PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN PerL DARI KEDELAI PEKA CEKAMAN ALUMINIUM AKHMAD AMIRULLAH

Transkripsi

1 PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN PerL DARI KEDELAI PEKA CEKAMAN ALUMINIUM AKHMAD AMIRULLAH DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 ABSTRAK AKHMAD AMIRULLAH. Pengklonan dan Karakterisasi Gen PerL dari Kedelai Peka Cekaman Aluminium. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO dan ENCE DARMO JAYA SUPENA. Peroksidase diketahui sebagai salah satu gen yang terinduksi oleh cekaman Aluminium (Al). Pada kedelai kultivar Lumut yang diberi cekaman ph 4 + Al 1,6 mm, terlihat adanya ekspresi gen peroksidase (PerL). cdna PerL telah diisolasi dari akar tanaman kedelai kultivar Lumut. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen peroksidase dari tanaman kedelai kultivar Lumut yang memiliki sifat peka terhadap cekaman Al. Keberadaan cdna PerL pada cdna total diamplifikasi dengan menggunakan primer spesifik yang didesain berdasarkan Arabidopsis thaliana (X71794). cdna PerL disisipkan ke dalam pgem -T Easy dan plasmid rekombinan telah berhasil diintroduksi ke dalam Escherichia coli galur DH5α. Pengurutan cdna PerL dengan DNA sekuencer ABI Prism Model 310 menghasilkan sekitar 1100 pb yang menyandikan 353 asam amino. Analisis kesejajaran lokal nukleotida dengan Per dari beberapa spesies yang terdaftar di GeneBank menunjukkan bahwa cdna PerL mempunyai persentase kemiripan sebesar 98% dengan DNA Per dari A. thaliana (X71794). Hasil penelusuran daerah domain terkonservasi menunjukkan bahwa asam amino PerL diduga termasuk ke dalam tipe secretory peroxidase. ABSTRACT AKHMAD AMIRULLAH. Cloning and Characterization of PerL Gene from Aluminum Sensitive-Soybean. Supervised by UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO and ENCE DARMO JAYA SUPENA. Peroxidase is known as one of the genes that induced by Aluminum (Al) stress. PerL gene was expressed under ph 4 + Al 1,6 mm stress. The PerL cdna had been isolated from soybean roots cv Lumut. The objective of this research was to characterize PerL gene from Al sensitivesoybean cv Lumut. The PerL cdna was isolated from total cdna using specific primers were designed based on Per gene of Arabidopsis thaliana (X71794). The PerL cdna was inserted into pgem -T Easy and introduced into Escherichia coli DH5α strain. Sequencing of PerL cdna using ABI Prism 310 automated DNA sequencer showed that PerL cdna has 1100 bp encoding 353 amino acids. Basic local alignment analysis based on nucleotide showed that PerL cdna has 98% similarity with Per of A. thaliana (X71794). Conserved domain of the PerL amino acids suggested that perl has a secretory peroxidase type.

3 PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN PerL DARI KEDELAI PEKA CEKAMAN ALUMINIUM AKHMAD AMIRULLAH Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

4 Judul Nama NRP : Pengklonan dan Karakterisasi Gen PerL dari Kedelai Peka Cekaman Aluminium : Akhmad Amirullah : G Menyetujui: Pembimbing I Pembimbing II Dr. Ir. Utut Widyastuti S, M.Si. NIP Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Dr. drh. Hasim, DEA. NIP Tanggal lulus :

5 PRAKATA Alhamdulillahirobbil aalamin. Segala puji bagi Allah SWT atas segala limpahan karunia- Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian ini dibiayai oleh Proyek Hibah Bersaing IX Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) atas nama Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono, M.Si. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono, M.Si dan Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. sebagai pembimbing atas segala bimbingan, waktu, sarana dan nasihat yang telah diberikan. Terima kasih kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. atas saran dan masukannya yang berguna dalam penyempurnaan tulisan ini. Terima kasih kepada Kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB Darmaga beserta seluruh staf dan karyawan atas sarana, prasarana, dan bantuannya selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium Biorin (Biotechnology Research Indonesia-the Netherland). Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Abdul Mulya, Mbak Pepi Elvafina, Thesiawaty Dian Fauziah, Bapak Syarifin Firdaus, M.Si., Bapak Muzuni, S.Si., M.Si., Bapak Drs. Y. Ulung Anggraito, M.Si., Bapak Yasir, S.Si., Mbak Rina, S.Si., M. Bahrelfi, S.Si., Syahnada Jaya, dan teman-teman seperjuangan di Laboratorium Biorin atas bantuan, kerjasama dan saran yang telah diberikan. Terima kasih juga penulis haturkan kepada teman-teman Biologi 38 yang tidak dapat disebutkan satu-persatu. Secara khusus penulis sampaikan terima kasih kepada orang tua, adik-adik, Nuryanti, dan Zahid Abdurrazzaq, atas kasih sayang dan perhatian kalian yang membuat penulis sangat bersemangat. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi agama, bangsa dan negaraku. Bogor, Juni 2008 Akhmad Amirullah

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 20 April 1984 dari ayah bernama Munawar dan ibu bernama Umi Kalsum. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 10 Bekasi dan diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut pertanian Bogor melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN). Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar pada semester genap tahun ajaran 2004/2005 dan semester ganjil 2005/2006. Penulis aktif di organisasi mahasiswa Dewan Keluarga Masjid Al Ghifari IPB sebagai Wakil Ketua pada tahun 2005/2006. Penulis pernah melaksanakan kegiatan praktik lapang pada tahun 2004 dengan topik Perbanyakan Anggrek secara In Vitro di Kebun Anggrek Parung. Pada tanggal 5 Januari 2007, penulis menikah dengan Nuryanti, dan pada tanggal 7 November 2007 penulis dikaruniai seorang putra diberi nama Zahid Abdurrazzaq.

