KARAKTERISASI ZAT ANTIMIKROB PENGHAMBAT PERTUMBUHAN Vibrio harveyi DAN Escherichia coli DARI Bacillus sp. ASAL TAMBAK UDANG ISRAMILDA

Transkripsi

1 KARAKTERISASI ZAT ANTIMIKROB PENGHAMBAT PERTUMBUHAN Vibrio harveyi DAN Escherichia coli DARI Bacillus sp. ASAL TAMBAK UDANG ISRAMILDA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Karakterisasi Zat Antimikrob Penghambat Pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. Asal Tambak Udang adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, September 2007 Isramilda NRP

3 ABSTRAK ISRAMILDA. Karakterisasi Zat Antimikrob Penghambat Pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. Asal Tambak Udang. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Penyakit udang merupakan masalah umum yang terjadi di tambak. Salah satu bakteri patogen penting ialah Vibrio harveyi. Aplikasi bakteri probiotik dapat dijadikan sebagai kontrol untuk menanggulangi pertumbuhan bakteri patogen ditambak. Bacillus sp. merupakan suatu kelompok bakteri yang secara luas digunakan sebagai probiotik di akuakultur. Bakteri ini dapat menghasilkan zat antimikrob polipeptida sebagai bakteriosin dalam menghambat pertumbuhan bakteri lain. Objek dari studi ini untuk menyeleksi isolat Bacillus sp. dari tambak udang dan mengkarakterisasi zat antimikrob polipeptida yang dihasilkan oleh Bacillus sp. Tiga isolat Bacillus sp. diuji aktivitas antimikrobnya terhadap V. harveyi dan E. coli. Dari hasil menunjukkan bahwa Bacillus sp. Lts 40 mempunyai aktivitas antimikrob paling besar. Uji kompetisi juga menunjukkan isolat Bacillus sp. Lts 40 dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi 81,8% dan E. coli 85,5%. Zat antimikrob ini diproduksi selama fase pertumbuhan dan produksi optimum setelah 3 hari inkubasi. Zat antimikrob polipeptida yang dihasilkan Bacillus sp. Lts 40 stabil pada kisaran ph 3-11 dan zat antimikrob ini juga stabil setelah diperlakukan dengan panas sampai C selama 20 menit. Hasil purifikasi dengan kromatografi filtrasi gel bahwa fraksi no 21 efektif dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi dengan berat molekul 47,3 kda dan fraksi no 29 efektif dalam menghambat pertumbuhan E. coli dengan berat molekul 34,83 kda. Kata kunci: zat antimikrob, V. harveyi, E. coli, Bacillus sp., bakteriosin

4 ABSTRACT ISRAMILDA. Characterization of Antimicrobial Substance Inhibiting Vibrio harveyi and Escherichia coli Growth Produced by Bacillus sp. Isolated from Shrimp Pond. Under the direction of IMAN RUSMANA and NISA RACHMANIA MUBARIK. Shrimp diseases are the mayor problem in shrimp culture. One of the important bacterial pathogen in shrimp culture is Vibrio harveyi. Application of bacterial probiotic is an alternative solution to control the growth of bacterial pathogen in shrimp culture. Bacillus sp. is one group of bacteria that has been used widely as a probiotic in aquaculture. This bacteria can produce antimicrobial polipeptides such as bacteriocins that can inhibit growth of other bacteria. The objectives of this study were to screen Bacillus sp. isolated from shrimp pond and to characterize their antimicrobial polipeptides produced by the isolates. Three isolates of Bacillus sp. were examined their antimicrobial activity againt V. harveyi and E. coli. The result showed that Bacillus sp Lts 40 had the biggest antimicrobial activity. Competition assay showed that Bacillus sp Lts 40 isolate could inhibit the growth of V. harveyi and E. coli up to 81,8% and 85,5% respectively. This substance was produced during the growth and optimum production was found after 3 days of incubation. Antimicrobial polipeptides produced by Bacillus sp. Lts 40 was stable in the range of ph 3 up to ph 11 and this antimicrobial substance was remain stable after heating at C for 20 minutes. Based on purification result using chromatografi filtration technique showed that fraction number 21 was effective to inhibit V. harveyi growth and its molecular weight was 47,3 kda and fraction number 29 was effective to inhibit E. coli growth and its molecular weight was 34,83 kda. Keywords: antimicrobial-substance, V. harveyi, E. coli, Bacillus sp., bacteriocin

5 RINGKASAN ISRAMILDA. Karakterisasi Zat Antimikrob Penghambat Pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. Asal Tambak Udang. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Penyakit merupakan masalah yang umum terjadi di tambak udang, salah satunya disebabkan oleh bakteri. Bakteri yang menyebabkan penyakit pada udang ialah Vibrio harveyi. Bakteri ini dapat menyebabkan kematian massal pada udang sehingga akan menyebabkan produksi dari udang itu mengalami penurunan. Sedangkan tantangan yang harus dihadapi dalam pasar dunia bagi komoditas perikanan budidaya udang tidak hanya masalah kuantitas saja tetapi juga kualitas atau mutu udang. Mutu dan keamanan makanan seperti residu antibiotik, bakteri patogen juga harus mendapat perhatian yang serius, bakteri indikator uji mutu kualitas dan makanan salah satunya adalah Escherichia coli. Peraturan pemerintah juga melarang menggunakan antibiotik karena dapat menimbulkan masalah baru yaitu terakumulasinya antibiotik pada lingkungan dan timbulnya resistensi dari mikrob patogen. Maka dilakukan alternatif dalam pengendalian penyakit ini dengan memamfaatkan bakteri probiotik, salah satunya ialah Bacillus. Bacillus sp. memiliki kemampuan dalam menghasilkan zat antimikrob. Tujuan penelitian ini untuk menyeleksi dan mengkarakterisasi zat antimikrob isolat bakteri Bacillus sp. dari tambak udang yang potensial digunakan sebagai probiotik yang dapat menghambat pertumbuhan V. harveyi dan E. coli. Penelitian ini menggunakan tiga isolat bakteri Bacillus sp. dan bakteri indikator ialah V. harveyi dan E. coli. Tahap-tahap yang dilakukan: (1) seleksi isolat penghasil zat antimikrob dengan menggunakan double layer method dan cross streak method, (2) kompetisi dalam media cair, (3) penentuan waktu optimum produksi zat antimikrob, dan (4) karakterisasi zat antimikrob yang meliputi: pemurnian zat antimikrob, stabilitas terhadap ph dan suhu. Dari tiga isolat Bacillus sp. yang diseleksi, Bacillus sp. Lts 40 yang memiliki aktivitas penghambatan paling besar terhadap E. coli dan V. harveyi dengan indeks penghambatan masing-masing 3 dan 7. Berdasarkan zona hambat yang terbentuk bahwa V. harveyi memiliki sensitivitas lebih tinggi dari E. coli terhadap zat antimikrob yang dihasilakan Bacillus sp. Lts 40. Pada uji kompetisi, persentase penghambatan dengan rasio inokulum 1:1 sudah cukup bagi Bacillus sp. Lts 40 menghambat pertumbuhan V. harveyi (81,8%) dan terhadap E. coli (85,5%).

