AKTIVITAS ANTIMIKROB Bacillus sp. YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG IKA SUPARNIKA

Transkripsi

1 AKTIVITAS ANTIMIKROB Bacillus sp. YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG IKA SUPARNIKA DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 27

2 ABSTRAK IKA SUPARNIKA. Aktivitas Antimikrob Bacillus sp. yang Diisolasi dari Tambak Udang. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ANJA MERYANDINI. Dalam usaha penapisan senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. hasil isolasi dari tambak udang maka dilakukan uji aktivitas dan produksi senyawa aktifnya secara in vitro. Sebanyak enam isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari tambak udang diuji aktivitas penghambatannya terhadap bakteri indikator dengan metode double layer, 5 isolat menunjukkan adanya aktivitas antimikrob terhadap Staphylococcus aureus, 4 isolat diantaranya dapat menghambat Vibrio harveyi dan hanya 2 isolat yang dapat menghambat Escherichia coli. Isolat Bacillus sp. LTC 8 memiliki indeks penghambatan yang paling baik terhadap semua bakteri indikator dan dibuktikan kembali dengan metode cross-streak dan uji kompetisi dalam kultur campuran. Hasil ini menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki penghambatan yang luas karena dapat menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif. Hasil uji kompetisi dalam kultur campuran menunjukkan isolat tersebut memiliki penghambatan terutama terhadap S. aureus dengan persen penghambatannya mencapai 1 %. Aktivitas senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus dihasilkan pada fase eksponensial pertumbuhannya. ABSTRACT IKA SUPARNIKA. Antimicrobial Activity of Bacillus sp. Isolated from Shirmp Ponds. Supervised by IMAN RUSMANA and ANJA MERYANDINI. Screening of antimicrobial substance produced by Bacillus sp. isolated from shirmp ponds was conducted their activity and production analyzed in vitro experiments. Six Bacillus sp. isolates isolated from shirmp ponds was determinated their antimicrobial activity against indicator bacteria using double layer method. The results showed that 5 isolates was able to inhibit Staphylococcus aureus growth, 4 isolates could inhibit Vibrio harveyi growth, and 2 isolates could inhibit against Escherichia coli growth. Bacillus sp. LTC 8 were the highest inhibition zone against all indicator bacteria and analyzed again with cross-streak method and competition test in mixed culture. The result showed that this isolates have a broad inhibition activity able inhibit Gram positive and Gram negative bacteria. The competition test in mixed culture showed that these isolates could inhibit S. aureus up to 1 %. The antimicrobial substance of Bacillus sp. LTC 8 were S. aureus produced in the exponential growth phase.

3 AKTIVITAS ANTIMIKROB Bacillus sp. YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG IKA SUPARNIKA Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 27

4 Judul Skripsi Nama NIM : Aktivitas Antimikrob Bacillus sp. yang Diisolasi dari Tambak Udang : Ika Suparnika : G Disetujui Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. Dr. Anja Meryandini, M.S. NIP NIP Diketahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S. NIP Tanggal Lulus :

5 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kuningan pada tanggal 4 Desember 1984 dari ayah H. Nasuha dan Ibu Hj. Sarwiyah. Penulis merupakan anak ke empat dari empat bersaudara. Pada tahun 23 penulis lulus dari SMU Negeri 2 Cirebon dan pada tahun yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Botani Umum pada tahun ajaran 24/25, Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada tahun ajaran 25/26, Fisiologi Tumbuhan pada tahun ajaran 25/26, Mikrobiologi Dasar pada semester ganjil dan semester genap tahun ajaran 26/27 dan Biologi Dasar pada tahun ajaran 26/27. Penulis juga pernah aktif menjadi anggota Wahana Muslim Himabio (WMH) dan Bioworld. Pada bulan Juli-Agustus tahun 26, penulis melaksanakan praktek lapang di PT Centralpertiwi Bahari plant III Muara Baru dengan tema Pengendalian Mutu Produk Udang Beku.