7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... PENDAHULUAN Tujuan Penelitian... Waktu dan Tempat Penelitian... BAHAN DAN METODE Bahan... Metode... Amplifikasi cdna PerL dari cdna total kedelai lumut... Pengklonan cdna PerL ke dalam plasmid pgem -T Easy... Seleksi E. coli DH5α yang mengandung plasmid rekombinan... Analisis cdna sisipan... Sekuensing cdna PerL dan analisis urutan nukleotida... HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil... Amplifikasi cdna PerL... Pengklonan cdna PerL ke dalam plasmid pgem -T Easy... Analisis urutan nukleotida... Pembahasan... KESIMPULAN... DAFTAR PUSTAKA... LAMPIRAN... vii vii vi

8 DAFTAR GAMBAR Halaman Amplifikasi cdna PerL menggunakan primer spesifik. (1) 1 kb ladder, (2) PerL berukuran sekitar pb... Seleksi E. coli DH5α transforman pada media seleksi (ampisilin, X-gal, dan IPTG)... PCR koloni putih E. coli yang membawa PerL. (1) 1 kb ladder, (2), (3), dan (4) adalah koloni putih positif pembawa plasmid rekombinan... Pemotongan plasmid rekombinan. (1) 1 kb ladder, (2) plasmid rekombinan... Daerah domain terkonservasi pada urutan asam amino PerL DAFTAR LAMPIRAN 1 Peta fisik plasmid pgem -T Easy yang digunakan sebagai vektor pengklonan... Halaman Hasil sekuensing dengan menggunakan mesin sekuensing otomatis ABI PRISM 310 Genetic Analyzer... Perbandingan sekuen cdna PerL dari kedelai kultivar Lumut, DNA Per dari A. thaliana (X71794), dan Per dari Glycine max (L78163)... Urutan asam amino PerL dari kedelai kultivar Lumut, Per dari G. max (L78163), dan Per dari A. thaliana (X71794) vii

9 PENDAHULUAN Kedelai (Glycine max) merupakan salah satu komoditi pertanian dengan kandungan protein yang tinggi dan banyak disukai masyarakat. Hal ini ditunjukkan dari besarnya kebutuhan kedelai dalam negeri Indonesia yang mencapai 2 juta ton per tahun, sementara produksi kedelai dalam negeri hanya ton (Deptan 2008). Sehingga untuk memenuhi kebutuhan kedelai dalam negeri, Indonesia harus mengimpor kedelai dari negara lain. Upaya untuk meningkatkan produksi kedelai dalam negeri adalah melalui metode intensifikasi yaitu penggunaan kultivar unggul dan perbaikan teknik budidaya, maupun metode ekstensifikasi atau perluasan lahan pertanaman. Namun upaya ekstensifikasi terbentur dengan kondisi lahan di Indonesia. Lahan seluas 18,2 juta hektar di Indonesia memiliki ph rendah (masam), padahal lahan tersebut cukup potensial untuk dikembangkan sebagai lahan pertanian, khususnya untuk kedelai (Mulyani et al. 2003). Kondisi tanah masam dapat meningkatkan kelarutan ion Aluminium (Al) dalam bentuk ion Al 3+ sehingga dapat bersifat toksik bagi tanaman. Pada tanah masam, ion Al 3+ yang terakumulasi merupakan faktor penyebab utama yang membatasi tingkat keberhasilan panen (Kochian 1995), karena ion Al 3+ menghambat pertumbuhan akar tanaman (Gardner 1998). Cekaman ion Al 3+ diketahui dapat menginduksi beberapa gen yang berhubungan dengan sistem pertahanan terhadap oxidative stresses seperti peroksidase (Richards et al. 1998). Cekaman ion Al 3+ pada ujung akar tanaman dapat menyebabkan terjadinya proses peroksidasi lipid pada membran sel (Cakmak dan Horst 1991). Penentuan kadar cekaman Al untuk induksi gen didasarkan pada perbedaan panjang akar antara kontrol dengan perlakuan cekaman minimal sebesar 50% (Ryan et al. 1994). Kedelai kultivar Lumut (peka Al) mengalami penghambatan pertumbuhan panjang akar primer sampai 50% dengan penambahan Al sebesar 0,8-1,6 mm (Anwar 1999). Pada kedelai kultivar Lumut yang diberi cekaman ph 4 + Al 1,6 mm, terlihat adanya ekspresi gen peroksidase, tetapi cekaman Al tidak menyebabkan gen peroksidase terinduksi (Lubis 2008). Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen peroksidase (PerL) dari tanaman kedelai kultivar Lumut yang memiliki sifat peka terhadap cekaman Al. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2007 hingga Mei 2008, bertempat di Laboratorium Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Darmaga. Pengurutan nukleotida (sekuensing) dilakukan di Laboratorium Balai Pengkajian Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Serpong. Bahan cdna total kedelai kultivar Lumut yang digunakan sebagai cetakan, berasal dari hasil penelitian Lubis (2008). Plasmid pgem -T Easy (Lampiran 1) (Promega) digunakan sebagai vektor pengklonan dan Escherichia coli galur DH5α sebagai inang vektor rekombinan. Primer AtprxCb-F(1) (5 -TCAACTAG- TTTTGTTTTTCCTCTT-3 ) dan primer AtprxCb-R(1175) (5 -GTTCTCAAGTAAA- CGTCTTGAGAG-3 ) digunakan untuk mengamplifikasi cdna dari gen peroksidase kedelai kultivar Lumut. Primer AtprxCb-F dan AtprxCb-R didesain berdasarkan urutan nukloetida Arabidopsis thaliana (nomor akses GeneBank X71794). Primer SP6 (5 - ATTTAGGTGACACTATAGAA-3 ), T7 (5 -TAATACGACTCACTATAGGG-3 ), dan LP (5 -GGGGATTTCCAGTGATTG- AT-3 ) digunakan dalam pengurutan urutan nukleotida (sekuensing). Metode Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu amplifikasi cdna yang menyandikan gen PerL, pengklonan gen PerL ke dalam plasmid pgem -T Easy, pengurutan nukleotida PerL dan analisis urutan nukleotida. Amplifikasi cdna PerL dari cdna total kedelai kultivar Lumut cdna total kedelai kultivar Lumut digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi cdna gen PerL. Komposisi PCR adalah 1 µl cdna total, 2 µl buffer PCR 10x, 2 µl dntp 2 mm, 1 µl AtprxCb-F 20 pmol, 1 µl AtprxCb-R 20 pmol, 0.8 µl DMSO, 0.2 µl