6 Bacillus sp. Lts 40 menghasilkan zat antimikrob selama fase pertumbuhan dan produksi optimum pada umur tiga hari dengan besar zona penghambatan pada E. coli 12 mm dan pada V. harveyi 11 mm. Tahap selanjutnya pemurnian zat antimikrob yang meliputi pengendapan dengan amonium sulfat, dialisis dan dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel. Pada pengendapan dengan amonium sulfat, aktivitas penghambatan paling tinggi terdapat pada pengendapan 30-40% terhadap E. coli dan 60-70% terhadap V. harveyi. Setelah itu didialisis selama semalam dan kemudian dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel. Hasil fraksinasi dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel, zat antimikrob yang dihasilkan oleh Bacillus sp. Lts 40 merupakan polipeptida dengan berat molekul terhadap V. harveyi 47,38 kda dan pada E. coli 34,83 kda yang selanjutnya dinyatakan sebagai bakteriosin. Zat antimikrob Bacillus sp. Lts 40 juga bersifat stabil pada kisaran ph 3-11 dan juga tahan terhadap perlakuan panas sampai C selama 20 menit. Kata kunci: zat antimikrob, V. harveyi, E. coli, Bacillus sp., bakteriosin

7 Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2007 Hak cipta dilindungi Undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

8 KARAKTERISASI ZAT ANTIMIKROB PENGHAMBAT PERTUMBUHAN Vibrio harveyi DAN Escherichia coli DARI Bacillus sp. ASAL TAMBAK UDANG ISRAMILDA Tesis Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada Program studi Biologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007

9 Judul Tesis Nama NIM : Karakterisasi Zat Antimikrob Penghambat Pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. Asal Tambak Udang : Isramilda : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si Ketua Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dedy duryadi DEA Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS Tanggal Ujian: 3 September 2007 Tanggal Lulus:

10 Dosen penguji luar komisi: Dr. Munti Yuhana, SPi. M.Si

11 PRAKATA Puji dan syukur penulis ucapkan atas ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-nya sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Tesis yang berjudul Karakterisasi Zat Antimikrob Penghambat Pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli dari Bacillus sp. Asal Tambak Udang. Pada kesempatan kali ini, terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya ingin penulis sampaikan kepada mereka yang telah berperan serta: 1. Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si, Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan banyak waktu dan dengan sabar memberikan bimbingan, arahan serta saran selama tesis ini dirampungkan. Dr. Munti Yuhana SPi M.Si. selaku dosen penguji luar komisi atas saran dan masukannya. 2. Orang-orang terkasih dalam hidup ini: Papa dan Mama serta adik-adik, terimakasih untuk kehangatan cinta, dukungan, pengorbanan dan doa tiada henti. 3. Rekan-rekan Lab Mikrobiologi (Bu It, Bu Tati, mbak Niken, Rina, mas Asrul, Irul, Ria, mbak dini, Rika dan adik-adik S 1 Ika, Ima, Bibah, Rio, Novan, Andri, Tri, Wahyu, Besti, Sarah, Muthe, Irni serta Teknisi lab Mikrobiologi, mbak Heni, Bu Kokoy, pak Jaka dan pak Ndang), terimakasih atas persahabatan dan kerjasamanya selama ini. Juga penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Ibu Alina di Balitbiogen. 4. Teman-teman Wisma Vaillya (Oja, Bu Agnest, kak Diana dan Ela), terima kasih untuk persaudaraan yang telah terbina. 5. Seluruh rekan-rekan Bio (Vil, mas Sigit, Handay, mas Ratman, Dewi, kak Meri, Bu zubaidah, pak Krey dan rekan lainnya), terima kasih atas persahabatan selama ini. Akhir kata penulis mengharapkan semoga tesis ini dan apa yang telah dihasilkan dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan, bagi pembaca pada umumnya dan penulis pada khususnya. Bogor, September 2007 Isramilda

12 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Buo, 21 Mei 1982 merupakan putri sulung dari tiga bersaudara pasangan Ayahanda Syawaluddin dan Ibunda Sustiar. Pendidikan dasar diselesaikan di SD Negeri 09 Buo pada tahun 1994, dilanjutkan ke Sekolah Madrasah Tsanawiyah Negeri Lintau Kab. Tanah Datar dan menyelesaikannya pada tahun Sekolah lanjutan tingkat atas di selesaikan di Madrasah Aliyah Negeri (MAN/MAKN) Koto Baru Padang Panjang pada tahun Pada tahun yang sama melalui jalur PMDK, penulis diterima di Program Studi Biologi Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Padang dan lulus tahun 2005, kemudian penulis melanjutkan pendidikan ke Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Program Studi Biologi.

13 DAFTAR ISI

14 DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... Halaman PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 2 TINJAUAN PUSTAKA Probiotik di Akuakultur... 3 Bacillus sp. sebagai Probiotik di Akuakultur... 4 Biosintesis Bakteriosin... 6 Mekanisme Kerja Bakteriosin... 8 Pemurnian Bakteriosin Vibrio harveyi Escherichia coli BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Alat dan Bahan Metode Penelitian Seleksi Isolat Bakteri Penghasil Zat Antimikrob Uji Penghambatan dengan Cross Streak Method Uji Kompetisi Bacillus sp. Lts 40 pada V. harveyi dan E. coli Penentuan Waktu Optimum Penghasil Zat Antimikrob Karakterisasi Zat Antimikrob Pengendapan dengan Amonium Sulfat Pengukuran Konsentrasi Protein Dialisis Kromatografi Filtrasi Gel Pengaruh ph terhadap Stabilitas Aktivitas Antimikrob Pengaruh Panas terhadap Stabilitas Aktivitas Antimikrob. 18 HASIL Aktivitas Penghambatan Zat Antimikrob dari Bacillus sp Jarak PenghambatanBacillus sp. dengan Cross Streak Method Kemampuan Penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi dan E. coli pada Kultur Campur Media Cair Waktu optimum Produksi Zat Antimikrob Karakteristik Zat Antimikrob Pemurnian Zat Antimikrob dengan Kromatografi Stabilitas Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap ph dan Suhu xi xii xiii PEMBAHASAN... 27

15 SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

16 DAFTAR TABEL Halaman 1 Efek biokimia bakteriosin bakteri Gram positif terhadap sel sensitif Indeks penghambatan isolat Bacillus sp. penghasil antimikrob terhadap V. harveyi dan E. coli dengan double layer method Jarak penghambatan Bacillus sp. terhadap V. harveyi dan E. coli dengan cross streak method Aktivitas antimikrob pada proses dialisis Pengaruh suhu terhadap aktivitas antimikrob dari hasil dialisis Karakterisasi bakteriosin dari beberapa isolat bakteri... 30

17 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Model hipotesis biosintesis molekul pediosin AcH (Jack et al. 1995) Mekanisme kerja molekul bakteriosin menembus membran sel (Bibiana 1999 dalam Suarsana 2000) Penampakan hasil uji penghambatan dengan cross streak method Persentase penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap (a) V. harveyi, dan (b) E. coli Jumlah sel Bacillus sp. Lts 40 dengan rasio inokulum Bacillus sp. Lts 40 terhadap (a) V. harveyi dan (b) E. coli (a) Kurva pertumbuhan Bacillus sp. Lts 40 pada media SWC, dan (b) aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi dan E. coli Aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap (a) E. coli, (b) V. harveyi setelah penambahan amonium sulfat, dan (c) konsentrasi protein Penampakan aktivitas penghambatan pada (a) pengendapan 60-70% terhadap V. harveyi, dan (b) pengendapan 30-40% terhadap E. coli (a) Kromatogram dari hasl filtrasi gel, dan (b) aktivitas penghambatan fraksi kromatografi filtrasi gel Bacillus sp. Lts 40.terhadap V. harveyi dan E. coli (a) Penampakan penghambatan fraksi no. 21 terhadap V. harveyi, dan (b) penampakan penghambatan fraksi no. 29 terhadap E. coli Aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi dan E. coli pada ph 3-11 hasil dialisis Penampakan aktivitas antimikrob Bacillus sp. Lts 40 pada ph terhadap (a) V. harveyi, dan (b) E. coli... 26