6 PRAKATA Alhamdulillahirobilalamin, segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah dengan judul Aktivitas Antimikrob Bacillus sp. yang Diisolasi dari Tambak Udang ini disusun berdasarkan hasil penelitian dari bulan Februari sampai dengan Juni 27. Penulis mengucapakan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu penyusunan karya ilmiah ini, terutama kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Dr. Anja Meryandini, M.S selaku pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan. Terima kasih kepada Ibu Dra. Triadiati, M.Si atas saran dan diskusi yang berguna. Terima kasih kepada Ibu Dr. Nisa Rachmania, M.Si dan seluruh staf laboratorium Mikrobiologi, Mbak Iis, Ibu It, Irni, Ima, Bibah, Ryo, Besty, dan teman - teman penelitian di lab Mikrobiologi yang telah memberikan informasi, arahan dan bantuan selama di laboratorium. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak, Ibu dan nenek tercinta, A Nana, A Jaja, A Onih, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Zahroh, Ifun, Arieza, Nindya, mbak Dwi, keluarga besar Tm16 serta temanteman Biologi 4 yang selalu memberikan dukungan dan doa. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Oktober 27 Ika Suparnika

7 DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... PENDAHULUAN Halaman Latar Belakang... 1 Tujuan... 1 Waktu dan Tempat Penelitian... 1 BAHAN DAN METODE Bahan... 1 Metode Peremajaan dan Pemurnian isolat... 1 Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. Penghasil Zat Antimikrob... 2 Metode Cross-streak Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator... 2 Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator... 2 Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. Penghasil Zat Antimikrob... 3 Metode Cross-streak Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator... 4 Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator... 4 Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp Pembahasan... 6 SIMPULAN... 8 SARAN... 8 DAFTAR PUSTAKA... 8 LAMPIRAN... 1 vii vii

8 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. dengan menggunakan metode double layer terhadap (a) E. coli dan (b) V. harveyi Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator dengan metode cross-streak Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. LTW 4 terhadap bakteri indikator pada inkubasi (a) 24 jam dan (b) 48 jam Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator pada inkubasi (a) 24 jam dan (b) 48 jam Aktivitas antimikrob sel Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus Aktivitas antimikrob isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus (a) filtrat sel dan (b) supernatan bebas sel Aktivitas penghambatan supernatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus selama pertumbuhan DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTW 4 terhadap bakteri indikator Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator Aktivitas antimikrob sel Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus Aktivitas antimikrob sel dan supernatan Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus... 11

9 PENDAHULUAN Latar Belakang Budi daya udang merupakan salah satu sektor perikanan di Indonesia yang sangat potensial dalam perekonomian nasional. Djazuli (22) menyatakan bahwa sektor perikanan berperan penting terutama dalam penyediaan lapangan kerja, sumber pendapatan bagi nelayan, sumber protein hewani yang bernilai gizi tinggi serta sumber devisa negara yang sangat potensial. Usaha peningkatan produktivitas budi daya udang di tambak sering mengalami kendala yaitu munculnya berbagai serangan penyakit pada udang. Vibriosis merupakan penyakit udang utama di tambak yang disebabkan oleh bakteri patogen Vibrio. Bakteri berpendar Vibrio harveyi merupakan penyebab utama kematian massal udang di tambak pada tahap larva (Rengpipat et al. 1998; Muliani et al. 23). Berbagai usaha penanggulangan penyakit udang telah banyak dilakukan, diantaranya dengan pemberian antibiotik. Penggunaan antibiotik dalam penanganan penyakit udang dapat menyebabkan resistensi pada bakteri, menimbulkan residu antibiotik dan pencemaran lingkungan. Oleh karena itu, perlu adanya alternatif biokontrol dalam penanggulangan penyakit udang sehingga didapat produk udang yang bebas bakteri patogen dan residu antibiotik yang sesuai syarat mutu produk pangan. Probiotik memberikan alternatif sebagai biokontrol pertumbuhan bakteri patogen yang aman bagi lingkungan dan organisme budi daya (Moriarty 1999). Probiotik dalam akuakultur merupakan mikroba hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang, menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan, memperbaiki respon inang terhadap penyakit, dan memperbaiki kualitas lingkungan (Verschuere et al. 2). Salah satu mikrob probiotik yang banyak diteliti ialah jenis Bacillus. Bacillus merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang, memiliki endospora, bersifat motil dan tergolong ke dalam bakteri aerob atau fakultatif anaerob (Holt et al. 1994). Genus Bacillus merupakan bakteri yang sangat baik digunakan sebagai kandidat agen biokontrol karena dapat menghasilkan beberapa metabolit aktif seperti antibiotik, proteinase dan bakteriosin (Torkar & Matijasic 23). Pada umumnya antimikrob yang dihasilkan Bacillus berupa polipeptida seperti bakteriosin dan antibiotik. Beberapa antibiotik Bacillus sp. yang telah diidentifikasi ialah polymiksin, colistin, tyrotrisin, basitrasin dan gramisidin S (Katz & Demain 1977). Beberapa jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus ialah subtilin (B. subtilis), megacin (B. megaterium), ericin (B. subtilis), lichernin (B. licherniformis), coagulin (B. coagulans), cerein (B. cereus), dan thuricin (B. thuringiensis) (Lisboa et al. 26; Torkar & Matijasic 23). Dalam usaha penapisan suatu senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. hasil isolasi dari tambak udang maka dilakukan uji aktivitas dan produksi senyawa aktifnya secara in vitro. Tujuan Penelitian ini bertujuan mengetahui aktivitas penghambatan zat antimikrob dari beberapa isolat Bacillus sp. yang diisolasi dari tambak udang. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai dengan Juni 27 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi FMIPA IPB. BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan ialah isolat Bacillus sp. LTC 5, LTC 8, LTC 13, LTC 39, LTW 54 dan LTW 4 hasil penelitian sebelumnya yang berhasil diisolasi dari tambak udang. Bakteri indikator yang digunakan untuk menguji aktivitas antimikrob Bacillus sp. yaitu bakteri Vibrio harveyi, Escherichia coli dan Staphylococcus aureus koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi FMIPA IPB. Media yang digunakan ialah media cair Sea Water Complete (SWC) 5% dengan komposisi (g/l) air laut 75 ml, akuades 25 ml, bakto pepton 2.5 g, ekstrak khamir 1.5 g, dan gliserol 1.5 ml. Media agar-agar SWC dibuat dengan menambahkan 2 g/l agar-agar dan untuk media SWC semisolid ditambahkan 1 g/l agar-agar. Metode Peremajaan dan Pemurnian isolat Pemurnian dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada media agaragar SWC melalui metode kuadran dan diinkubasi pada suhu ruang (29-31 ºC) selama dua hari. Koloni murni yang diperoleh ditumbuhkan kembali pada media agar-agar cawan.

