Buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur. Persiapan contoh. Serbuk contoh

Transkripsi

1 LAMPIRAN

2 20 Lampiran 1 Bagan alir penelitian Buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur Persiapan contoh pencucian perajangan pengeringan penggilingan Serbuk contoh Penetapan kadar air Ekstraksi air dan etanol Ekstrak air dan etanol Uji fitokimia Uji toksisitas dengan larva udang Uji inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Uji flavonoid total ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi (berdasarkan hasil uji fitokimia)

3 21 Lampiran 2 Bagan alir ekstraksi air Serbuk contoh Maserasi dengan air (1:8) 24 jam disaring Filtrat Ekstrak air dipekatkan Lampiran 3 Bagan alir ekstraksi etanol Serbuk contoh Maserasi dengan atanol 70% (1:8) 24 jam disaring Filtrat dipekatkan Ekstrak etanol

4 22 Lampiran 4 Bagan alir penentuan nilai LC 50 ekstrak dengan menggunakan larva udang air laut + telur udang (ditetaskan 48 jam) 0,1000 g ekstrak Dilarutkan dengan air laut Ditera dengan air laut hingga 25 ml Ekstrak 4000 ppm 1 10 ekor larva udang µl air laut µl larutan ekstrak (1000 ppm, triplo) 2 10 ekor larva udang µl air laut + 50 µl larutan ekstrak (100 ppm, triplo) 3 10 ekor larva udang µl air laut + 5 µl larutan ekstrak (10 ppm, triplo) 4 10 ekor larva udang µl air laut (kontrol, triplo) Dibiarkan 24 jam Jumlah larva udang yang mati dihitung Analisis menggunakan Probit Analysis Methode Nilai LC 50 ekstrak

5 23 Lampiran 5 Bagan alir uji in vitro inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas ekstrak contoh 15 µl minyak wijen 10 µl albumin 10% (b/v) µl lipase pankreas murni Ditera dengan buffer fosfat ph 8 hingga 1 ml inkubasi 45 menit, T=40 C + kloroform 3 ml dikocok disentrifusa selama 5 menit 1,0 ml lapisan kloroform + 4 ml kloroform-heptana (1:1) dikocok + 2,5 ml pereaksi tembaga dikocok selama 3 menit disentrifusa selama 10 menit 3,0 ml lapisan kloroform + 0,25 ml larutan Na-dietilditiokarbamat Larutan berwarna kuning serapan diukur pada λ = 435 nm Aktivitas hidrolitik lipase dan daya inhibisi ekstrak Lampiran 6 Prosedur pembuatan pereaksi tembaga (250 ml) Sebanyak 71,25 g NaCl dilarutkan dalam 150 ml akuades, kemudian ditempatkan pada labu takar 250 ml. Setelah itu, ke dalam larutan NaCl ditambahkan 6,04 g Cu(NO 3 ) 2.3H 2 O dan 21,25 g trietanolamin, lalu diaduk hingga larut. Selanjutnya ditambahkan 0,7125 ml asam asetat glasial dan ditera dengan akuades.

6 24 Lampiran 7 Bagan alir penentuan kadar flavonoid total ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi ditimbang setara dengan 200 mg serbuk sistem hidrolisis (refluks) 30 menit 1,0 ml larutan HMT 0,5% b/v 20 ml aseton 2 ml HCl 25% filtrat residu + 20 ml aseton tera dengan aseton labu takar 100 ml ekstrak filtrat dihidrolisis ekstraksi dalam corong pisah 20 ml ekstrak + 20 ml akuades + 15 ml etil asetat fraksi etil asetat ditampung dalam labu takar 50 ml ditera dengan etil asetat 10 ml fraksi etil asetat pada labu takar 25 ml + 1 ml AlCl 3 2% (b/v) ditera dengan asam asetat glasial 5% (v/v) larutan flavonoid contoh Fotometri pada λ = 370,8 nm Standar kuersetin 0; 0,5; 2,5; 5,0; 7,5; 10 ppm

