III. BAHAN DAN METODE

Transkripsi

1 III. BAHAN DAN METODE 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 10 bulan mulai Januari sampai Oktober 2005 bertempat di Laboratorium Biorin (Biotechnology Research Indonesian The Netherlands), Biologi Seluler dan Molekuler Tanaman, Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor (PPSHB-IPB) dan Laboratorium Genetika Ikan, Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu kelautan (FPIK), IPB Bahan dan Alat a. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah organ hipofisa dari 6 ekor ikan kerapu bebek (c. altivelis). b. Bahan-bahan kimia dan peraiatan untuk isolasi RNA total, sintesis edna dan sekuensing (Lampiran 1) Metode Penelitian Penelitian mcngenai isolasi dan karakterisasi edna hormon pertumbuhan ikan kerapu bebek dilakukan melalui beberapat tahap (Gambar 5) yaitu : isolasi RNA total, sintesis edna, kloning ke pgemt-easy, transformasi ke E. coli DHsu, identiftkasi transforman dan sekuensing Isolasi RNA total Ikan kerapu bebek yang masih hidup berukuran g (6 ekor) dipotong bagian kepalanya. Hipofisa dikeluarkan seeara aseptis dan seeepatnya disimpan dalam botol sampel dengan bantuan nitrogen eair, selanjutnya dilakukan ekstraksi RNA. Apabila pelaksanaan ekstraksi masih lama, sampel disimpan pada suhu -20 Dc. Isolasi RNA menggunakan GIT (Guanidine Isothiocyanate) mengikuti metode Suharsono (2002). Untuk meminimalkan pengaruh RNAse dari bahan kimia, alat dan tubuh manusia, bahan isolasi RNA diperlakukan dengan air bebas nuklease (air-depc). Alat-alat yang digunakan disterilisa~i pada suhu 121 C selama 15 menit. SelaIlla proses isolasi selalu menggunakan sarung tangan dan kondisi dingin, di atas permukaan es.

2 14 Pituitari kerapu bebek ~ Isolasi RNA total ~ Sintesis edna dengan RT-PCR Kuantifikasi dengan - spektophotometer I-- Kuantifikasi dengan - elektroforesis Desain primer : Program Primer3 berdasarkan gen GH dari ikan sekerabat, vang terkonservasi. Primer lkf Forward: 5 cagacctgatcccagacca 3 Primer IKF Reverse: 5'ctacagggtacagttggcctca 3' Metode RT -PCR: Suharsono et al KIoning ke pgemt -easy Transformasi ke E. coli DH5a. Identifikasi Transforman Seleksi bim putih PCR koloni putih Isolasi plasmid rekombinan Digesti dengan Eco RI J Sekuensing Analisa similaritas Analis domain Gambar 5. Diagram alir penelitian Organ pituitari dari 6 ekor ikan kerapu bebek digcrus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair hingga menjadi tepung, kemudian dirnasukkan ke tabung steril yang berisi ml buffer ekstraksi GIT pada tabung falkon 50 ml. Selanjutnya, tabung disentrifugasi pada 3000 rpm selarna 10 menit, kemudian