10 2 Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. Penghasil Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp. diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri indikator V. harveyi, E. coli dan S. aureus dengan menggunakan metode double layer (Lisboa et al. 26). Sebanyak 5 µl bakteri indikator dengan kepadatan sel 1 8 sel/ml disuspensikan kedalam 5 ml SWC semisolid kemudian sebanyak 1 ml dituang pada permukaan media padat SWC. Setelah permukaan media SWC double layer memadat, isolat Bacillus sp. yang berumur dua hari ditotolkan dengan menggunakan jarum ose dan diinkubasi pada suhu 3 ºC selama 24 jam. Bakteri yang memiliki kemampuan untuk menghasilkan zat antimikrob ditunjukkan dari adanya zona bening (zona hambat) di sekitar koloni. Diameter koloni dan zona hambatnya diukur untuk mengetahui nilai indeks penghambatannya. Isolat Bacillus sp. yang memiliki zona hambat terluas akan digunakan untuk uji selanjutnya. Metode Cross-streak Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator Isolat Bacillus sp. yang memiliki indeks zona hambat terluas diuji kembali terhadap bakteri indikator dengan metode cross-streak (Chytanya et al. 22). Satu ose inokulum Bacillus sp. umur 24 jam dalam media SWC cair digoreskan pada media agar-agar kemudian diinkubasi pada suhu 3 ºC selama 24 jam, selanjutnya bakteri indikator digoreskan tegak lurus terhadap goresan Bacillus sp. kemudian diinkubasi pada suhu 3 ºC. Zona hambat yang terbentuk berupa garis lurus pada masing-masing tempat bakteri indikator diinokulasikan kemudian diukur pada inkubasi ke 24 dan 48 jam. Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator Penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap bakteri indikator dilakukan dengan uji kompetisi dalam kultur campuran media SWC cair. Pada lima erlenmeyer berisi 5 ml media SWC cair, masing-masing disuspensikan 1 µl inokulum bakteri indikator umur 24 jam dengan kepadatan sekitar 1 7 sel/ml. Pada erlenmeyer II, III, IV, dan V masing-masing ditambahkan 1 µl, 2 µl, 4 µl dan 1 µl inokulum Bacillus sp. sehingga diperoleh kultur campuran dengan rasio antara bakteri indikator dan Bacillus sp. ialah 1:1, 1:2, 1:4, dan 1:1 (v:v). Erlenmeyer kultur bakteri indikator (tanpa inokulum Bacillus sp.) sebagai kontrol negatif dan satu erlenmeyer yang disuspensikan 1 µl inokulum Bacillus sp. digunakan sebagai kontrol positif. Pada jam ke 24 dan 48 dihitung jumlah sel Bacillus sp. dan bakteri indikator dengan metode cawan sebar pada media agar-agar SWC lalu dihitung jumlah sel dan persentase penghambatannya. Persen penghambatan dihitung dengan cara: %Penghambatan = A B x 1% A Keterangan : A = Jumlah sel bakteri indikator pada kontrol B = Jumlah sel bakteri indikator pada perlakuan Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp. Sebanyak satu ose biakan isolat bakteri Bacillus sp. disubkulturkan pada 5 ml media SWC cair lalu diinkubasi selama enam jam pada suhu ruang diatas shaker dengan kecepatan 94 rpm, kemudian 2 ml inokulum diinokulasikan kedalam 2 ml media produksi SWC cair lalu dishaker. Setiap 6 jam dilakukan pengukuran turbiditas sel pada panjang gelombang 6 nm dan dilakukan pengambilan sampel sebanyak 5 ml kultur dan dimasukan kedalam eppendorf. Biakan bakteri dari setiap pengambilan sampel selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 6 rpm selama 15 menit kemudian dilakukan pemisahan supernatan dari filtrat selnya untuk diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri indikator dengan menggunakan metode double layer. Pada metode double layer, 5 µl bakteri indikator dengan kepadatan sel 1 8 sel/ml disuspensikan kedalam 5 ml SWC semisolid lalu sebanyak 1 ml dituang pada permukaan media padat SWC dan didiamkan hingga beku. Uji aktivitas antimikrob dari filtrat sel Bacillus sp. dilakukan dengan menotolkan filtrat sel secara langsung dengan menggunakan jarum ose pada permukaan media SWC double layer, kemudian diinkubasi pada suhu 3 o C selama 24 jam. Aktivitas supernatan bebas sel dilakukan dengan meneteskan supernatan sebanyak 2 µl pada kertas cakram berdiameter 6 mm dan dibiarkan mengering terlebih dahulu kemudian cakram diletakan pada permukaan media SWC double layer. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 3 o C selama 24 jam dan dilakukan pengukuran diameter zona hambat yang terbentuk di sekitar kertas cakram. Zona hambat yang paling luas menunjukkan waktu produksi antimikrob yang optimum.