10 2 enzim taq DNA polymerase 1 U (Gen Script Inc.) dan 12 µl ddh 2 O. Kondisi PCR yang digunakan adalah 95 C 5 menit untuk pra- PCR, siklus PCR diawali dengan 94 C 30 detik untuk denaturasi, 56 C 30 detik untuk penempelan primer, 72 C 2 menit untuk pemanjangan, selanjutnya siklus diulangi sebanyak 37 siklus, dan pasca PCR pada 72 C 5 menit diikuti dengan inkubasi pada 20 C 5 menit. Pengklonan cdna PerL ke dalam plasmid pgem -T Easy Pengklonan cdna PerL ke dalam pgem -T Easy menggunakan prosedur Promega (1996) dengan cara mencampurkan 1 µl buffer ligasi 10x, 1 µl vektor pgem -T Easy (20 ng/µl), 1 µl T4 DNA ligase (5 U/µl), 3 µl produk PCR dan 4 µl ddh 2 O, kemudian diinkubasi satu malam pada suhu 4 C. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α melalui transformasi menggunakan prosedur Suharsono (2002). Transformasi diawali dengan pembuatan bakteri kompeten, yaitu dengan membiakkan satu koloni E. coli DH5α dalam 2 ml LB (bakto tripton 1% (b/v), bakto ekstrak khamir 0.5% (b/v), NaCl 1% (b/v)) dan diinkubasi pada suhu 37 C dengan kecepatan bergoyang 250 rpm (environmental shaker ES-20, Biosan). Sebanyak 100 µl E. coli DH5α disubkultur dalam 30 ml LB kemudian diinkubasi dengan kondisi yang sama hingga mencapai densitas bakteri OD 600 = (4-7 x 10 7 sel/ml). Sebanyak 1.5 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung ependorf dan diinkubasi di dalam es 10 menit kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm dengan sentrifugasi (Jouan BR-4i) pada suhu 4 C selama 10 menit. Selanjutnya supernatan dibuang sedangkan endapan bakteri ditambahkan 495 µl (0.33 x volume kultur) buffer transformasi TB (PIPES 10 mm, CaCl 2.2H mm, KCl 250 mm, MnCl 2.4H 2 O 55 mm, ph 6.7) kemudian disuspensi dan diinkubasi dalam es selama 10 menit, disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan dibuang sedangkan endapan bakteri disuspensi dengan 41,25 µl TB kemudian ditambahkan 3.3 µl DMSO 4% dan diinkubasi dalam es selama 10 menit sehingga diperoleh sel kompeten. Tahap selanjutnya adalah introduksi plasmid rekombinan, yaitu sebanyak 50 µl bakteri kompeten dicampurkan dengan 10 µl ( ng) produk ligasi dan diinkubasi di dalam es selama 20 menit. Campuran diberi perlakukan kejutan panas 42 C selama 45 detik dan segera dimasukan kembali dalam es selama 5 menit. Campuran ditambahkan 100 µl YT (bakto tripton 16 g/l, bakto ekstrak khamir 10 g/l, NaCl 5 g/l, ph 7.0) dan diinkubasi dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37 C selama 20 menit. Kultur bakteri disebar secara merata pada media LA (LB + agar 15 g/l) yang mengandung ampisilin 100 µg/l,10 µl IPTG 100 mm, dan 50 µl X-gal 2% (b/v), kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 16 jam. Seleksi E. coli DH5α yang mengandung plasmid rekombinan E. coli DH5α yang membawa plasmid rekombinan diseleksi dengan seleksi putihbiru melalui penambahan X-gal dan IPTG. Koloni putih yang tumbuh pada media yang mengandung ampisilin, X-gal, dan IPTG merupakan koloni yang membawa plasmid rekombinan. Adanya sisipan cdna PerL di dalam plasmid rekombinan yang terdapat dalam koloni putih dideteksi dengan melakukan PCR koloni. Untuk itu koloni putih diambil dengan menggunakan tusuk gigi steril lalu disuspensikan ke dalam tabung PCR yang telah berisi 6.5 µl ddh 2 O, kemudian suspensi dipanaskan pada suhu 95 C selama 10 menit dan diinkubasi pada suhu 15 C selama 5 menit. Selanjutnya suspensi ditambahkan campuran PCR (komposisi dan kondisi PCR sama dengan tahap amplifikasi cdna PerL) lalu diamplifikasi menggunakan primer AtprxCb- F dan AtprxCb-R dengan mesin PCR. Tusuk gigi yang mengandung koloni putih juga dioleskan pada media LA + ampisilin (100 µg/ml) sebagai replika koloni. Bila produk PCR koloni menunjukkan munculnya pita yang berukuran sekitar 1100 pb, berarti cdna PerL di dalam plasmid rekombinan terdapat dalam koloni putih, maka selanjutnya replika koloni putih tersebut ditumbuhkan dalam 30 ml LB + ampisilin 100 µg/l dan diinkubasi pada suhu 37 C dengan kecepatan bergoyang 250 rpm selama 16 jam sebagai persiapan tahap isolasi plasmid. Analisis cdna sisipan Plasmid pgem -T Easy rekombinan di dalam E. coli DH5α diisolasi dengan mengikuti prosedur Suharsono (2002). Kultur bakteri yang sudah disiapkan, diambil