3 15 supernatannya diarnbij dan disentrifugasi lagi pada rpm selarna 10 menit 4 c. Tabap selanjutnya adalah membuat gradien 1.5 ml CsCl: 1 ml CsCIIGIT (1:1) (200 III x 5) dan bertabap 200 III supematan, kemudiandisentrifugasi rpm selarna 20 jam pada suhu 20 C. Pelet yang terbentuk ditarnbab dengan 600 III 0,5% SDS (b/v) - 10mM Tris-HCl ph 7.5 dan disuspensikan. Carnpuran diekstraksi dengan fenol klorofom (1:1) dan disentrifugasi rpm, selarna 5 menit (bisa dilakukan hingga 2 kali). Fase eair yang terbentuk ditambab 2.5 x volume EtOH absolut dan 0.25 M NaOAC ph 4, kemudian diaduk perlahan. Inkubasi pada suhu -45 GC selama 15 menit. Presipitasikan dengan sentrifugasi rpm selarna 20 menit. Endapan yang terbentuk dibilas dengan EtOH 70% (v/v), dikeringkan dan diresuspensikan dengan DEPC 0.1 %. Kualitas dan kuantitas RNA total hasil isolasi dapat diketabui dengan analisis kemumian dan kandungan RNA dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 (1..260) dan 280 (1..280). Kemumian RNA yang baik ditunjukkan oleh nilai rasio lebih besar atau sarna dengan 1.80 (kemumian RNA terhadap penyangga reaksi) dan rasio lebih besar atau sarna dengan 2.00 (kemurnian RNA terhadap protein). Kandungan RNA ditentukan dari pengukuran pada (pada panjang gelombang 260, ssdna = 40 Ilglml). Selanjutnya dilakukan elektroforesis pada gel agarose 1 % (b/v) dengan lox buffer MOPS, voltase 100 volt selarna 45 menit. Visualisasi RNA dilakukan di atas transluminator GelDoe (Labquip) dan difoto menggunakan kamera digital fl.8 Full bright (olympus). Adanya pita unit-unit RNA ribosom menunjukkan keberhasilan isolasi RNA Sintesis edna dengan RT -per Sintesis edna GH menggunakan paket sintesis edna SuperScrip?M Double-Stranded edna Synthesis Kit dari Invitrogen. Kit ini memiliki kemampuan SuperSeriplMII Rnase H rewrse transcriptase pada reaksi strand pertama. RT-PCR (Reverse Transcriptase per) dari RNA total pituitari ikan kerapu bebek menggunakan primer spesifik yang terkonservasi dari 6 aksesi dari data Genbank, yaitu : Epinephelus akaara (nomor akses : A Y326406), E. awoara

4 16 (AF23271 I), E. coioides (AY038606, A Y513647, AF376771) dan Sebastes schlegeli (A Y542484). Primer yang didapatkan dari program analisa Primer3 adalah IKF Forward 5' cagacctgatcccagacca 3' (\ 9 pb) dan IKR Reverse 5' ctacagggtacagttggcctca 3' (22 pb) dengan panjang sekuen yang diharapkan adalah 615 pb (Lampiran 2). Satu mikrogram RNA total digunakan sebagai sampel untuk RT, kemudian dicampur dengan 2x campuran reaksi (reaction mixture) 25 Ill, 0.5 III primer forward maupun reverse (20 pmolllll), Taq enzym I Ill, 1.2 III MgS04 (2.5 mm) kemudian diiambahkan air DEPC sehingga mencapai volume akhir 50 Ill. Proses RT-PCR (PTC_IOO dari MJ Research Inc.) dijalankan pada suhu 45 C (30 menit); 92 c (2 menit) sebanyak I siklus; (92 C,15 detik; 45 C, 30 detik; 68 C, I menit 30 detik) sebanyak 35 siklus dan 72 c (5 menit) Kloning edna ke dalam pgemt-easy cdna yang berhasil disintesis, disisipkan ke dalam pgem -T Easy (Lampiran 3) mengikuti prosedur Promega (2003). Vektor pgem -T Easy dan Control insert DNA disentrifuse agar kandungannya terkumpul pada dasar tabung, selanjutnya reaksi ligasi dicampur pada tabung dengan komposisi yaitu : 2 x rapid ligase buffer 5 Ill, I III Vektor pgem -T Easy (SOng), I III T4 DNA ligase (3 weiss units/ill) dan produk RT-PCR sebanyak 3 Ill. Tahap berikutnya adalah campuran reaksi diinkubasi semalam pada suhu 4 C Transformasi ke bakteri E. coli DHSa Pembuatan Bakteri Kompeten. Metode yang dilakukan mengikuti Suharsono (2002). Sebuah koloni bakteri E.coli DHsu diambil dari biakan di media SOB dan dikultur dalam 2 ml medium cair LB (digunakan tabung 50 ml), selanjutnya diinkubasi semalam pada suhu 37 C pada shaker (275 rpm). Hasil kultur sebanyak 200 III dicampur dengan 2 ml LB, diinkubasi 2-3 jam hingga mencapai OD 60o = Setelah itu, masukkan ke dalam tabung ependorf 1.5 ml dan diinkubasi pada es selama 10 menit. Bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada rpm selama 10 menit, pada suhu 4 C. Cairannya dibuang dan endapannya disuspensikan dalam 495