7 25 Lampiran 8 Penentuan kadar air Kadar air asam gelugur Bobot cawan Bobot cawan + Bobot contoh Bobot contoh Kadar air kosong (g) contoh (g) basah (g) kering (g) (%) 19, ,9149 3, , ,4 19, ,0287 3, , ,6 23, ,9966 3, , ,2 Rerata 18,7 Kadar air lengkuas Bobot cawan Bobot cawan + Bobot contoh Bobot contoh Kadar air kosong (g) contoh (g) basah (g) kering (g) (%) 27, ,2443 2, ,0480 9,79 34, ,5686 2, ,3759 9,58 24, ,7002 2, ,5115 9,41 Rerata 9,59 Kadar air kencur Bobot cawan Bobot cawan + Bobot contoh Bobot contoh Kadar air kosong (g) contoh (g) basah (g) kering (g) (%) 30, ,2531 2, ,0797 8,66 34, ,5724 2, ,4007 8,58 28, ,6352 2, ,4642 8,55 Rerata 8,60 Perhitungan: Bobot sampel basah bobot sampel kering Kadar air (%) = 100% Bobot sampel basah

8 26 Lampiran 9 Rendemen berbagai ekstrak contoh dan perhitungan Contoh Ekstrak Bobot awal (g) Bobot ekstrak (g) Rendemen (%) Asam gelugur Lengkuas Kencur Perhitungan: Rendemen ekstrak = Air 100, , ,7 Etanol 100, , ,2 Air 100,0086 9, ,1 Etanol 100, , ,1 Air 100,0129 4,3682 4,78 Etanol 100,0251 6,9090 7,56 = Contoh perhitungan (ekstrak air asam gelugur ): Rendemen ekstrak = = bobot ekstrak (g) 100% faktor koreksi bobot contoh (g) bobot ekstrak (g) % bobot contoh (g) 100 kadar air bobot ekstrak (g) bobot contoh (g) 19,2366 g 100, 0570 g = 23,7 % % 100 kadar air % , 7

9 27 Lampiran 10 Aktivitas ekstrak terhadap larva A. Salina setelah 24 jam Konsentrasi Jumlah larva udang yang mati Contoh Ekstrak (ppm) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Blanko Asam Air gelugur Etanol Lengkuas Air Etanol Kencur Air Etanol

10 28 Lampiran 11 Data dan perhitungan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Konsentrasi Absorbans Aktivitas enzim Daya inhibisi Contoh Ekstrak Rerata (ppm) (µmol/l.menit) (%) Kontrol (-) 0 1,548 1,587 1,573 1,569 4, ,0 Asam Air 100 0,819 1,055 0,889 0,921 2, ,3 gelugur 150 0,993 0,979 0,765 0,912 2, , ,255 1,255 1,260 1,257 3, , ,175 1,389 1,313 1,292 3, , ,190 1,167 0,923 1,093 3, ,3 Etanol 100 1,051 0,849 0,854 0,918 2, , ,123 0,265 0,257 0,215 6, , ,130 1,063 1,370 1,188 3, , ,758 0,673 1,075 0,835 2, , ,812 1,161 1,278 1,084 3, ,9 Lengkuas Air 100 1,210 1,221 0,951 1,127 3, , ,102 0,920 1,169 1,064 3, , ,367 1,437 1,404 1,403 4, , ,156 1,154 1,001 1,104 3, , ,345 1,181 1,143 1,223 3, ,0 Etanol 100 0,633 0,845 0,945 0,808 2, , ,425 1,090 1,087 1,201 3, , ,473 0,768 0,820 0,687 2, , ,851 1,602 1,407 1,620 4, , ,580 1,839 1,813 1,744 5, ,2 Kencur Air 100 1,086 1,410 1,012 1,169 3, , ,602 1,565 1,757 1,641 5, , ,341 1,407 1,253 1,334 4, , ,053 0,953 1,010 1,005 3, , ,374 1,073 0,957 1,135 3, ,8 Etanol 100 1,319 1,160 1,125 1,201 3, , ,616 1,750 1,593 1,653 5, , ,460 1,218 1,313 1,330 4, , ,188 1,318 0,970 1,159 3, , ,132 0,779 1,025 0,979 3, ,6 Kontrol (+) 100 1,397 1,413 1,399 1,403 4, , ,821 1,783 1,959 1,854 5, , ,009 1,951 1,987 1,982 6, , ,900 2,036 1,876 1,937 5, , ,757 1,818 1,577 1,717 5, ,3

