618 0,403 0,729 0,402 0,37 1,29 0,56 0,34 1,25 1,19 1,81 1,01 1,80 2,85 3,55 1,26 1,74 1,63 0,41 0,72 0,41 0,019 0,004 0,055 0,008 0,006 0,011 0,018 0,008 0,055 0,009 0,163 0,035 0,1 0,023 0,011 0,007 0,015 Total 22,399 21,989 22,19 0,290 Sumber : Leiwakabessy (2011).

3 57 Lampiran 3 Rekapitulasi data pengukuran dan tabel sidik ragam residu nitrogen ekstrak glikogen (ppm) karena perlakuan konsentrasi KOH (resin kationik 6%). Konsentrasi KOH (%) Ulangan I 2836, ,40 0,33 II 3056, ,24 383,30 III 2600, ,81 Rataan±SD 2731,98±387, ,87±694,73 250,81±131,49 Sumber keragaman db JK KT F Ftabel α=0,05 Perlakuan ,23* 5,14 Galat Total Uji Beda Nyata Jujur (Tukey): W = q α(p;dbg). = q 0,05 (3;6). = 3,43 x 268,74 = 921,79 Residu nitrogen ekstrak glikogen karena perlakuan konsentrasi KOH yang dicobakan berbeda nyata pada taraf 0,05. Rataan residu nitrogen yang paling rendah adalah 250,81ppm atau 0,03%, yang dihasilkan dengan perlakuan KOH 40%. Rumus kadar nitrogen: % N = x 100% dengan faktor pengenceran = 2, N HCl = , dan ppm N = %N x

4 58 Lampiran 4 Nilai absorbansi glukosa standar dan glikogen terekstrak dengan konsentrasi tertentu pada panjang gelombang 490 nm. Sampel ke- Konsentrasi glukosa Absorbansi (ppm) 1 0 (blanko) 0, ,240 0, ,433 0, ,665 0, ,819 0, ,072 1,063 Absorbansi sampel-blanko a. Kurva standar glukosa Absorbansi pada 490 nm y = 0.004x R² = Konsentrasi glukosa (ppm) b. Karakterisasi glikogen terekstrak perlakuan konsentrasi KOH Sampel glikogen Absorbansi pada 490 nm Konsentrasi Glukosa Persentase glukosa di dalam glikogen (%) (ppm) 1 3, ,56 99,95 2 2, ,32 87,41 3 2, ,34 87,29 Rataan±SD 3,025±0, ,41±58,16 91,55±0,07 c. Karakterisasi glikogen terekstrak perlakuan resin dan lama pengadukan Sampel glikogen Absorbansi pada 490 nm Konsentrasi Glukosa Persentase glukosa di dalam glikogen (%) (ppm) 1 2, ,44 85,56 2 2, ,49 87,81 3 2, ,46 71,68 Rataan±SD 2,701±0, ,46±69,87 81,68±8,74

5 Lampiran 5 Ekstrak glikogen temilok yang menempel pada dasar tabung gelas dan larutan ekstrak glikogen temilok. 59

6 60 Lampiran 6 Rekapitulasi data pengukuran dan tabel sidik ragam rendemen ekstrak glikogen (%) karena perlakuan konsentrasi KOH (resin kationik 6%). Ulangan Konsentrasi KOH (%) I 9,68 14,10 8,69 II 11,72 6,91 9,50 III.,53 14,58 7,50 Rataan±SD 11,31±1,47 11,86±4,30 8,56±1,01 Sumber keragaman db JK KT F F tabel α = 0,05 Perlakuan 2 18,74 9,37 1,30 5,14 Galat 6 43,26 7,20 Total 8 61,99 Keterangan : Rendemen ekstrak glikogen karena perlakuan konsentrasi KOH yang dicobakan tidak berbeda nyata pada taraf 0,05.

7 61 Lampiran 7 Rekapitulasi data pengukuran dan tabel sidik ragam rendemen ekstrak glikogen temilok (%) dengan perlakuan persentase resin kationik dan lama pengadukan. Ulangan Resin (%) I 9 II 9 III 9 Rataan±SD 9 Lama Pengadukan (jam) ,78 7,92 8,56 8,46 11,60 9,24,40 10,50,71,36 7,71,24,19 14,91 14,60 10,08 11,26 13,84 11,11±3,53 10,19±2,15,±0,32 10,30±1,96 Rataan±SD 9,42±2,07 9,77±1,63 11,87±1,20 10,77±2,65 13,90±1,45 11,73±1,92 11,96±3,09 11,77±2,34 11,24±2,21 Sumber Keragaman Jumlah Kuadrat db Kuadrat Tengah F hitung F tabel α= 0,05 Lama pengadukan Persentase resin Interaksi Galat Total 4,6710 3,8786 1, , , ,3355 3,8786 0,9289 6,1154 0,38 0,63 0,15 3,88 4,75 3,88