18 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi media yang digunakan Komposisi reagen Bradford (Bradford 1976) Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan per 1 liter larutan (Scopes 1987) Kurva standar protein hasil pengendapan amonium sulfat, dialisis Penentuan kadar protein fraksi filtrasi gel dengan metode Bradford (1976) Kurva standar protein kromatografi filtrasi gel... 47

19 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Dalam usaha menunjang peningkatan devisa nonmigas melalui peningkatan ekspor hasil perikanan, pemerintah menetapkan udang sebagai komoditas andalan utama. Peluang dalam mengembangkan perikanan budidaya udang guna memenuhi pasar dunia masih sangat besar. Produktivitas tambak udang mengalami penurunan antara lain disebabkan oleh munculnya berbagai macam penyakit. Tantangan-tantangan lain yang harus dihadapi dalam pasar dunia bagi komoditi ekspor perikanan budidaya tidak hanya kuantitas saja, akan tetapi juga kualitas atau mutu udang yang siap ekspor. Mutu dan keamanan makanan seperti residu antibiotik, bakteri patogen, racun hayati laut (biotoksin) dan residu pestisida juga harus mendapatkan perhatian yang serius, bakteri indikator uji mutu kualitas dan makanan salah satunya ialah Escherichia coli (Djazuli 2002). Peraturan pemerintah untuk budidaya udang melarang penggunaan antibiotik. Menurut Verschuere et al. (2000) penggunaan antibiotik untuk mencegah dan mengobati penyakit dapat menimbulkan masalah baru, yaitu terakumulasinya antibiotik pada lingkungan dan spesies yang dibudidaya serta timbulnya resistensi mikrob patogen. Resistensi terhadap antibiotik semakin meningkat karena resistensi dapat ditransfer dari satu mikrob ke mikrob lainnya. Lightner (1993) melaporkan beberapa kelompok bakteri penyebab penyakit udang yaitu : Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas dan Flavobacterium. Bakteri patogen penting pada udang adalah Vibrio harveyi. Bakteri ini merupakan bakteri penyebab utama serangan penyakit pada udang yang dapat terjadi mulai pada tingkat larva. Populasi V. harveyi sangat penting diperhatikan dalam budidaya udang, karena bakteri ini penyebab serangan penyakit vibriosis yang berpendar. Serangan bakteri ini pada stadia larva dapat menyebabkan kematian massal (Zafran & Roza 1993). Alternatif pengendalian penyakit udang yang disebabkan bakteri patogen di tambak udang ialah dengan memanfaatkan bakteri probiotik. Istilah probiotik didefinisikan sebagai mikrob hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang dengan memodifikasi komunitas mikrob atau berasosiasi dengan

20 2 inang, memperbaiki nilai nutrisi, memperbaiki respon inang terhadap penyakit, atau memperbaiki lingkungan kualitas ambangnya (Verschuere et al. 2000). Bakteri probiotik menghasilkan senyawa metabolit yang memiliki efek bakterisida atau bakteriostatik untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen atau bakteri yang dapat menurunkan kualitas udang selama budidaya udang. Salah satu bakteri yang umum digunakan dan menghasilkan zat antimikrob tersebut ialah Bacillus sp. Bakteri kelompok ini umumnya ditemukan pada sedimen dan saluran pencernaan udang (Verschuere et al. 2000). Bacillus sp. dapat memproduksi zat antimikrob berupa bakteriosin (Irina et al. 2001). Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi dan mengkarakterisasi zat antimikrob isolat bakteri Bacillus sp. dari tambak udang yang potensial digunakan sebagai probiotik yang dapat menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi dan Escherichia coli.

21 3 TINJAUAN PUSTAKA Probiotik di Akuakultur Definisi probiotik pada akuakultur adalah mikrob hidup yang memiliki efek menguntungkan pada inang dengan cara memodifikasi asosiasi inang atau ambang batas komunitas mikrob dengan meningkatkan penggunaan pakan atau nilai nutrisi, meningkatkan ketahanan inang terhadap penyakit atau meningkatkan kualitas lingkungan. Berdasarkan definisi tersebut, maka probiotik termasuk juga mikrob yang mencegah proliferasi patogen dalam saluran pencernaan, pada permukaan tubuh inang, dan pada lingkungan, mikrob yang dapat meningkatkan penggunaan pakan dengan meningkatkan daya cerna pakan, meningkatkan sistem imun inang dan meningkatkan kualitas air (Verschuere et al. 2000). Menurut Gomez-Gil et al. (2000) biokontrol ialah penggunaan musuh alami untuk mengurangi kerusakan yang ditimbulkan oleh organisme yang berbahaya atau pengaturan populasi penyakit oleh musuh alamiahnya. Selanjutnya ditambahkan bahwa komunitas mikrob di dalam saluran pencernaan hewan sampai batas tertentu dapat me mberikan ketahanan terhadap penyakit. Probiotik dalam akuakultur sering digunakan karena kemampuannya memproduksi senyawa antimikrob. Probiotik yang berada di saluran pencernaan dapat menghambat kerja bakteri patogen yang merusak melalui saluran pencernaan. Interaksi antara mikrob dengan inang tidak terbatas pada saluran pencernaan, bakteri probiotik dapat juga aktif pada insang, kulit tubuh inang atau lingkungan sekitarnya. Interaksi yang intensif antara mikrob dan inang dalam akukultur menjadikan sejumlah probiotik tidak hanya berhasil diisolasi dari saluran pencernaan tetapi dapat juga diisolasi di lingkungan budidaya (Irianto 2003). Mikrob probiotik unggul dapat diperoleh melalui eksplorasi dan seleksi aktivitasnya. Mikrob probiotik dapat diisolasi dari inang dan habitat dimana organisme tersebut akan diaplikasikan atau dari habitat yang berbeda (Verschuere et al. 2000). Penggunaan probiotik sebagai agen biokontrol dalam penanggulangan penyakit udang dapat menggantikan pemakaian antibiotik yang telah dilarang

22 4 pemakaiannya. Pemakaian antibiotik yang terus menerus pada dosis subletal dapat menyebabkan timbulnya mikrob resisten terhadap antibiotik. Resistensi gen pada bakteri patogen dapat ditransfer ke bakteri lain yang belum berkontak dengan antibiotik (Verschuere et al. 2000). Bacillus sp. sebagai Probiotik di Akuakultur Dewasa ini penelitian mikrob menguntungkan bagi akuakultur mulai dicoba pada mikrob yang diisolasi dari air laut, sedimen ataupun organ hewan yang mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen secara in vitro (Rengpipat et al. 1998). Secara umum probiotik untuk budidaya perairan diseleksi berdasarkan kemampuannya dalam memproduksi senyawa antimikrob (Vine et al. 2004). Menurut Verschuere et al. (2000) mekanisme kerja bakteri probiotik dapat dibagi menjadi beberapa cara yaitu: (1) produksi senyawa inhibitor, (2) kompetisi terhadap senyawa kimia atau sumber energi, (3) kompetisi terhadap tempat pelekatan, (4) peningkatan respon immun, (5) perbaikan kualitas air, dan (6) interaksi dengan fitoplankton. Sumber mikrob yang digunakan untuk probiotik dapat berasal dari inangnya yang secara alami ada pada organ organisme tersebut atau dari habitatnya (air atau sedimen). Mikrob yang digunakan sebagai probiotik harus mempunyai sifat apatogen, tidak beracun, bersifat alami dan umum digunakan (Lopez 2000). Beberapa probiotik yang telah digunakan dalam aquakultur adalah kelompok bakteri asam laktat seperti Lactobacillus dan Carnobacteruium, genus Vibrio (V. alginolyticus), genus Bacillus, atau genus Pseudomonas. Irina et al. (2001) melaporkan bahwa bakteri dari genus Bacillus sp. bisa memproduksi zat antimikrob berupa bakteriosin. Bakteriosin merupakan zat antimikrob yang merupakan polipeptida, protein atau senyawa yang mirip protein. Bakteriosin disintesis di ribosom oleh bakteri selama masa pertumbuhannya dan umumnya hanya menghambat galur-galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin (Jack et al. 1995, Kone & Fung 1992). Kriteria yang merupakan ciri-ciri bakteriosin adalah (1) memiliki spektra aktivitas yang lebih sempit, (2) senyawa aktif merupakan polipeptida atau protein, (3) bersifat