11 29 Lanjutan Lampiran 11 Perhitungan aktivitas enzim lipase Aktivitas enzim lipase pankreas (µmol/l,menit) A 1 volume zat pengekstrak = μmol standar B volume enzim (L) volume zat yang diukur Keterangan: A = absorbans sampel B = absorbans standar (asam oleat) = 0,041 µmol standar = jumlah standar oleat yang digunakan (4,25 µmol) Bobot standar = 0,0155 g [standar] = 0,0155 g 1,25 ml 10 3 ml 10 3 mg = 1, ppm 1L 1g 1 waktu(menit) [standar] setelah pengenceran ke dalam 1,00 ml V 1 M 1 = V 2 M 2 1, ppm 97,0 µl = 1,00 ml M 2 M 2 = 1, ppm 3 1,20 10 mg 1L µmol standar = 1mL 3 1L 10 ml = 4,25 µmol 1μ L Volume enzim = 100 µl = 100 µl 1mol 282,4614 g 6 = 1, L 10 L Volume zat pengekstrak = volume kloroform-heptana (1:1) = 4,0 ml Volume zat yang diukur = 3,0 ml Waktu = waktu inkubasi = 45 menit 1 g 3 10 mg 10 6 μmol 1mol Perhitungan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Daya inhibisi = Aktivitas enzim blanko - Aktivitas enzim Aktivitas enzim blanko ekstrak 100%

12 30 Lampiran 12 Perhitungan statistik ekstrak buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur a. Ekstrak air Daya inhibisi (%) ekstrak air asam gelugur dan lengkuas terhadap aktivitas lipase pankreas Ekstrak air Ulangan Yj Asam Gelugur Lengkuas Kencur 1 36,8 29,8 33,0 99,6 2 37,6 41,4 39,3 118,3 3 51,3 25,6 35,9 112,8 Yi 125,7 96,8 108,2 330,7 Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak air terhadap aktivitas xantin oksidase Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel Perlakuan 2 141,27 70,64 1,478 5,143 Galat 6 286,69 47,78 Total 8 427,96 H 0 : μ1 = μ2 = μ3 (semua perlakuan memberikan daya inhibisi yang sama terhadap aktivitas lipase pankreas) H 1 : μi μj (paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan daya inhibisi yang berbeda terhadap aktivitas lipase pankreas) FK = Y (330,7) = = 12151,39 p r (3 3) Σ Yi 125,7 + 96, ,2 JKP = FK = 12151,39 = 141,27 r 3 JKT = ΣΣ Yij 2 FK = (36, ,9 2 ) 12151,39 = 427,96 JKG = JKT JKP = ,67 = 286,69 JKP 141, KTP = = = 70,64 dbp 227 JKG 286, 69 KTG = = = 47,78 dbg 6 KTP F hitung = = 70,64 = 1,478 KTG 47, 78 F 0,05(2,6) = 5,143 Fhitung < Ftabel Kesimpulan : Terima H 0 (berarti ekstrak air asam gelugur, lengkuas, dan kencur memberikan pengaruh daya inhibisi yang tidak berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas) b. Ekstrak etanol (1 faktor daya inhibisi tertinggi) Daya inhibisi (%) ekstrak etanol terhadap aktivitas lipase pankreas Ulangan Ekstrak etanol Asam Gelugur Lengkuas Kencur Yj 1 92,1 69,5 26,9 188,5 2 82,9 50,4 49,8 183,1 3 83,4 47,1 33,8 164,3 Yi 258,4 167,0 110,5 535,9