11 2 Hasil HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas Penghambatan Isolat Bacillus sp. Penghasil Zat Antimikrob Isolat murni Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari lingkungan tambak udang memiliki morfologi koloni bulat berwarna krem setelah diinkubasi 2 hari pada media SWC. Seleksi untuk mengetahui aktivitas penghambatan antimikrob yang dimiliki isolat isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari tambak udang dilakukan dengan uji kompetisi isolat tersebut terhadap bakteri indikator V. harveyi, E. coli dan S. aureus dengan menggunakan metode double layer. Dari enam isolat yang diuji kompetisi didapatkan 5 isolat yang menunjukkan adanya aktivitas antimikrob terhadap S. aureus, 4 isolat diantaranya dapat menghambat V. harveyi dan hanya 2 isolat yang dapat menghambat E. coli (Tabel 1). Isolat Bacillus sp. LTW 4 memiliki penghambatan yang paling maksimum yaitu terhadap E. coli dengan indeks penghambatan mencapai 1.4, terhadap V. harveyi sebesar 1.11, dan terhadap S. aureus sebesar.47, sedangkan isolat Bacillus sp. LTC 8 merupakan isolat yang memiliki indeks penghambatan paling maksimum terhadap S. aureus dan V. harveyi dengan indeks penghambatan mencapai.75 dan terhadap E. coli sebesar.67. Oleh karena itu, isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 merupakan isolat terpilih yang akan dianalisis lebih lanjut untuk dikarakterisasi aktivitas penghambatan senyawa antimikrobnya terhadap bakteri indikator. (a) (b) Gambar 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. dengan menggunakan metode double layer terhadap (a) E. coli dan (b) V. harveyi (1. LTW 4, 2. LTW 54, 3. LTC 39, 4. LTC 13, 5. LTC 8, dan 6. LTC 5). Tabel 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terhadap bakteri indikator dengan metode double layer Isolat Ø koloni (mm) Aktivitas penghambatan terhadap Vibrio harveyi Escherichia coli Staphylococcus aureus Ø zona Ø Ø zona Ø Ø zona bening koloni bening koloni bening (mm) IP (mm) (mm) IP (mm) (mm) LTW LTC LTC LTC LTW LTC Keterangan : IP = Indeks Penghambatan (-) = tidak ada penghambatan IP