5 17 III (0.3 volume asal) bufer transformasi (TFB) dengan vortex pelan-pelan. Di inkubasikan dalam es 10 menit. Disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 C untuk pengendapannya. Cairan dibuang, endapan disuspensikan dalam TFB III (0.08 volume asal). Kemudian ditambahkan DMSO sebanyak 3.3 III (7-8 % volume dari 1112 volume TFB), go yang dan biarkan di dalam es selama 10 menit. Bakteri siap untuk ditransformasi. Transformasi. Sel kompeten (E. coli DHsu) yang siap ditransformasi dimasukkan dalam es, biarkan sebentar agar mencair. Selanjutnya, diambil 100 III bakteri kompet~n dan ditambahkan ng cdna (volume 10 ~t!) dan inkubasi dalam es selama menit. Campuran tersebut diberi kejutan panas pada suhu 42 C selama 45 detik (jangan digoyang), kemudian diletakkan dalam es selama 5 menit. Pindahkan ke suhu ruang, ditambahkan 100 III medium 2 x YT/SOB dan diinkubasikan pada suhu 37 C dengan shaker pada kecepatan 250 rpm selama 20 menit III bakteri tersebut disebar pada medium selektif yang mengandung ampicillin (100 Ilg/ml). Untuk menyeleksi adanya sisipan di dalam plasmid yang mengandung gen lacz, tambahkan 0.1 M IPTG (10 Ililcawan) dan 2% X-gal (50 Ililcawan) pada permukaan medium. Bakteri yang mengandung plasmid, berisi fragmen yang disisipkan pada situs pengklonan (MCS) di daerah lacz, akan membentuk koloni berwarna putih, sedangkan bakteri yang mengandung plasmid yang di dalam MCS di daerah lacz tidak tersisipi fragmen DNA akan menghasilkan koloni berwama biru. Bakteri yang tidak mengandung plasmid akan mati (tidak membentuk koloni). Kultur di inkubasikan semalam pada suhu 37 C. Bakteri yang telah tertransformasi diperbanyak dalam medium LB yang mengandung antibiotik (100 Ilg/ml ampicilin). lnkubasikan pada 37 C. Bakteri siap digunakan dalam perbanyakan plasmid Identifikasi Transforman Plating dan per. Koloni yang berwarna putih (GH rekombinan) dilakukan pengujian kembali dengan pembuatan plating koloni dan PCR. Koloni putih diambil dengan tusuk gigi steril kemudian digoreskan pada media LA + amp, lalu masukkan tusuk gigi ke tabung PCR dan goreskan kembali