13 31 Lanjutan Lampiran 12 Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak etanol terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel Perlakuan ,4 1856,7 17,910 5,143 Galat 6 622,02 103,67 Total ,42 Fhitung > Ftabel Kesimpulan : Tolak H 0 (berarti ekstrak etanol asam gelugur, lengkuas, dan kencur memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas) c. Uji statistika daya inhibisi maksimum dari ekstrak asam gelugur, lengkuas, dan kencur terhadap kontrol negatif dan positif Perlakuan: I : tanpa penambahan ekstrak (kontrol negatif) II : penambahan ekstrak etanol buah asam gelugur 150 ppm III : penambahan ekstrak etanol lengkuas 200 ppm IV : penambahan ekstrak etanol kencur 300 ppm V : penambahan Xenical 100 ppm (kontrol positif) Daya inhibisi (%) sample terhadap aktivitas lipase pankreas Ulangan Perlakuan I II III IV V ΣY j 1 0,00 92,1 69,5 26,9 9,9 198,4 2 0,00 82,9 50,4 49,8 8,8 191,9 3 0,00 83,4 47,1 33,8 9,7 174,0 ΣY i 0,00 258,4 167,0 110,5 28,4 564,3 µ 0,00 86,1 55,7 36,8 9,5 188,2 Analisis sidik ragam daya inhibisi sampel terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel Perlakuan , ,79 58,868 3,478 Galat ,71 62,271 Total ,86 H 0 : μ1 = μ2 = μ3 = μ4 = µ5 (semua perlakuan memberikan daya inhibisi yang sama terhadap aktivitas lipase pankreas) H 1 : μi μj (paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan daya inhibisi yang berbeda terhadap aktivitas lipase pankreas) FK = Y = (564,3) = 21228,97 p r (5 3) KTP F hitung = = 3665,79 = 58,868 KTG 62, 271 F 0,05(4,10) = 3,478 Fhitung > Ftabel Kesimpulan : Tolak H 0 (berarti perlakuan memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas)

14 32 Lanjutan Lampiran 12 Untuk melihat perlakuan mana yang memberikan pengaruh yang berbeda, dilakukan uji Duncan. Uji Duncan Rp = r 0,05 (p,dbg) KTG r Tolak Ho jika ýi - ýj > Rp R 2 = 3,15 4,94 = 15,57 R 3 = 3,30 4,94 = 16,30 R 4 = 3,37 4,94 = 16,65 R 5 = 3,43 4,94 = 16,94 Urutan perlakuan: ý1 ý2 = 10,6 < R 2 Terima Ho* ý1 ý3 = 37,6 > R 3 Tolak Ho ý1 ý4 = 56,2 > R 4 Tolak Ho ý1 ý5 = 86,3 > R 5 Tolak Ho ý2 ý3 = 27,0 > R 3 Tolak Ho ý2 ý4 = 45,6 > R 4 Tolak Ho ý2 ý5 = 75,7 > R 5 Tolak Ho ý3 ý4 = 18,6 > R 4 Tolak Ho ý3 ý5 = 48,7 > R 5 Tolak Ho ý4 ý5 = 30,1 > R 4 Tolak Ho Keterangan: * = tidak berbeda nyata ý 1 = 0 (kontrol negatif) ý 2 = 10,6 (kontrol positif) ý 3 = 37,6 (etanol kencur) ý 4 = 56,2 (etanol lengkuas) ý 5 = 86,3 (etanol asam gelugur) Kesimpulan: perlakuan yang berbeda nyata terdapat pada interaksi antara 1 kontrol negatif dengan ekstrak etanol kencur 2 kontrol negatif dengan ekstrak etanol lengkuas 3 kontrol negatif dengan ekstrak etanol asam gelugur 4 kontrol positif dengan ekstrak etanol kencur 5 kontrol positif dengan ekstrak etanol lengkuas 6 kontrol positif dengan ekstrak etanol asam gelugur 7 ekstrak etanol kencur dengan ekstrak etanol lengkuas 8 ekstrak etanol kencur dengan ekstrak etanol asam gelugur 9 ekstrak etanol lengkuas dengan ekstrak etanol asam gelugur