11 3 sebanyak 15 ml dan dimasukan ke dalam tabung falkon 15 ml, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan dibuang sedangkan endapan ditambahkan dengan 600 µl larutan suspensi sel (Tris-HCl 50 mm ph 7.5 dan EDTA 10 mm) kemudian divorteks. Selanjutnya campuran ditambahkan dengan 400 µl buffer lisis (NaOH 0.2 M dan SDS 1% (b/v)) dan dibolak-balik secara perlahan beberapa kali. Campuran ditambahkan dengan 400 µl larutan buffer netralisasi (Natrium asetat 1.32 M ph 4.8) kemudian divorteks dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan dipindah ke tabung ependorf baru dan selanjutnya diekstrak dengan penambahan PCI (fenol-kloroform-isoamilalkohol dengan perbandingan 25:24:1) sebanyak 1x volume supernatan. Kemudian divorteks dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm pada suhu 20 C selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung ependorf baru, lalu diendapkan dengan penambahan Natrium asetat 3 M ph 5.2 sebanyak 0.1x volume supernatan dan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan. Larutan diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam kemudian disentrifugasi dengan kecepatan rpm pada suhu 4 C selama 25 menit. Supernatan dibuang sedangkan endapan DNA plasmid dibilas dengan menggunakan etanol 70% (v/v) dengan bantuan sentrifugasi rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Endapan dikeringkan dan disuspensikan dengan ddh 2 O. Suspensi DNA plasmid ditambahkan RNase (100 µg/ml) sebanyak 0.1x volume suspensi dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 16 jam, kemudian suspensi ditambahkan dengan 500 µl ddh 2 O. Untuk mengeluarkan cdna sisipan, DNA plasmid rekombinan dipotong dengan enzim EcoRI (Promega Inc) dengan mencampur 50 ng/µl DNA plasmid, 1 µl enzim restriksi EcoRI 10 U, 2 µl buffer EcoRI 10x, dan 12 µl ddh 2 O kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 8 jam. Sekuensing cdna PerL dan analisis urutan nukleotida Sekuensing cdna PerL dilakukan dengan DNA sequencer ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Karena ukuran cdna PerL yang cukup panjang, yaitu 1100 pb, maka dalam proses ini digunakan primer T7, SP6, dan LP untuk mendapatkan urutan nukleotida yang lengkap. Analisis kesejajaran lokal urutan nukleotida gen PerL menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) ( nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) antara cdna PerL dengan DNA Per dari spesies lain yang terdapat di bank data di GeneBank. Urutan nukleotida cdna PerL diterjemahkan menjadi asam amino dengan menggunakan program expasy translate tool ( Analisis daerah terkonservasi dan domain pada cdna PerL dilakukan dengan menggunakan program conserved domain NCBI ( cdd/wrpsb.cgi). HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Amplifikasi cdna PerL Amplifikasi cdna PerL pada cdna hasil penelitian Lubis (2008) menunjukkan hasil positif, ditandai dengan munculnya pita yang berukuran sekitar 1100 pb (Gambar 1) pb 1 2 cdna PerL Gambar 1 Amplifikasi cdna PerL menggunakan primer spesifik. (1) 1 kb ladder, (2) PerL berukuran sekitar 1100 pb. Pengklonan cdna PerL ke dalam plasmid pgem -T Easy Pada media seleksi yang telah diinkubasi selama 16 jam, muncul koloni E. coli yang berwarna putih dan biru (Gambar 2). Dari lima koloni putih yang tumbuh pada media seleksi biru-putih, diambil tiga koloni untuk dilakukan PCR koloni. Hasil PCR koloni berukuran sama dengan hasil amplifikasi cdna PerL sebelumnya, yaitu sekitar 1100 pb (Gambar 3). Salah satu koloni putih (nomor 3 pada Gambar 3) dipilih untuk mengeluarkan cdna PerL dari plasmid rekombinan dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI. Hasil pemotongan menunjukkan adanya dua