6 18 pada media. Adapun Prosedur PCR yang dilakukan adalah sebagai berikut : Koloni berwarna putih yang sudah diplating dieampurkan ke dalam 7.15 III ddh 2 0, kemudian dilakukan hot start PCR pada suhu 95 C,IO menit dan 15 C selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan buffer 1 Ill; 0.5 III primer maju (forward) maupun mundur (reverse) (20 pmovlll), 0.05 III taq enzym (5 U/lll) dan 0.8 III dntp (25 mm). Proses PCR dijalankan pada suhu 94 C (2 menit) sebanyak 1 siklus; (94 C,30 detik; 45 C, 30 detik; 68 C, 1 menit 30 detik) sebanyak 30 siklus dan 72 c (5 menit). Isolasi plasmid. Plasmid pgem -T Easy yang mengandung edna diisolasi dari bakteri E coli mengikuti prosedur Suharsono (2002). Satu koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan di dalam 2 ml media luria bertani (LB) (10 gil tripton, 5 gil ekstrak khamir, 10 gil NaCl, ph 7.5) yang mengandung ampisilin 100 mgll pada inkubator bergoyang (250 rpm) pada suhu 37 C selama semalam. Bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada rpm (Jouan BR-4i) pada suhu 4 c selama 10 menit. Peletlendapan yang terbentuk ditambahkan dengan 250 III buffer resuspensi, divortek, kemudian ditambahkan 250 III but"ier!isis dan 250 III buffer netralisasi dan dibolak-balik. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan rpm pada suhu 4 c selama 20 menit. Supernatan/cairan yang terbentuk ditarnbahkan dengan 0.1 V NaOAe 3 MpH 5.2! 0.25 V NaOAe 2 M dan 2 kali volume EtOH absolut, kemudian diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam. Setelah itu sentrifuse dengan kecepatan rpm pada suhn 4 c selama 30 menit, kemudian endapan dieuei dengan 600 III Et OH 70% dan sentrifuse kembali dengan kecepatan rpm pada suhu 4 c selama 20 memt. Pelet yang terbentuk dikeringkan, dan ditambahkan TE sebanyak 15 Ill. Guna menghilangkan sisa-sisa RNA, tambahkan RNase (l00 Ilglml) dan inkubasi pada suhu 37 C sclama semalam. Selanjutnya tambahkan TE hingga volume akhlr 500 Ill, kemudian diekstraksi dengan fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24: 1) sebanyak 1 kali volume. Larutan disentifugasi pada kecepatan rpm pada suhu 20 C selama 10 menit. Cairan yang terbentuk pada bagian atas dipindahkan dan selanjutnya dipresipitasi dengan penambahan natrium asetat 3M, ph 5.2 sebanyak 0.1 volume dan ethanol absolut 2 volume dan

7 19 diinkubasi pada suhu -20 C selama 2 jam. DNA plasmid diendapkan dengan sentrifugasi pada keeepatan rpm, suhu 4 c selama 20 menit. DNA plasmid dibilas dengan ethanol 70% (v/v) dan dikeringkan dengan vakum. DNA disuspensikan di dalam H20. Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi EcoRI. Plasmid pgem"'-t Easy rekombinan dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRi (Promega) untuk mengeluarkan sisipan edna GH dari vektornya. Sebanyak 1 J.!g DNA plasmid dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1500 J.!I, kemudian ditambah 0.5 J.!I enzim EcoRI (20 U/J.!I), 2 J.!I (IX buffer reaksi), dan ditambah ddh20 steril hingga volume akhirnya menjadi 20 J.!l. Campuran reaksi ini diinkubasi pada suhu 37 C selama semalam Pengurutan edna Pengurutan DNA dilakukan terhadap klon-klon edna GH terpilih menggunakan prosedur Sanger et al. (1977) yang didasarkan pada "dideoxynucleotide chain-termination" menggunakan mesin otomatis ABI PRISM Analisis Data Urutan nukleotida yang diperoleh dari hasil sekuensing dilakukan analisis dengan program Bioedit guna mendapatkan sekuen edna GH. Selanjutnya dilakukan analisis kesamaan (Similarity) dengan menggunakan software BlastN (Basic Local Alignment Search Tool) untuk nukleotida dan BlastP untuk protein. Matrik kesamaan antara spesies hasil BlastN maupun BlastP dianalisis menggunakan software sequence identitiy matrix pada program Bioedit dengan urutan program sebagai berikut : BlastNIP, Format Fasta, Kesejajaran (alignment), Bioedit. Kesejajaran nukleotida dan protein deduksi edna GH dianalisis dengan program ClustalW di web \','WW.ebi.ae.uk/c\ustalw/index.html. Untuk melakukan kesejajaran, urutan DNA atau asam arnino dituliskan kembali dalam format Fasta (Pearson 1990) dan disimpan sebagai suatu file teks menggunakan NOTEPAD. Pohon filogenetik disusun berdasarkan urutan asam amino yang dideduksi dari edna GH menggunakan program TreeCon. Komposisi asam amino dari sekuen edna GH dianalisis menggunakan program Bioedit dengan urutan keija yaitu : Sequence, Protein, Amino Acid Composition. Analisa domain protein deduksi

8 20 edna GH menggunakan program Prosite Database di web Peta restriksi edna GH dianalisis menggunakan program NEBcutter pada web \\ \\\\.tc,"ls.neh.com!nebclittcr7!inde'(.php.