23 5 bakterisida, (4) mempunyai reseptor spesifik pada sel sasaran, dan (5) gen determinan terdapat pada plasmid, plasmid rekombinan atau episom, kromosom atau transposon yang berperan pada produksi dan imunitas (Tagg et al. 1976). Beberapa peneliti telah berhasil mengisolasi dan memurnikan bakteriosin yang diproduksi oleh Bacillus sp. Gram positif di antaranya Subtilin dihasilkan oleh B. subtilis (Klein et al. 1993), Megacin oleh B. megaterium (Tagg et al. 1976), Coagulin oleh B. coagulans I 4 (Hyronimus 1998), Cerein oleh B. cereus (Oscariz & Pisabarro 2000), dan Tochicin oleh B. thuringiensis (Paik et al. 1997). Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri Gram positif biasanya merupakan polipeptida bermuatan positif yang dapat menembus membran sel dan tersusun kurang dari 60 residu asam amino. Berdasarkan struktur asam aminonya bakteriosin dapat diklasifikasikan ke dalam dua kelompok yaitu: 1. Kelompok lantibiotik: yaitu kelompok bakteriosin yang dikarakterisasi oleh adanya jembatan sulfur intra rantai dan me ngandung asam amino yang tidak lazim yaitu dehidrolanin, lantionin dan ß-metil lantionin, misalnya pada nisin yang dihasilkan oleh Lactococcus lactis (Hurst 1981) dan variacin (Pridmore et al. 1996). 2. Kelompok nonlantibiotik yang dapat dibagi dua berdasarkan bobot molekulnya yaitu: a. bakteriosin dengan berat molekul relatif kecil sekitar 2-6 kda (Lozano et al. 1992), misalnya Pediocin AcH yang dihasilkan oleh Pediococcus acidilactici. b. bakteriosin dengan berat molekul relatif besar biasanya di atas 30 kda (Benoit et al. 1994), contohnya helveticine J yang dihasilkan oleh Lactobacillus helviticus.

24 6 Biosintesis Bakteriosin Bakteriosin dapat dibedakan dari antibiotik atau antibakteri dari proses biosintesisnya. Menurut Williams et al. (1996) bakteriosin disintesis melalui jalur ribosom sedangkan antibiotik disintesis melalui jalur di luar ribosom dengan melibatkan multienzim. Kebanyakan bakteriosin disintesis dalam bentuk protein yang tidak aktif yang memiliki N-terminal leader sequence dan C-terminal prepeptida. Jack et al. (1995) menyatakan bahwa gen penyandi produksi bakteriosin terdapat di plasmid (contoh: Colicin dan bakteriosin yang dihasilkan oleh banyak bakteri Gram positif), plasmid rekombinan atau episom (contoh: Lactocin F), kromosom (contoh: Subtilin) atau transposon (contoh: Nisin). Gen penyandi produksi bakteriosin dari golongan non lantionin pada umumnya terdapat di plasmid kecuali lactacin F yang gen penyandinya terletak di episom (Muriana & Kleenhammer 1991), plantarin A yang gen penyandinya terletak di kromosom (Dzung et al. 1993). Gen penyandi bakteriosin dalam keadaan normal berada dalam keadaan represif. Bila terjadi mutasi atau kompetisi untuk nutrisi esensial gen represif tereduksi dan berakibat terbentuknya senyawa antibakteri (DeGroat & Oudega 1986). Biosintesis bakteriosin meningkat bila ada SOS-inducing agents yaitu senyawa yang dapat mengakibatkan kerusakan sel seperti radiasi sinar ultra violet (Jack et al. 1995). Karakterisasi gen plasmid yang mengkode produksi dan imunitas bakteriosin telah banyak dilakukan (Muriana & Kleenhammer 1991; Hasting et al. 1991). Salah satunya mentransfer gen plasmid (Bac + ) Lactococcus lactis subsp Diacetilactis ke galur Lactococcus lainnya (Scherwitz et al. 1983).

25 7 Biosintesis bakteriosin dengan berat molekul rendah yang dihasilkan oleh bakteri Gram positif diawali dengan pembentukan prepeptida yaitu bakteriosin yang belum aktif, dengan ujung N penuntun (N-terminal leader sequence) yang pendek. Ujung ini terpisah pada saat pematangan dengan bantuan endopeptidase (de Vos et al. 1991). Pada lantibiotik pemisahan terjadi pada asam amino prolin, sedangkan pada non lantibiotik terjadi pada asam amino glisin. Pemisahan ini untuk mempermudah prepeptida bergandengan dengan peptida lain yang tepat. Ujung penuntun N ini berperan penting untuk mengarahkan proses pematangan berupa penggandengan prepeptida dengan peptida lain untuk membentuk bakteriosin aktif (Jack et al. 1995). Penglepasan bakteriosin aktif ke ekstraseluler dari model hipotesis biosintesis pediocin AcH yang tergolong ke dalam non lantibiotik bergantung pada ph lingkungan molekul pediocin AcH yang berbentuk bebas atau terikat pada dinding sel (Gambar 1). luar dalam Terikat Bebas Gambar 1 Model hipotesis biosintesis molekul pediocin AcH (Jack et al. 1995). CW = dinding sel, OM = membran luar

26 8 Mekanisme Kerja Bakteriosin Mekanisme kerja bakteriosin diketahui bergantung pada konsentrasi bakteriosin, kemampuan ionisasi, suhu, ph dan fase pertumbuhan sel target (Sahl & Brandis 1982, Tabel 1). Tabel 1 Efek biokimia bakteriosin bakteri Gram positif terhadap sel sensitif Bakteriosin Menghambat síntesis Efek lainnya DNA RNA Protein Megacin A-216 TU TU TU Kebocoran pada bahan penyerap UV dan Megacin C- C4MA Bakteriosin 28 dari C. perfringens lisisnya protoplas Menginduksi phage lisogenik Perubahan pada sferoplas Lactocin LP Penghambatan traspor aktif ion K + Staphylococcin 155 Saphylococcin 462 Staphylococcin Staphylococcin A-FF22 Enterocin EIB EIA, TU : tidak diuji, Tagg et al. (1976) Tidak melisis sel Penghambatan produksi ATP Kebocoran pada bahan penyerap UV, penghambatan terhadap produksi ATP, transpor ion aktif, bergabungnya glukosa ke dalam bahan yang terendapkan oleh asam dan asam amino Penghambatan terhadap bergabungnya glukosa ke dalam bahan yang terendapkan oleh asam Menghambat akumulasi isoleusin dan menyebabkan efflux akumulasi isoleusin sebelumnya