12 4 fragmen yaitu fragmen berukuran sekitar 3000 pb yang merupakan plasmid pgem -T Easy, dan fragmen berukuran sekitar 1100 pb yang merupakan PerL (Gambar 4). Koloni putih Koloni biru Gambar 2 Seleksi E. coli DH5α transforman pada media seleksi (ampisilin, X-gal, dan IPTG) pb Gambar 3 PCR koloni putih E. coli yang membawa PerL. (1) 1 kb ladder, (2), (3), dan (4) adalah koloni putih positif pembawa plasmid rekombinan pb 1000 pb cdna PerL pgem -T Easy cdna PerL Gambar 4 Pemotongan plasmid rekombinan. (1) 1 kb ladder, (2) plasmid rekombinan. Analisis urutan nukleotida Sekuensing cdna PerL dengan menggunakan primer T7, SP6, dan LP menghasilkan urutan nukleotida cdna PerL lengkap (Lampiran 2). Hasil sekuensing kemudian dipisahkan dari nukleotida plasmid dengan memisahkan nukleotida sebelum primer AtprxCb-F dan sesudah primer AtprxCb-R. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan sekuen (urutan nukleotida) cdna PerL yang diawali dan diakhiri oleh primer spesifik. Analisis kesejajaran lokal sekuen cdna PerL dilakukan untuk melihat kesamaan dan kekerabatan dengan sekuen DNA Per dari berbagai spesies yang tersedia di GeneBank. Hasil analisis kesejajaran lokal sekuen cdna PerL menggunakan program BLAST, menunjukkan bahwa sekuen cdna PerL memiliki nilai kemiripan yang tinggi terhadap sekuen DNA Per dari A. thaliana (X71794). Tingkat keyakinan nilai kemiripan tersebut ditunjukkan oleh nilai persentase kemiripan (Max ident) sebesar 98 %, nilai bit score (BS) sebesar 2071 bits, dan nilai expectation value (E-value) sebesar 0 (nol). Sekuen DNA Per dari A. thaliana (X71794) dikopi dari GeneBank untuk disejajarkan dengan primer AtprxCb-F, AtprxCb-R, dan LP. Hal ini dilakukan untuk membandingkan sekuen DNA Per dari A. thaliana dengan sekuen cdna PerL. Hasil pensejajaran (Lampiran 3) menunjukkan bahwa DNA Per dari A. thaliana (X71794) memiliki sekuen primer AtprxCb-F, sedangkan pada cdna PerL terdapat perbedaan beberapa nukleotida primer AtprxCb-F, yaitu AtprxCb-F = TCAAC- TAGTTTTGTTTTTCCTCTT sedangkan cdna PerL = TCAACTAGTTTTGT- GTAAAACTT. Sekuen cdna PerL diterjemahkan menjadi asam amino dengan menggunakan program expasy translate tool. Lima kemungkinan urutan asam amino yang muncul, dipilih satu urutan asam amino yang memiliki banyak asam amino di antara kodon awal (ATG atau M) dan kodon akhir (TGA atau STOP) dan tidak memiliki kodon STOP di tengahnya. Urutan asam amino terpilih ini memiliki 353 asam amino (Lampiran 4). Penelusuran daerah domain terkonservasi pada urutan asam amino PerL dilakukan dengan menggunakan program conserved domain NCBI. Hasil penelusuran menunjukkan bahwa urutan asam amino PerL diduga termasuk ke dalam tipe secretory peroxidase (Gambar 5). Sebagai pembanding, digunakan hasil penelusuran daerah domain terkonservasi pada urutan asam amino Per dari Glycine max (L78163) dari GeneBank.