12 4 Tabel 2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terpilih terhadap bakteri indikator dengan metode cross-streak Zona hambat (mm) Inkubasi 24 jam Inkubasi 48 jam Isolat V. harveyi E. coli S. auerus V. harveyi E. coli S. auerus LTW LTC Metode Cross-streak Isolat Bacillus sp. terhadap Bakteri Indikator Isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 sebagai isolat terpilih yang memiliki aktivitas penghambatan paling baik diuji kembali terhadap bakteri indikator dengan metode cross-streak. Pada metode ini isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 dapat menghambat semua bakteri indikator dengan hambatan maksimum terhadap S. aureus. Pada inkubasi 24 jam, isolat Bacillus sp. LTW 4 memiliki zona hambat terhadap S. aureus sebesar mm, terhadap E. coli sebesar 9 mm dan terhadap V. harveyi sebesar 6.5 mm. Isolat Bacillus sp. LTC 8 memiliki zona hambat paling maksimum yaitu terhadap S. aureus mencapai 2 mm, terhadap E. coli sebesar 8 mm dan terhadap V. harveyi sebesar 6 mm (Tabel 2). Pada inkubasi 48 jam, aktivitas penghambatan kedua isolat tersebut terhadap bakteri indikator tidak mengalami peningkatan. jumlah sel bakteri indikator yang dikompetisikan dengan isolat Bacillus sp. lebih rendah dibandingkan kontrol negatif (bakteri indikator tanpa isolat Bacillus sp.). Pada inkubasi 24 jam, isolat Bacillus sp. LTW 4 memiliki daya hambat paling maksimum yaitu terhadap E. coli dengan persen penghambatan mencapai 98.33% (Lampiran 1). % Penghambatan : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 1 Rasio inokulum V. harveyi + LTW 4 E.coli + LTW 4 S.aureus + LTW 4 (a) Gambar 2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator dengan metode cross-streak. Uji Kompetisi terhadap Bakteri Indikator Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terpilih LTW 4 dan LTC 8 terhadap bakteri indikator dalam kultur campuran menunjukkan bahwa kedua isolat Bacillus sp. tersebut mampu menghambat pertumbuhan semua bakteri indikator dengan daya hambat yang berbeda-beda. Hal ini terlihat dari % Penghambatan Gambar 3 1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 1 Rasio inokulum V. harveyi + LTW 4 E. coli + LTW 4 S. aureus + LTW 4 (b) Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. LTW 4 terhadap bakteri indikator pada inkubasi (a) 24 jam dan (b) 48 jam (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2).