27 9 Adsorpsi molekul bakteriosin oleh dinding sel yang sensitif menyebabkan dinding sel lebih permeabel terhadap bakteriosin. Sedangkan adsorpsi bakteriosin oleh dinding sel bakteri yang resisten, tidak diikuti oleh perubahan permeabilitas dinding sel (Gambar 2). Gambar 2 Mekanisme kerja molekul bakteriosin menembus membran sel (Bibiana 1999 dalam Suarsana 2000). Komponen lipid membran sel terdiri atas dua lapis fosfolipid dengan gugus polar di bagian permukaan dan gugus nonpolar di bagian dalam membran. Komponen non polar sangat efisien dalam menahan ion-ion kecil seperti K + atau Na +. Bakteriosin yang terabsorpsi akan masuk ke dalam lapisan fosfolipid membran sel membentuk agregat yang melintang dari satu sisi membran kesisi lain. Pada pengamatan secara fisik terlihat bakteriosin membentuk struktur heliks dalam lingkungan nonpolar dan struktur heliks tersebut bersatu membentuk saluran (ionophore). Saluran ini dapat menjadi lintasan ke luar ion-ion esensial seperti K + dan Na +. Kematian sel dapat terjadi karena kehilangan gaya gerak proton (proton motive force).

28 10 Mekanisme kerja bakteriosin acidocin J1132 yang dihasilkan oleh Lactobacillus acidophilus JCM 1132 bersifat bakteriosida yang dapat menyebabkan sel bakteri lisis. Acidocin menyebabkan bakteri menjadi sensitif karena hilangnya gaya gerak proton, menghambat transpor asam amino dan menyebabkan ke luarnya senyawa esensial oleh pembentukan pori didalam membran sitoplasmik (Tahara et al. 1996). Bhunia et al. (1991) melaporkan mekanisme kerja bakteriosin pediocin AcH dari bakteri Pediococcus acidilactici melalui uji absorbsi dengan beberapa bakteri penguji. Hasil penelitiannya menunjukkan mekanisme kerja pediocin sebagai berikut: (1) awalnya pediocin AcH berikatan dengan reseptor nonspesifik, dalam hal ini kemungkinan oleh lipoteichoid acid, (2) apabila reseptor nonspesifik telah jenuh, molekul pediocin AcH berikatan dengan reseptor spesifik dan menyebabkan perubahan integritas membran, (3) molekul pediocin AcH kemudian menyebabkan gangguan fungsional membran sehingga sel kehilangan ion K, serta kehilangan kemampuan untuk berkembang biak, (4) pada beberapa galur, membran selnya juga kehilangan integritas struktur dan menyebabkan lisis, (5) pada bakteri Gram positif yang resisten tidak dijumpai adanya reseptor spesifik sehingga bakteri tersebut tidak mampu mengabsorbsi molekul pediocin AcH, dan (6) pada bakteri gram negatif tidak dijumpai reseptor spesifik maupun nonspesifik untuk molekul pediocin AcH. Pemurnian Bakteriosin Pemurnian bakteriosin telah banyak dilakukan meskipun proses purifikasinya berbeda, namun pada prinsipnya mengikuti pola purifikasi protein (Aymerich et al. 1996; Pridmore et al. 1996). Ekstrak bakteriosin mula-mula dipekatkan dengan fraksi presipitasi yaitu dengan asam, garam, etanol dan berbagai pelarut campuran. Proses pengendapan protein dengan menggunakan garam mineral umum dilakukan untuk meningkatkan konsentrasi protein dan awal proses pemurnian. Adapun garam mineral yang paling umum digunakan ialah amonium sulfat karena solubilitas dalam air sangat tinggi, tidak mengandung zat yang toksik terhadap kebanyakan protein dan dalam jumlah banyak dapat

29 11 bertindak sebagai penstabil bagi protein itu sendiri (Booth & Hames 1990, Darwis & Sukara 1990). Setelah protein dipisahkan, dilakukanlah fraksinasi untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. Salah satu cara fraksinasi ialah dengan filtrasi gel. Pada teknik ini protein dilarutkan dalam bufer yang sesuai kemudian dibiarkan mengalir ke bawah berdasarkan gaya gravitasi melalui kolom yang berisikan gel dari bahan polimer, misalnya Sephadex, Sephacril dan Bio-gel. Protein dengan ukuran molekul besar tidak dapat merembes melewati pori sehingga akan dibasuh ke luar, mengalir turun sepanjang kolom dengan cepat. Sedangkan protein dengan ukuran molekul yang lebih kecil akan masuk ke pori sehingga aliran tertahan dan lambat sekali. Martirani et al. (2002) telah melakukan pemurnian bakteriosin dari B. licheniformis dengan menggunakan filtrasi gel atau pemisahan fraksi berdasarkan berat molekul dengan kolom Sephadex G-75 dan berat molekul yang diperoleh sekitar 2 kda. Vibrio harveyi Bakteri Vibrio sp. merupakan bakteri Gram negatif, bersifat motil, oksidase positif, berbentuk sel tunggal, batang pendek bengkok atau lurus, berukuran panjang 1,4-5,0 µm dan lebar 0,3-1,3 µm, fermentatif terhadap glukosa, berpendar dan mempunyai flagela di salah satu kutubnya, tidak membentuk asam dari glukosa dan dapat menggunakan sukrosa sebagai sumber energinya (Lavilla- Pitogo et al. 1990). Vibrio ditemukan di hampir seluruh habitat, seperti air tawar, estuaria, air laut, tanah dan merupakan agen penyebab penyakit pada manusia, ikan dan crustase (Singleton 1992). Masuknya Vibrio patogen dalam usaha budidaya udang di tambak dapat berasal dari air laut dan benar yang di gunakan. Boer et al. (1993) melaporkan bahwa induk udang yang berasal dari air laut positif membawa bakteri berpendar sehingga dapat menularkan pada benur (larva) dan akhirnya terbawa masuk ke tambak. Kehadiran Vibrio sp. pada pemeliharaan udang tidak selalu menyebabkan kematian, bakteri ini bersifat oportunistik. Tingkat kepadatan tertentu serta kondisi hidup udang yang kurang baik menyebabkan Vibrio berubah menjadi