13 5 1 2 Gambar 5 Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara (1) PerL dan (2) Per G. max (L78163) dari GeneBank. Pembahasan Hasil pensejajaran sekuen cdna PerL memiliki nilai kemiripan yang tinggi terhadap sekuen DNA Per dari A. thaliana (X71794). Perbedaan terdapat pada sekuen primer AtprxCb-F, namun hal ini tidak mempengaruhi ekspresi gen PerL karena sekuen primer AtprxCb-F terletak pada enam nukleotida sebelum kodon awal (TCAACTAGTTTTGTGTAAAACTTTCA AAAATGCATTTCTC). Minimnya data tentang peroksidase kedelai di GeneBank menyebabkan tidak ada satupun peroksidase kedelai di GeneBank yang mirip dengan sekuen cdna PerL. Tentunya hal ini menandakan bahwa sekuen cdna PerL memiliki ciri khas tersendiri yang berbeda dengan peroksidase kedelai di GeneBank. Dari data peroksidase kedelai yang ada di GeneBank, dipilih sekuen DNA Per dari G. max (L78163) untuk digunakan sebagai pembanding. Sekuen cdna PerL sangat berbeda dengan sekuen DNA Per dari G. max (L78163), seperti yang tersaji pada Lampiran 3. Tentunya perbedaan juga terlihat pada urutan asam amino yang disandikan oleh kedua sekuen tersebut (Lampiran 4). Walaupun berbeda sekuen DNA dan urutan asam amino, ternyata PerL dan Per dari G. max (L78163) memiliki kesamaan pada daerah domain terkonservasi (Gambar 5). Urutan asam amino PerL dan Per dari G. max (L78163) diduga termasuk ke dalam tipe secretory peroxidase. Namun ada perbedaan letak secretory peroxidase pada kedua urutan asam amino tersebut. Pada PerL, secretory peroxidase dijumpai pada asam amino ke-31 sampai urutan ke-331. Sedangkan pada Per dari Glycine max (L78163), secretory peroxidase dijumpai pada asam amino ke-27 sampai urutan ke Peroksidase pada tumbuhan, fungi, dan bakteri, dapat dilihat sebagai anggota dari superfamily yang terdiri atas 3 kelas berdasarkan kemiripan sekuen (Welinder 1992). Peroksidase kelas I meliputi cytochrome c peroxidase (CCP) pada ragi, ascorbate peroxidase (AP), dan catalase - peroxidase pada bakteri. Peroksidase kelas II meliputi secretory peroxidase pada fungi seperti ligninase atau lignin peroxidases (LiPs). Peroksidase kelas III meliputi secretory peroxidase pada tumbuhan, dengan berbagai fungsi yang spesifik seperti menghilangkan hidrogen peroksida dari kloroplas dan sitosol, mengoksidasi senyawa toksik, biosintesis dinding sel, respon pertahanan terhadap pelukaan, katabolisme indole 3 acetic acid (IAA), dan biosintesis etilen. Dengan demikian, PerL diduga termasuk ke dalam Peroksidase kelas III. KESIMPULAN Analisis kesejajaran lokal urutan nukleotida menunjukkan bahwa cdna PerL dari kedelai kultivar Lumut memiliki nilai kemiripan yang tinggi terhadap DNA Per dari A. thaliana (X71794). PerL diduga termasuk ke dalam tipe secretory peroxidase. DAFTAR PUSTAKA Anwar S Pengklonan Gen-Gen yang Diinduksi oleh Aluminium pada Kedelai [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Cakmak I, Horst WJ Effect of aluminum on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max). Physiol Plant 83: [Deptan] Departemen Pertanian Pemerintah turunkan bea masuk kedelai. Jakarta: Departemen Pertanian. Gardner RC Manipulation of aluminum tolerance by gene transfer [review]. Hayati 5: Kochian LV Cellular mechanism of aluminum toxicity and resistance in

14 6 plants. Annu Rev Plan Physiol Plant Mol Bio 46: Lubis RA Ekspresi Gen Penyandi Protein Heterotrimerik Gα dan Peroksidase pada Kedelai Kultivar Lumut yang Mendapat Cekaman Aluminium [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Mulyani A, Hikmatullah, Subagyo H Karakteristik dan potensi tanah masam lahan kering di Indonesia, Prosiding Simposium Nasional Pemberdayaan Tanah Masam, Buku I. Bandar Lampung, September Puslitbang Tanah dan Agroklimat, Balitbangtan Deptan. Bogor. Promega Protocol and application guide. Ed. Ke-3. USA: Promega Co. Richards KD, Schott EJ, Sharma YK, Davis KR, Gardner RC Aluminum induce oxidative stress genes in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 116: Suharsono Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati 3: Welinder KG Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases. Curr Opin Struct Biol 2:

15 LAMPIRAN

16 Lampiran 1 Peta fisik plasmid pgem -T Easy yang digunakan sebagai vektor pengklonan 8

17 Lampiran 2 Hasil sekuensing PerL dari kedelai kultivar Lumut dengan menggunakan mesin sekuensing otomatis ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PerL T7) 9