13 Aktivitas penghambatan masing masing perlakuan mengalami peningkatan pada inkubasi 48 jam dengan aktivitas penghambatan maksimum terhadap E. coli dan S. aureus dengan persen penghambatan mencapai 1%, sedangkan terhadap V. harveyi persen penghambatannya 81.89% (Gambar 3 (b)). Isolat Bacillus sp. LTC 8 pada inkubasi 24 jam, memiliki persentase penghambatan paling maksimum hingga 1% yaitu terhadap S. aureus (Gambar 4). Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya koloni S. aureus yang tumbuh pada media, karena pertumbuhannya dihambat Bacillus sp.. Persentase penghambatan isolat ini pada inkubasi 48 jam mengalami peningkatan, yaitu terhadap E. coli mencapai % dan memiliki daya hambat terendah terhadap V. harveyi sebesar 56.44% (Lampitan 2). % Penghambatan % Penghambatan Gambar 4 1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 1 V. harveyi + LTC 8 E. coli + LTC 8 S. aureus + LTC 8 Rasio inokulum (a) 1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 1 V. harveyi + LTC 8 E coli + LTC 8 S. aureus + LTC 8 Rasio inokulum (b) Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator pada inkubasi (a) 24 jam dan (b) 48 jam (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2). Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob Isolat Bacillus sp. Produksi senyawa antimikrob dan uji aktivitas penghambatan filtrat sel dan supernatan isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 yang dipanen setiap 6 jam ditunjukkan dengan luasnya zona hambat dengan metode double layer. Hasil uji aktivitas kedua isolat tersebut menunjukkan aktivitas antimikrobnya hanya terhadap S. aureus (Gambar 5), sedangkan pada E. coli dan V. harveyi kedua isolat tersebut tidak menunjukkan zona penghambatan. Aktivitas antimikrob isolat Bacillus sp. LTW 4 hanya dihasilkan oleh selnya sedangkan supernatan bebas selnya tidak menunjukkan zona penghambatan (Lampiran 3). Hasil pengukuran serapan optik yang diplotkan terhadap selang waktu inkubasi, diperoleh kurva pertumbuhan isolat Bacillus sp. LTW 4 pada media SWC cair dan juga aktivitas antimikrobnya, seperti yang terlihat pada Gambar 5. Senyawa antimikrob mulai diproduksi pada fase eksponensial pertumbuhan yaitu pada waktu inkubasi 24 jam sampai 42 jam dengan aktivitas antimikrob tertinggi ialah pada inkubasi 36 jam dengan zona hambat 16.5 mm. Zona hambatan yang paling luas menunjukkan waktu produksi senyawa antimikrob yang optimum. Log CFU/ ml Jumlah sel Waktu (jam) Zona hambat Zona hambat (mm) Gambar 5 Aktivitas antimikrob sel Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2). Aktivitas penghambatan terhadap S. aureus ditunjukkan oleh sel maupun supernatan isolat Bacillus sp. LTC 8 (Lampiran 4). Aktivitas antimikrobnya dari sel isolat Bacillus sp. LTC 8 mulai diproduksi pada fase eksponensial pertumbuhan, yaitu pada waktu inkubasi 6 jam sampai 42 jam dengan aktivitas penghambatan optimum ialah pada inkubasi 18 jam dengan zona hambat mm (Gambar 6 (a)). Aktivitas senyawa

14 antimikrob dari supernatan bebas sel isolat Bacillus sp. LTC 8 mulai diproduksi pada fase eksponensial yaitu pada inkubasi 6 jam sampai inkubasi 24 jam dengan aktivitas optimum ialah pada inkubasi 12 jam dan zona hambat 18.5 mm (Gambar 6 (b)). Log CFU/ ml Log CFU/ml Waktu (jam) Jumlah sel zona hambat (a) Jumlah sel Waktu (jam) (b) Zona hambat Zona hambat (mm) Zona hambat (mm) Gambar 6 Aktivitas antimikrob isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus (a) filtrat sel dan (b) supernatan bebas sel (data menunjukkan nilai rataan ± SE, n = 2). Gambar 7 Aktivitas penghambatan supernatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus selama pertumbuhan. Pembahasan Bacillus sp. merupakan bakteri yang umum ditemukan pada sedimen dan saluran pencernaan udang (Moriarty 1999). Pada penelitian ini menggunakan isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari pencernaan udang, air dan sedimen tambak, sebagai agen penghasil senyawa antimikrob. Penggunaan isolat yang diisolasi dari lingkungan tambak sebagai bakteri kandidat probiotik akan lebih menguntungkan. Isolat tersebut akan lebih mudah beradaptasi, mempertahankan diri, dan berkembang dalam lingkungan perairan (Isnansetyo 25). Seleksi untuk mengetahui aktivitas penghambatan zat antimikrob yang dimiliki isolat isolat Bacillus sp. yang berhasil diisolasi dari tambak udang dilakukan dengan uji kompetisi isolat tersebut secara in vitro terhadap bakteri indikator V. harveyi, E. coli dan S. aureus. Bakteri berpendar V. harveyi merupakan indikator terjadinya serangan penyakit udang vibriosis di tambak udang (Rengpipat et al. 1998). E. coli dan S. aureus merupakan standar bakteri indikator yang sering digunakan dalam pengujian bakteri penghasil senyawa antimikrob. Selain itu, E. coli merupakan salah satu syarat mutu produk udang yang harus bebas dari cemaran mikroba patogen (BSN 1992). Pada metode double layer, isolat Bacillus sp. diujikan secara bersamaan dengan bakteri indikator dalam dua lapisan media yang memungkinkan senyawa antimikrob yang dihasilkan dapat berdifusi dengan baik pada media semisolid sehingga didapat zona bening yang terlihat jelas. Isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 merupakan isolat terpilih yang memiliki penghambatan paling baik terhadap V. harveyi, E. coli dan S. aureus. Aktivitas penghambatan yang baik dari kedua isolat Bacillus sp. tersebut dalam menghambat semua bakteri indikator juga dibuktikan dengan metode cross-streak. Pada metode ini zona hambat yang dihasilkan tampak lebih jelas karena isolat Bacillus sp. dan bakteri indikator tidak dikompetisikan secara bersama. Isolat Bacillus sp. ditumbuhkan terlebih dahulu sehingga dapat langsung melakukan penghambatan dengan mengekskresikan senyawa antimikrobnya ketika diujikan dengan bakteri indikator. Hal ini menunjukkan bahwa kedua isolat Bacillus sp. tersebut dapat menghasilkan senyawa antimikrob dengan penghambatan yang luas karena dapat menghambat bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