30 12 patogen dan menginfeksi udang (Chanratchakool et al & Rukyani 1993) Beberapa bakteri Vibrio yang sering menyebabkan kematian pada benih udang ialah Vibrio vulvinicus, V. alginolyticus, V. fluvialis, V. anguillarus dan V. harveyi (Boer & Zafran 1992). Jenis yang sering menimbulkan masalah serius dalam budidaya ialah Vibrio harveyi, larva yang terinfeksi terlihat bercahaya pada kondisi gelap sehingga penyakit yang ditimbulkan penyakit ini sering disebut penyakit kunang-kunang atau luminescent vibriosis (Lightner 1996). Luminescence terjadi karena bakteri memiliki enzim luciferase yang dapat mengkatalis reaksi yang memancarkan cahaya dengan menggunakan subtrat berupa senyawa aldehid yang disebut luciferin (Meighen 1991). Menurut Liu et al. (1996, diacu dalam Zhang & Austin 2000) protease, phospolipase, haemolisin atau exotosin merupakan piranti patogenitas penting untuk Vibrio harveyi. Bakteri penghasil cahaya ini sangat patogen dan akut sehingga dapat menyebabkan kematian larva udang sampai 100% dalam waktu 1-2 hari. Larva udang yang terserang dapat mati, tidak berbangkai dan hancur (Rukyani 1992). Vibrio harveyi akan bersifat patogen pada larva udang apabila kepadatannya dalam air mencapai 10 4 cfu/ml (Zafran & Roza 1993). Tingkat patogenitas Vibrio bercahaya juga telah diketahui dimana pada tingkat kepadatan 10 4 sel/ml air pemeliharaan sudah dapat menyebabkan kematian massal larva udang dalam waktu 24 jam (Zafran 1992) Escherichia coli Escherichia coli termasuk dalam Escherichiae dan merupakan bagian dari famili Enterobacteriaceae. Bakteri ini bersifat oksidase negatif, termasuk dalam golongan bakteri Gram negatif, berbentuk batang dengan ukuran µm x 2-6 µm, bersifat motil karena adanya flagela (Willshaw et al. 2000). Bakteri ini mempunyai kisaran suhu pertumbuhan yang sangat luas yaitu C dengan suhu optimum 37 0 C. Bakteri ini resisten pada pemanasan suhu 55 0 C selama 60 menit atau pada suhu 60 0 C selama 15 menit. Menurut Pelczar & Chan (1993) Struktur dinding sel bakteri Escherichia coli berlapis-lapis terdiri atas lipopolisakarida, peptidoglikan, dan protein. Lipopolisakarida ini mengandung antigen O dan enotoksin yang dapat melindungi sel dari perubahan lingkungan.

31 13 Keberadaan lapisan ini menyebabkan dinding sel tidak mudah dipisahkan dari sel bakteri oleh enzim pengurai. Selain itu Escherichia coli bersifat Gram negatif yang tahan hidup dalam media yang kekurangan gizi. Holt et al. (1986) ciri biokimia dari bakteri ini adalah memiliki kemampuan memfermentasi laktosa, reaksi indol positif, metil positif, uji VP (Voges- Proskauer) negatif dan tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya. Pada media EMB (eosin metilen blue) bakteri ini menunjukan warna hijau metalik. Bakteri ini merupakan mikroflora normal yang terdapat pada usus besar manusia dan hewan berdarah panas lainnya yang dalam keadaan tertentu dapat bersifat sebagai patogen. Kemampuan suatu bakteri patogen untuk menyebabkan infeksi dipengaruhi oleh faktor virulensi yang dimilikinya. Faktor virulensi merupakan kemampuan yang dimiliki oleh bakteri untuk dapat bertindak sebagai bakteri patogen (Inglis 1996). Faktor virulensi diklasifikasikan menjadi dua yaitu faktor virulensi yang memungkinkan bakteri untuk berkolonisasi seperti fili, flagella, motilitas dan kemotaksis, protease ekstraseluler serta faktor virulensi yang mengakibatkan kerusakan pada inang diantaranya eksotoksin dan endotoksin (Levine et al. 1985).

32 14 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini di lakukan di Laboratorium Mikrobiologi Institut Pertanian Bogor, Laboratorium Biokimia, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian, Bogor. Waktu penelitian dilakukan pada bulan Oktober 2006 sampai dengan Juli Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah inkubator bergoyang (Eberbach, USA), sentrifuse (JOUAN CR 3, Francis), vortex (NS-80, USA), timbangan analitik (EB-280, Shimadzu, Jepang), lemari pendingin (SHARP, Jepang), laminar air flow (MSC 12, JOUAN, Francis), autoklaf (ISO LAB, Jerman), spektrofotometer, penangas air (TZ4ST, Autonics, USA), ph meter (HANNA, Japan), pipet mikro, kantung dialisis (Sigma, USA), kolom kromatografi filtrasi gel. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah isolat bakteri Bacillus sp. asal tambak udang di Karawang, Jawa Barat (Koleksi Laboratorium Mikrobiologi Institut Pertanian Bogor). Bakteri indikator yang digunakan ialah Escherichia coli (E. coli) dan Vibrio harveyi (V. harveyi). Media yang digunakan ialah sea water complete (SWC), bahan kimia yang digunakan untuk pengendapan protein dan fraksinasi protein. Metode Penelitian Seleksi Isolat Bakteri Penghasil Zat Antimikrob Tiga isolat Bacillus sp. (Lts 36, Lts 40 dan Ltw 54), bakteri target V. harveyi dan E. coli diremajakan pada media SWC, kemudian diinkubasi selama ± 2 hari. Untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri Bacillus sp. Lts 40, Lts 36 dan Ltw 54 yang telah dikumpulkan dalam menghasilkan zat antimikrob, dilakukan uji aktivitas antimikrob terhadap V. harveyi dan E. coli dengan menggunakan double layer method. Sebanyak 50 µl biakan bakteri uji dengan kepadatan sel (10 8 CFU/ml) disuspensikan dalam 50 ml SWC, dituang sekitar 10 ml pada permukaan

33 15 SWC padat dan didiamkan beberapa saat hingga beku. Selanjutnya isolat bakteri Bacillus sp. yang berumur dua hari diinokulasikan pada agar dengan menggunakan jarum ose dan diinkubasi pada suhu ± 28 0 C selama 24 jam. Bakteri yang memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa antimikrob menunjukan adanya zona bening (zona hambatan) di sekitar koloni dihitung Indek penghambatannya dengan menggunakan rumus: Indeks Penghambatan = ø zona(mm) - ø koloni (mm) ø koloni (mm) Uji Penghambatan dengan Cross Streak Method Bacillus sp. umur 24 jam dalam media cair SWC digores pada media padat SWC yang menyerupai lembaran pita melalui diameter media. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu ± 28 0 C, dua bakteri target yaitu V. harveyi dan E. coli digores tegak lurus terhadap goresan pita Bacillus sp. menggunakan jarum ose. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ± 28 0 C. Panjang zona hambat berupa garis lurus diukur pada masing-masing tempat bakteri target ditumbuhkan (Chythanya et al. 2002). Uji Kompetisi Bacillus sp. terhadap V. harveyi dan E. coli Perlakuan pada masing-masing bakteri ialah dengan inokulasi bakteri uji dan isolat Bacillus sp. terpilih dengan rasio 1:1, 1:2, 1:4, 1:10. Lima erlemeyer yang berisi 50 ml media cair sea water complete (SWC) dimasukkan 100 µl bakteri uji dengan jumlah sel 10 8 CFU/ml. Pada erlenmeyer 11, 111, 1V dan V ditambahkan Bacillus sp. terpilih dengan volume 100 µl, 200 µl, 400 µl dan 1000 µl, satu erlenmeyer digunakan sebagai kontrol negatif bakteri uji dan diinkubasi di atas mesin pengocok. Inkubasi dilakukan selama 24 jam dan untuk menentukan jumlah sel dilakukan dengan menggunakan metode cawan sebar pada media SWC padat. Tentukan penentuan persentase penghambatan terhadap V. harveyi dan E. coli dengan menggunakan rumus: Persentase penghambatan = kontrol - perlakuan x 100% kontrol