18 Lanjutan Lampiran 2 (PerL SP6) 10

19 Lanjutan Lampiran 2 (PerL LP) 11

20 Lanjutan Lampiran 2 (PerL LP) 12

21 13 Lampiran 3 Perbandingan cdna PerL dari kedelai kultivar Lumut, DNA Per dari A. thaliana (X71794), dan Per dari Glycine max (L78163) > PerL dari kedelai kultivar Lumut TCAACTAGTT TTGTGTAAAA CTTTCAAAAA TGCATTTCTC TTCGTCTTTA ACATTGTCCA CTTGGACAAT CTTAATCACA TTGGGATGTC TTATGCTTCA TGCATCTTTG TCCGCTGCTC AACTCACCCC TACCTTCTAC GATAGGTCAT GTCCTAATGT CACTAACATC GTACGAGAAA CCATTGTAAA TGAGTTAAGG TCGGACCCTC GTATCGCTGC GAGCATCCTT CGTCTTCACT TCCACGACTG CTTTGTTAAT GGTTGTGACG CATCCATCTT GTTAGACAAC ACGACATCAT TTCGAACAGA GAAAGATGCG TTTGGAAACG CAAATTCGGC TCGGGGATTT CCAGTGATTG ATAGAGTGAA AGCTGCGGTG GAAAGGGCAT GCCCAAGAAC CGTTTCATGC GCAGATATGC TCACCATTGC AGCTCAACAA TCTGACACTT TGGCAGGAGG TCCTTCTTGG AGGGTTCCTT TGGGAAGGAG AGACAGTTTA CAAGCATTCC TGGAACTCGC TAATGCAAAT CTTCCAGCTC CATTCTTTAC ACTTCCACAA CTTAAAGCCA GCTTCAGAAA TGTTGGTCTC GATCGTCCTT CTGATCTCGT TGCTCTCTCC GGTGGTCACA CATTTGGTAA AAATCAATGT CAGTTTATTC TTGACAGATT ATACAATTTC AGCAACACAG GTTTACCCGA CCCTACACTC AACACTACTT ACCTCCAAAC TCTTCGTGGA CTATGCCCCC TTAATGGCAA TCGGAGTGCC TTGGTAGATT TTGATCTACG TACGCCTACG GTTTTCGACA ACAAATACTA CGTGAATCTC AAAGAGCGAA AGGGTCTTAT CCAGAGCGAC CAAGAGTTGT TCTCTAGCCC CAATGCCACT GACACAATCC CCTTGGTGAG AGCATATGCT GATGGCACAC AAACATTCTT CAATGCATTT GTGGAGGCAA TGAATAGGAT GGGAAACATT ACACCAACTA CAGGAACTCA AGGACAAATC AGATTGAACT GTAGAGTTGT GAACTCCAAC TCTCTGCTCC ATGATGTGGT GGATATCGTT GACTTTGTTA GCTCTATGTG AGAATTGTTT ACCCAATATG TGGCTACAAG AATACATATA TATTAATGAA TAAAACTCTC AAGACGTTTA CTTGAGAAC >Per dari A. thaliana (X71794) TCAACTAGTT TTGTTTTTCC TCTTTCAAAA ATGCATTTCT CTTCGTCTTC AACATCGTCC ACTTGGACAA TCTTAATCAC ATTGGGATGT CTTATGCTTC ATGCATCTTT GTCCGCTGCT CAACTCACCC CTACCTTCTA CGATAGGTCA TGTCCTAATG TCACTAACAT CGTACGAGAA ACCATTGTAA ATGAGTTAAG GTCGGACCCT CGTATCGCTG CGAGCATCCT TCGTCTTCAC TTCCACGACT GCTTTGTTAA TGGTTGTGAC GCATCCATCT TGTTAGACAA CACGACATCA TTTCGAACAG AGAAAGATCG GTTTGGAAAC GCAAATTCGG CTCGGGGATT TCCAGTGATT GATAGAATGA AAGCTGCGGT GGAGAGGGCA TGCCCAAGAA CCGTTTCATG CGCAGATATG CTCACCATTG CAGCTCAACA ATCTGTCACT TTGGCAGGAG GTCCTTCTTG GAGGGTTCCT TTGGGAAGGA GAGACAGTTT ACAAGCATTC CTGGAACTCG CTAATGCAAA TCTTCCAGCT CCATTCTTTA CACTTCCACA ACTTAAAGCC AGCTTCAGAA ATGTTGGTCT CGATCGTCCT TCTGATCTCG TTGCTCTCTC CGGTGGTCAC ACATTTGGTA AAAATCAATG TCAGTTTATT CTTGACAGAT TCTACAATTT CAGCAACACA GGTTTACCCG ACCCTACACT CAACACTACT TACCTCCAAA CTCTTCGTGG ACTATGCCCC CTTAATGGCA ATCGAAGTGC CTTGGTAGAT TTTGATCTAC GTACGCCTAC GGTTTTCGAC AACAAATACT ACGTGAATCT CAAAGAGCGA AAAGGTCTTA TCCAGAGCGA CCAAGAGTTG TTCTCTAGCC CCAATGCCAC TGACACAATC CCCTTGGTGA GAGCATATGC TGATGGCACA CAAACATTCT TCAATGCATT TGTGGAGGCA ATGAATAGGA TGGGAAACAT TACACCAACT ACAGGAACTC AAGGACAAAT CAGATTGAAC TGTAGAGTTG TGAACTCCAA CTCTCTGCTC CATGATGTGG TGGATATCGT TGACTTTGTT AGCTCTATGT GAGAATTGTT TACCCAATAT GTGGCTACAA GAATACATAT ATATTAATGA ATAAAACTCT CAAGACGTTT ACTTGAGAAC > Per dari G. max (L78163) ATGGGTTCCA TGCGTCTATT AGTAGTGGCA TTGTTGTGTG CATTTGCTAT GCATGCAGGT TTTTCAGTCT CTTATGCTCA GCTTACTCCT ACGTTCTACA GAGAAACATG TCCAAATCTG TTCCCTATTG TGTTTGGAGT AATCTTCGAT GCTTCTTTCA CCGATCCCCG AATCGGGGCC AGTCTCATGA GGCTTCATTT TCATGATTGC TTTGTTCAAG GTTGTGATGG ATCAGTTTTG CTGAACAACA CTGATACAAT AGAAAGCGAG CAAGATGCAC TTCCAAATAT CAACTCAATA AGAGGATTGG ACGTTGTCAA TGACATCAAG ACAGCGGTGG AAAATAGTTG TCCAGACACA GTTTCTTGTG CTGATATTCT TGCTATTGCA GCTGAAATAG CTTCTGTTCT GGGAGGAGGT CCAGGATGGC CAGTTCCATT AGGAAGAAGG GACAGCTTAA CAGCAAACCG AACCCTTGCA AATCAAAACC TTCCAGCACC TTTCTTCAAC CTCACTCAAC TTAAAGCTTC CTTTGCTGTT CAAGGTCTCA ACACCCTTGA TTTAGTTACA CTCTCAGGTG GTCATACGTT TGGAAGAGCT