15 Aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri tidak selalu dapat diamati dengan melihat adanya zona bening pada media padat. Hasil uji kompetisi isolat Bacillus sp. terhadap masing-masing bakteri indikator dalam kultur campuran menunjukkan pertumbuhan jumlah sel bakteri indikator menurun. Penurunan tersebut dapat disebabkan oleh adanya produksi senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp.. Pada inkubasi 48 jam, isolat Bacillus sp. LTW 4 dapat menghambat E. coli dan S. aureus dengan persen penghambatan mencapai 1 %, dan terhadap V. harveyi persen penghambatannya sebesar 81.89% (Lampiran 1). Persentase penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap S. aureus mencapai 1%, terhadap E. coli mencapai 94.89% dan terhadap V. harveyi sebesar 56.44% (Lampiran 2). Menurut Verschuere et al. (2) penghambatan pertumbuhan tidak selalu berkaitan dengan produksi senyawa antimikrob seperti antibiotik, tetapi dapat juga karena adanya senyawa metabolit primer atau adanya perubahan ph. Penghambatan kedua isolat Bacillus sp. tersebut terhadap bakteri indikator terutama terhadap V. harveyi yang merupakan penyebab utama penyakit vibriosis menunjukkan bahwa kedua isolat tersebut dapat diaplikasikan di tambak sebagai mikrob kandidat probiotik. Rengpipat et al. (1998) menggunakan probiotik bakteri Bacillus strain S11 yang diberikan pada larva udang, dapat meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup larva udang windu. Mekanisme kerja probiotik dapat berupa produksi senyawa inhibitor, kompetisi nutrisi dan sumber energi yang tersedia dan kompetisi tempat pelekatan pada tubuh inang. Probiotik juga sebagai sumber nutrisi makro dan mikro inang dan memberikan kontribusi enzim pencernaan yang dapat meningkatkan respon kekebalan inang. Selain itu, probiotik dapat berinteraksi dengan fitoplankton dan dapat memperbaiki kualitas air (Verschuere et al. 2). Adapun persyaratan yang harus dimiliki oleh mikrob probiotik antara lain ialah tidak bersifat patogen bagi inang dan konsumennya serta tidak mengganggu keseimbangan ekosistem setempat. Selain itu, mikrob tersebut harus dapat bertahan hidup dan dapat berkembangbiak dalam usus maupun dalam wadah pemeliharaan, serta mudah dipelihara dan diperbanyak (Feliatra et al. 24). Aktivitas antimikrob filtrat sel dan supernatan bebas sel Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 hanya menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap S. aureus, sedangkan pada E. coli dan V. harveyi kedua isolat tersebut tidak menunjukkan zona penghambatan. Aktivitas penghambatan antimikrob kedua isolat Bacillus tersebut hanya menghambat bakteri Gram positif yang menunjukkan bahwa produksi senyawa antimikrob yang diproduksinya hanya menghambat spesifik bakteri Gram positif. Hal ini sama dengan yang dilaporkan Aslim (22) yang menunjukkan bahwa aktivitas antimikrob dari strain Bacillus memiliki penghambatan paling baik pada bakteri Gram positif dari pada bakteri Gram negatif. Aktivitas penghambatan terhadap S. aureus yang ditunjukkan isolat Bacillus sp. LTW 8 memiliki perbedaan dengan isolat Bacillus sp. LTC 4. Isolat Bacillus sp. LTC 4 aktivitas penghambatannya hanya ditunjukkan dari aktivitas filtrat selnya yang menunjukkan bahwa antimikrobnya dihasilkan secara ekstraseluler. Perbedaan tersebut dapat diduga bahwa kedua isolat tersebut menghasilkan jenis senyawa antimikrob yang berbeda. Menurut Sudirman (1997) satu spesies mikroba dapat menghasilkan banyak antimikrob dan banyak mikroba yang berbeda dapat menghasilkan jenis antimikrob yang sama. Kurva pertumbuhan isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 menunjukkan senyawa antimikrobnya paling optimum diproduksi pada fase eksponensial pertumbuhan. Berdasarkan ciri tersebut dapat diduga bahwa senyawa antimikrob yang dihasilkan kedua isolat Bacillus sp. tersebut dapat berupa bakteriosin. Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Torkar & Matijasic (23) bahwa produksi bakteriosin B. thuringiensis dihasilkan pada fase pertumbuhan eksponensial. Akan tetapi, untuk memastikan jenis senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 perlu dilakukan uji karakterisasi lebih lanjut. Bakteriosin merupakan senyawa antimikrob yang terdiri atas protein atau polipeptida yang disintesis oleh ribosom dan biasanya menghambat spesies bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin (Jack et al. 1995; Klaenhammer 1993). Bakteriosin dapat dibedakan dari antibiotik diantaranya dari proses produksinya yang dihasilkan pada saat pertumbuhan bakteri mencapai fase logaritmik, sedangkan antibiotik diproduksi pada saat akhir fase stasioner (Jack et al. 1995). Mekanisme kerja bakteriosin dalam menghambat pertumbuhan