34 16 Penentuan Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Sebanyak 2 ml kultur Bacillus sp. dengan kepadatan sel 10 8 CFU/ml diinokulasikan ke dalam media cair SWC 200 ml dan diinkubasi di atas mesin pengocok. Pengambilan sampel dilakukan setiap 6 jam dengan mengambil 5 ml kultur dan dimasukkan ke dalam tabung mikro. Suspensi bakteri tersebut selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 4500 g selama 15 menit. Supernatan bebas sel dari media produksi dari setiap pengambilan sampel diuji aktivitas antimikrobnya terhadap V. harveyi dan E. coli (sel 10 8 CFU/ml) dengan menggunakan disk difusion method (Lisboa et al. 2006). Karakterisasi Zat Antimikrob Pengendapan dengan Amonium sulfat Suspensi yang telah diinkubasi selama waktu optimum disentrifugasi dengan kecepatan 4500 g selama 15 menit pada suhu 4 0 C. Supernatan yang diperoleh dipisahkan dengan metode salting out dengan menambahkan amonium sulfat. Sebanyak 150 ml filtrat kultur diendapkan secara bertahap dengan menambahkan amonium sulfat mulai dari konsentrasi awal 0-10 % sampai konsentrasi akhir 70-80% pada suhu 4 0 C. (Tingkat kejenuhan fraksinasi dengan amonium sulfat dapat dilihat dalam Lampiran 3). Penambahan dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan menggunakan pengaduk magnet dengan kecepatan lambat. Endapan protein dipisahkan dari cairannya dengan menggunakan sentrifugasi 4500 g selama 15 menit pada suhu 4 0 C. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam 0.1 M bufer fosfat ph 7 dengan volume ± 10 ml, kemudian masing-masing diuji aktivitas penghambatan pada bakteri uji untuk menentukan persentase kejenuhan amonium sulfat yang optimal dengan menggunakan disk difusion method. Aktivitas yang paling besar dari tingkat kejenuhan ini digunakan untuk pengendapan pada tahap selanjutnya. Hasil dari pengendapan diukur juga kadar protein dengan menggunakan metode Bradford (1976).

35 17 Pengukuran Konsentrasi Protein Konsentrasi protein filtrat kultur Bacillus sp. diukur dengan menggunakan metode Bradford (1976). Sebanyak 400 µl filtrat kultur direaksikan dengan 4 ml pereaksi Coomassie Briliant Blue G-250, dikocok dan didiamkan selama 15 menit. Sebagai blanko digunakan 400 µl akuades yang direaksikan dengan pereaksi yang sama, sedangkan sebagai standar protein digunakan Bovine Serum Albumin (BSA) dengan seri konsentrasi mg/ml dari stok BSA 2 mg/ml. Dialisis Untuk memisahkan garam yang tersisa dari proses pengendapan maka dilakukan dialisis. Sebelum digunakan membran dialisis direbus dulu dengan menggunakan Na karbonat 2% dan EDTA % selama 10 menit. Larutan diganti dengan aquades dan kembali direbus selama 10 menit. Perlakuan ini diulang dua kali. Kantong disimpan dalam larutan bufer yang akan digunakan pada suhu 4 0 C. Pada saat akan digunakan, salah satu ujung kantong diikat dengan benang jahit lalu dimasukkan 3 ml protein hasil pengendapan amonium sulfat. Pengisian kantong sebaiknya tidak terlalu penuh, setelah terisi ujung lain dari kantong dapat diikat. Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang berisi bufer fosfat 0.01 M ph 7 (volume total 100x volume sampel di dalam membran) sambil diaduk pelan dengan menggunakan pengaduk magnet. Bufer fosfat yang di luar membran (0.01 M ph 7) diganti setiap 2 jam inkubasi dengan bufer yang baru dan volume yang sama dan diinkubasi pada suhu 4 0 C selama semalam. Hasil dari dialisis diuji aktivitas penghambatannya terhadap bakteri uji dengan menggunakan disk difusion method dan kadar protein juga diukur dengan menggunakan metode Bradford (1976).

36 18 Kromatografi Filtrasi Gel Pemurnian protein dilakukan dengan teknik kromatografi menggunakan kolom Hi Prep 16/60 Sephacryl S-200 High Resolution (HR), dengan sistem AKTApurifier Swedia. Matriks Sephacryl S-200 dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom kromatografi yang berdiameter 1 cm dan tinggi 60 cm, bagian dasar kolom diberi glasswool (Merck, Darmstadt, Jerman) sebagai penahan. Sebanyak 2 ml protein hasil dialisis diaplikasikan ke dalam kolom dan elusi dilakukan dengan menggunakan larutan bufer fosfat 0.1 M ph 7 dengan kecepatan alir 0.5 ml/menit. Proses elusi diamati dengan detektor pada? 280 nm. Fraksi hasil elusi ditampung sebanyak 3 ml dalam tabung dan diukur pada? 280 nm. Fraksi yang diperoleh dikelompokkan berdasarkan waktu retensinya dalam kolom. Hasil dari fraksi ini diuji aktivitas penghambatannya terhadap bakteri uji dengan disk difusion method. Sephacril S-200 dapat digunakan untuk menentukan berat molekul (BM) yang belum diketahui dengan cara membuat kurva yang menghubungkan volume elusi (ml) protein standar terhadap log BM dan tentukan BM nya dari kurva standar (Lampiran 6). Pengaruh ph terhadap Stabilitas Aktivitas Antimikrob Fraksi dari hasil dialisis diatur ph nya dari 3, 5, 7, 9, 11, untuk mendapatkan ph asam ditambahkan HCl 1 M sedangkan untuk mendapatkan ph basa ditambahkan NaOH 1 M. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang ± 28 0 C selama 2 jam kemudian uji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri V. harveyi dan E. coli dengan disk difusion method (Joshi et al. 2006) Pengaruh Panas terhadap Stabilitas Aktivitas Antimikrob Fraksi dari hasil dialisis dipanaskan pada suhu 50 dan C selama 10 menit dan 20 menit. Setelah dipanaskan didinginkan pada suhu kamar kemudian diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri V. harveyi dan E. coli dengan disk difusion method (Joshi et al. 2006).

37 19 HASIL Aktivitas Penghambatan Zat Antimikrob dari Bacillus sp. Tiga isolat Bacillus sp. penghasil antimikrob dari tambak udang di uji aktivitas penghambatannya terhadap V. harveyi dan E. coli (sel 10 8 CFU/ml) dengan menggunakan double layer method. Besarnya aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40, Ltw 54 dan Lts 36 terhadap V. harveyi dan E. coli ditunjukkan pada Tabel 2. Indeks penghambatan isolat Bacillus sp. yang diuji pada E. coli antara 0,7-3,0 sedangkan pada V. harveyi antara 3,6-7,0. Tabel 2 Indeks penghambatan isolat Bacillus sp. penghasil antimikrob terhadap V. harveyi dan E. coli dengan double layer method Bacillus V. harveyi E. coli sp. Ø koloni Ø zona Indeks Ø koloni Ø zona Indeks (mm) (mm) (mm) (mm) Lts 40 2,5 20,0 7, ,0 Lts 36 2,5 11,5 3, ,7 Ltw 54 2,5 13,0 4, ,0 Penghambatan Bacillus sp. dengan Cross Streak Method Metode gores silang (cross streak method) bertujuan untuk melihat jarak penghambatan Bacillus sp. terhadap V. harveyi dan E. coli (Gambar 3) Jarak penghambatan Bacillus sp. terhadap V. harveyi berkisar antara 2-7 mm sedangkan pada E. coli 5-8 mm dan tidak ada peningkatan jarak penghambatan dari inkubasi 24 sampai 48 jam seperti yang tersaji pada Tabel 3. Tabel 3 Jarak penghambatan Bacillus sp. terhadap V. harveyi dan E. coli dengan cross streak method Bacillus sp. V. harveyi (mm) E. coli (mm) 24 jam 48 jam 24 jam 48 jam Lts Lts Ltw