15 33 Lampiran 13 Kurva estimasi berbagai ekstrak contoh dan kontrol positif Contoh Ekstrak Kurva Persamaan garis R² Asam gelugur Air Logaritma y = -18,36 ln(x) + 126,19 0,4845 Linier y = -0, ,714 0,4088 Kuadratik y = 0,0013x² - 0,5928x + 92,49 0,6702 Power y = 654,31x --0,6002 0,4181 Exponensial y = 51,401e -0,003x 0,3401 Etanol Logaritma y = -19,215ln(x) + 146,39 0,1185 Linier y = -0,1216x + 70,249 0,1576 Kuadratik y = - 0,001x² + 0,2981x + 33,527 0,1986 Power y = 340,34x -0,4018 0,1314 Exponensial y = 67,411e -0,0024x 0,1567 Lengkuas Air Logaritma y = --6,1578 ln(x) + 56,715 0,0954 Linier y = -0,0299x + 30,498 0,0746 Kuadratik y = 0,0005x² - 0,229x + 47,925 0,1471 Power y = 92,654x -0,2676 0,0654 Exponensial y = 28,837e -0,0012x 0,0407 Etanol Logaritma y = -50,053 ln(x) + 284,41 0,5210 Linier y = -0,2925x + 81,245 0,5912 Kuadratik y = - 0,0017x² + 0,369x + 23,361 0,6573 Kencur Air Logaritma y = 13,183 ln(x) 49,002 0,1344 Linier y = 0,09x + 1,9087 0,2083 Kuadratik y = 0,0013x² - 0,4292x + 47,344 0,3599 Etanol Logaritma y = 17,521 ln(x) - 72,219 0,2256 Linier y = 0,1195x - 4,5228 0,3486 Kuadratik y = - 0,002x² - 0,6914x + 66,432 0,6997 Kontrol (+) Logaritma y = -21 ln(x) + 96,425 0,3756 Linier y = -0,09x + 4,6473 0,2294 Kuadratik y = 0,0628x² - 1,1973x + 101,54 0,9881

16 34 Lampiran 14 Data dan perhitungan penentuan kadar flavonoid total Larutan Konsentrasi (ppm) Absorbans Blanko 0,00 0,000 Standar 1 0,00 0,003 Standar 2 0,50 0,055 Standar 3 2,50 0,334 Standar 4 5,00 0,557 Standar 5 7,50 0,863 Standar 6 10,00 1,048 Ekstrak etanol lengkuas 0,24 0,050 Ekstrak etanol kencur 0,13 0, y = x R 2 = Absorbans [Kuersetin] (ppm) 12 Kurva standar kuersetin. Perhitungan kadar flavonoid total Persamaan regresi linear y = 0, ,1064 x, R² = 99,32% [Flavonoid] etanol lengkuas = 0,050-0,0245 0,1064 = 0,24 ppm Kadar flavonoid total ekstrak etanol lengkuas 0,24 mg 50 ml 100 ml 21,1% 1L = 25 ml = 0,08 % 1L 10 ml 20 ml 38,20 mg 3 10 ml [Flavonoid] etanol kencur = 0,038-0,0245 0,1064 = 0,13 ppm Kadar flavonoid total ekstrak etanol kencur 0,13 mg 50 ml 100 ml 7,56% 1L = 25 ml = 0,04 % 1L 10 ml 20 ml 13,82 mg 3 10 ml