22 CGGTGCAGTA CATTCATAAA CCGATTATAC AACTTCAGCA ACACTGGAAA CCCTGATCCA ACTCTGAACA CAACATACTT AGAAGTATTG CGTGCAAGAT GCCCCCAGAA TGCAACTGGG GATAACCTCA CCAATTTGGA CCTGAGCACA CCTGATCAAT TTGACAACAG ATACTACTCC AATCTTCTGC AGCTCAATGG CTTACTTCAG AGTGACCAAG AACTTTTCTC CACTCCTGGT GCTGATACCA TTCCCATTGT CAATAGCTTC AGCAGTAACC AGAATACTTT CTTTTCCAAC TTTAGAGTTT CAATGATAAA AATGGGTAAT ATTGGAGTGC TGACTGGGGA TGAAGGAGAA ATTCGCTTGC AATGTAATTT TGTGAATGGA GACTCGTTTG GATTAGCTAG TGTGGCGTCC AAAGATGCTA AACAAAAGCT TGTTGCTCAA TCTAAATAAA CCAATAATTA ATGGGGATGT GCATGCTAGC TAGCATGTAA AGGCAAATTA GGTTGTAAAC CTCTTTGCTA GCTATATTGA AATAAACCAA AGGAGTAGTG TGCATGTCAA TTCGATTTTG CCATGTACCT CTTGGAATAT TATGTAATAA TTATTTGAAT CTCTTTAAGG TACTTAATTA ATCA

23 15 Lampiran 4 Urutan asam amino PerL dari kedelai kultivar Lumut, Per dari G. max (L78163), dan Per dari A. thaliana (X71794) PerL MHFSSSLTLS TWTILITLGC LMLHA--SLS AAQLTPTFYD Per dari G. max (L78163) MGSM RLLVVALLCA FAMHAGFSVS YAQLTPTFYR Per dari A. thaliana (X71794) MHFSSSSTSS TWTILITLGC LMLHA--SLS AAQLTPTFYD PerL RSCPNVTNIV RETIVNELRS DPRIAASILR LHFHDCFVNG Per dari G. max (L78163) ETCPNLFPIV FGVIFDASFT DPRIGASLMR LHFHDCFVQG Per dari A. thaliana (X71794) RSCPNVTNIV RETIVNELRS DPRIAASILR LHFHDCFVNG PerL CDASILLDNT TSFRTEKDAF GNANSARGFP VIDRVKAAVE Per dari G. max (L78163) CDGSVLLNNT DTIESEQDAL PNINSIRGLD VVNDIKTAVE Per dari A. thaliana (X71794) CDASILLDNT TSFRTEKDRF GNANSARGFP VIDRMKAAVE PerL RACPRTVSCA DMLTIAAQQS DTLAGGPSWR VPLGRRDSLQ Per dari G. max (L78163) NSCPDTVSCA DILAIAAEIA SVLGGGPGWP VPLGRRDSLT Per dari A. thaliana (X71794) RACPRTVSCA DMLTIAAQQS VTLAGGPSWR VPLGRRDSLQ PerL AFLELANANL PAPFFTLPQL KASFRNVGLD RPSDLVALSG Per dari G. max (L78163) ANRTLANQNL PAPFFNLTQL KASFAVQGLN -TLDLVTLSG Per dari A. thaliana (X71794) AFLELANANL PAPFFTLPQL KASFRNVGLD RPSDLVALSG PerL GHTFGKNQCQ FILDRLYNFS NTGLPDPTLN TTYLQTLRGL Per dari G. max (L78163) GHTFGRARCS TFINRLYNFS NTGNPDPTLN TTYLEVLRAR Per dari A. thaliana (X71794) GHTFGKNQCQ FILDRFYNFS NTGLPDPTLN TTYLQTLRGL PerL CPLNGNRSAL VDFDLRTPTV FDNKYYVNLK ERKGLIQSDQ Per dari G. max (L78163) CPQNATGDNL TNLDLSTPDQ FDNRYYSNLL QLNGLLQSDQ Per dari A. thaliana (X71794) CPLNGNRSAL VDFDLRTPTV FDNKYYVNLK ERKGLIQSDQ PerL ELFSSPNATD TIPLVRAYAD GTQTFFNAFV EAMNRMGNIT Per dari G. max (L78163) ELFSTP-GAD TIPIVNSFSS NQNTFFSNFR VSMIKMGNIG Per dari A. thaliana (X71794) ELFSSPNATD TIPLVRAYAD GTQTFFNAFV EAMNRMGNIT PerL PTTGTQGQIR LNCRVVNSNS LLHDVVDIVD FVSSMS---- Per dari G. max (L78163) VLTGDEGEIR LQCNFVNGDS FGLASVASKD AKQKLVAQSK Per dari A. thaliana (X71794) PTTGTQGQIR LNCRVVNSNS LLHDVVDIVD FVSSM-----