8 62 Lampiran 8 Pengamatan bobot ekstrak glikogen selama pengeringan di dalam desikator vakum gel silika. Bobot sebelum pengeringan (g) Bobot setelah pengeringan (g) Bobot setelah/sebelum Gram Gram Kode Ulangan KOH Temilok I 40,11 100, ,80 8,59 0, ,09 100, ,61 8,50 0, ,16 100, ,35 7,96 0, ,07 100, ,39 11,81 0, ,11 100, ,02 11,63 0, ,02 100, ,28 9,26 0,6973 Rataan 40,09 100,35 14,41 9,63 0,6746 SD 0,05 0,13 2,62 1,68 0,0878 II 40,01 100, ,47,38 0, ,06 100, ,60,25 0, ,09 100, ,73,41 0, , ,93,71 0, , ,95 10,50 0, , 100, ,27 7,71 0,7507 Rataan 40,05 100,07 13,83 11,33 0,8153 SD 0,05 0,05 1,77 1,94 0,05 III 40,06 100, ,21,20 0, ,05 100, ,72 14,61 0, ,02 100, ,22 13,85 0, ,04 100,02-8,11 10,08 0, ,01 100, ,50 11,27 0, ,04 100, ,47 14,92 0,8539 Rataan 40,04 100,06 15,04,82 0,85 SD 0,02 0,04 2,09 1,95 0,02

9 63 Lampiran 9 Rekapitulasi data pengukuran dan tabel sidik ragam residu asam nukleat larutan glikogen temilok 2% (mg/ml) dengan perlakuan persentase resin kationik dan lama pengadukan. Lama Pengadukan (jam) Ulangan Resin Rataan±SD (%) I 9 0,0658 0,0861 0,0797 0,0772±0,0104 0,0853 0,0633 0,0780 0,0755±0,01 II 9 0,0770 0,0886 0,0905 0,0854±0,0073 0,0997 0,0862 0,0903 0,0921±0,0069 III 9 0,0836 0,0998 0,0817 0,0884±0,0099 0,0702 0,0702 0,0915 0,0790±0,0152 Rataan±SD 9 0,08±0,01ab 0,09±0,01b 0,08±0,01ab 0,09±0,01b 0,07±0,00a 0,09±0,01b 0,08±0,01 Sumber Keragaman Jumlah Kuadrat db Kuadrat Tengah F hitung F tabel α=0,05 Lama pengadukan Persentase resin Interaksi Galat Total 0, , , , , , , , , ,55 0,11 4,44* 3,88 4,75 3,88 Uji Beda Nyata Jujur (Tukey): W = q α(p;dbg). = q 0,05 (6;). = 4,75 x 0,0052 = 0,02 Interaksi perlakuan lama pengadukan dan bobot resin berpengaruh nyata terhadap rataan kadar asam nukleat larutan glikogen temilok 2% pada taraf 0,05. Lama pengadukan 16 jam dan persentase resin % adalah interaksi perlakuan terbaik dengan rataan kadar asam nukleat yang paling rendah yaitu sekitar 0,07 mg/ml.

10 64 Lampiran 10 Data pengukuran absorbansi sampel larutan glikogen temilok 2% Ulangan Gram KOH Gram Temilok Resin (%) Pengadukan (jam) A 260 A 280 A 320 I Blanko II Blanko III Blanko

11 65 Lampiran 11 Contoh perhitungan uji perbandingan berganda terhadap data konsentrasi DNA femur yang terpresipitasi. Sampel Ulangan I Ulangan II Ulangan III Rataan Simpangan Baku Sampel ,0340 0,0110 Blanko 0,0527 0,0427 0,0250 0,0401 0,0140 H0 : µ1=µ2 atau rataan konsentrasi DNA femur tertinggi yang terpresipitasi dengan penambahan glikogen sama dengan yang terpresipitasi tanpa penambahan glikogen (blanko), atau dengan kata lain µ1-µ2= 0 Ulangan Blanko dj dj 2 I 0,0415 0,0527 0,0415-0,0527 = -0,0117 0, II 0,0391 0,0427 0,0391-0,0427 = -0,0036 0, III 0,0214 0,0250 0,0214-0,0250 = -0,0036 0, ,0189, ( ) 2 =0, , t o = dengan S d 2 = = = -0,063 S d 2 = 0, S d = 0,0047, maka t o = = -23,2643 dengan α =0,05 maka t tabel = t α/2, n-1 = t 0,025; 2 = 4,303 karena t o < t tabel, maka keputusan yang diambil adalah gagal tolak Ho, artinya tidak ada peningkatan yield DNA femur yang signifikan setelah presipitasi DNA femur dengan penambahan larutan glikogen dari formula ekstraksi terbaik.