38 20 Gambar 3 Penampakan hasil uji penghambatan dengan cross streak method. Kemampuan Penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi dan E. coli pada Kultur Campur Media Cair Hasil uji dari kultur campur media cair menunjukkan bahwa Bacillus sp. Lts 40 mempunyai kemampuan dalam menghambat pertumbuhan V. harveyi dan E. coli. Persentase penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi antara 81,8-88,7%, dengan jumlah sel Bacillus sp. Lts 40 antara 17,8-61,5 (10 10 ) dan V. harveyi 10,9-6,8 (10 10 ). Persentase penghambatan pada E. coli berkisar ,7% dengan jumlah sel Bacillus sp. Lts 40 ialah 3,9-31 (10 9 ), E. coli 21-2,1(10 9 ) (Gambar 4 & 5). a 95 b 95 Persentase penghambatan V. harveyi :1 1:2 1:4 1:10 Rasio inokulum Persentase penghambatan E. coli :1 1:2 1:4 1:10 Rasio inokulum Gambar 4 Persentase penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap (a) V. harveyi dan (b) E. coli.

39 21 a Jumlah sel 10 9 CFU/ml :1 1:2 1:4 1:10 Rasio inokulum Bacillus E. coli b Jumlah sel CFU/ml :1 1:2 1:4 1:10 Rasio inokulum Bacillus V. harveyi Gambar 5 Jumlah sel Bacillus sp. Lts 40 dengan rasio inokulum Bacillus sp. Lts 40 terhadap (a) V. harveyi dan (b) E. coli. Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Hasil uji aktivitas yang dilakukan pada kultur yang dipanen setiap 6 jam menunjukkan bahwa kultur Bacillus sp. Lts 40 dalam media SWC pada umur 6 jam inkubasi yaitu pada fase pertumbuhan mulai menghasilkan antimikrob yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi dan E. coli (Gambar 6). Optical density (600 nm) Waktu (jam) Aktivitas penghambatan (mm) Waktu (jam) E. coli V. harveyi a Gambar 6 (a) Kurva pertumbuhan Bacillus sp. Lts 40 pada media SWC, dan (b) aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi dan E. coli. b

40 22 Karakteristik Zat Antimikrob Tahap awal pemurnian zat antimikrob menggunakan metode pengendapan dengan ammonium sulfat yang dimulai dari konsentrasi 0-10% sampai % (Gambar 7) a. b. Aktivitas penghambatan E. coli (mm) Crude Konsentrasi amonium sulfat (%) supernatan endapan Aktivitas penghambatan V. harveyi (mm) supernatan endapan Crude Konsentrasi amonium sulfat (%) c. Konsentrasi protein (mg/ml) 0,4 0,3 0,2 0,1 0 endapan supernatan Crude Konsentrasi amonium sulfat (%) Gambar 7 Aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap (a) E. coli, (b) V. harveyi setelah penambahan amonium sulfat, dan (c) Konsentrasi protein. Setelah diperoleh hasil aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 tertinggi dengan menggunakan amonium sulfat pada pemekatan 30-40% terhadap bakteri indikator E. coli dan 60-70% terhadap V. harveyi (Gambar 7 & 8). Maka dilanjutkan dengan dialisis yang bertujuan untuk menghilangkan pengotor berupa amonium sulfat dari protein yang akan dimurnikan. Hasil dialisis menunjukkan sedikit penurunan nilai aktivitas antimikrob dan kadar protein (Tabel 4).

41 23 Tabel 4 Aktivitas antimikrob pada proses dialisis Konsentrasi Aktivitas antimikrob (mm) Kadar protein (mg) amonium sulfat (%) Sebelum dialisis Setelah dialisis Sebelum dialisis Setelah dialisis ,0192 0, ,1653 0,1104 s e e s a b Gambar 8 Penampakan aktivitas penghambatan pada (a) pengendapan % terhadap V. harvey, (b) pengendapan % terhadap E. coli e = endapan, s = supernatan Pemurnian Zat Antimikrob dengan Kromatografi Pada penelitian ini tahap pemurnian dilakukan dengan cara presipitasi dengan amonium sulfat sampai kadar akhir 60-70%, karena pengendapan 30-40% sudah terendapkan terlebih dahulu sebelum pengendapan 60-70%. Selanjutnya di dialisis semalam dan dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan Sephacril S-200. Hasil dari kromatogram filtrasi gel, dari 50 fraksi yang ditamp ung, hanya 13 fraksi yang dipilih untuk mewakili puncak yang ada dan diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri indikator E. coli dan V. harveyi. Fraksi yang menghasilkan aktivitas penghambatan paling besar terhadap V. harveyi ialah fraksi no. 21 dengan zona hambatan sebesar 30 mm, kadar protein 0,0167 mg dan berat molekul (BM) 47,38 kda sedangkan pada E. coli terdapat pada fraksi no. 29 dengan zona hambatan sebesar 20 mm, kadar protein 0,0778 mg dan BM 34,83 kda (Gambar 9 & 10).

42 24 (a) (b) Aktivitas penghambatan (mm) E. coli V. harveyi K Fraksi kromatografi Gambar 9 (a) Kromatogram dari hasil filtrasi gel, dan (b) aktivitas penghambatan fraksi kromatografi filtrasi gel Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi dan E. coli, K = hasil dari proses dialisis. 29 D D 21 K a b Gambar 10 (a) Penampakan penghambatan fraksi no. 21 terhadap V. harveyi (b) penampakan penghambatan fraksi no. 29 terhadap E. coli D = hasil dialisis, K = kontrol negatif.

43 25 Stabilitas Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap ph dan Suhu Peningkatan proses pemurnian menyebabkan kestabilan zat antimikrob bakteriosin sering mengalami penurunan (Tagg et al. 1976). Maka perlu diteliti sifat zat antimikrob ini dari segi kestabilannya baik terhadap suhu maupun ph. Hasil uji aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 pada kisaran ph 3-11, mempunyai aktivitas hambatan optimum pada ph 5 dengan zona hambatan 22 mm terhadap bakteri V. harveyi sedangkan hambatan optimum pada E. coli terdapat pada ph 7 dengan zona hambatan 24 mm. Hasil uji statistik pada kisaran ph 3-11 dengan selang kepercayaan 95% tidak beda nyata, baik aktivitas penghambatan terhadap V. harveyi maupun E. coli (Gambar 11). Hasil uji stabilitas aktivitas penghambatan terhadap perlakuan suhu setelah dialisis menunjukkan Bacillus sp. Lts 40 bersifat tahan terhadap panas sampai suhu C selama 20 menit (Tabel 5), hal ini terlihat dari zona penghambatan oleh antimikrob tersebut terhadap bakteri indikator V. harveyi dan E. coli. 30 Aktivitas penghambatan (mm) V. harveyi E. coli K ph Gambar 11 Aktivitas penghambatan Bacillus sp. Lts 40 terhadap V. harveyi dan E. coli pada ph 3-11 hasil dialisis.

44 26 Tabel 5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas antimikrob dari hasil dialisis Suhu 0 C Waktu (menit) Aktivitas penghambatan (mm) V. harveyi E. coli k 1 k a b Gambar 12 Penampakan aktivitas antimikrob Bacillus sp. Lts 40 pada ph terhadap (a) V. harveyi, dan (b) E.coli Keterangan : K = kontrol, 1 : ph 3. 2 : ph 5, 3 : ph 7, 4 : ph 9. 5 : ph 11. 5