16 bakteri dapat dilakukan melalui hambatan terhadap pembentukkan dinding sel target, menghambat pembentukkan asam nukleat atau menghambat pembentukkan protein, dan berupa pembentukkan pori-pori pada membaran sel target sehingga permeabilitas membran sel terganggu (Williams et al. 1996). Mekanisme kerja bakteriosin diketahui bergantung pada konsentrasi bakteriosin, kemampuan ionisasi, suhu, ph, dan fase pertumbuhan sel target (Hurst 1981). Berdasarkan hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pada inkubasi 48 jam dengan metode double layer aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 mengalami penurunan yang ditunjukkan dengan semakin menyempitnya zona hambat. Hal ini karena inkubasi yang dilakukan lebih dari waktu optimum produksi senyawa antimikrob dalam media. Dajani dan Wannamaker (1969) melaporkan inkubasi yang terlalu lama menyebabkan aktivitas bakteriosin menurun, hal ini kemungkinan disebabkan diproduksinya inaktivator atau enzim pencernaan dan adanya reabsobsi terhadap senyawa antimikrob yang diproduksi sel. Menurut Jo et al. (1996) jika waktu inkubasi diperpanjang maka aktivitas bakteriosin menurun hal ini karena terbebasnya protease dari sel autolisis, karena bakteriosin merupakan molekul proteaneus sehingga mudah terdegradasi. Aktivitas penghambatan pada metode double layer tersebut berbeda dengan hasil uji kompetisi isolat tersebut dalam kultur campuran yang aktivitasnya mengalami peningkatan pada inkubasi 48 jam. Perbedaan aktivitas tersebut dapat disebabkan oleh adanya perbedaan konsentrasi senyawa antimikrob yang dihasilkan. Bakteriosin dapat dihasilkan oleh bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif (Jack et al. 1995). Sebagian besar bakteriosin dihasilkan oleh bakteri Gram positif terutama yang paling banyak diteliti ialah dari genus Bacillus. Beberapa jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus yang telah diidentifikasi diantaranya ialah coagulin yang dihasilkan oleh B. coagulans I 4 yang diisolasi dari feses hewan (Hyronimus et al. 1998). Bizani et al. (1995) melaporkan jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri tanah B. cereus strain 8A yaitu cerein 8A. Selain itu, terdapat jenis bakteriosin yang telah diaplikasikan di industri yaitu bacillocin 49 yang dihasilkan oleh bakteri termofilik B. liceniformis (Martirani et al. 22). Aktivitas bakteriosin dinyatakan hanya menghambat spesies spesifik tapi beberapa bakteriosin telah dibuktikan memiliki aktivitas spektrum penghambatan yang luas sehingga dapat diaplikasikan secara luas di industri (Jack et al. 1995). Beberapa bakteriosin telah digunakan sebagai pengawet makanan dan terapeutik. Salah satu bakteriosin yang telah dikembangakan sebagai pengawet makanan ialah nisin yang telah dinyatakan tergolong dalam kelompok GRAS (Generally Recogenized As Safe) oleh FAO dan WHO (Joerger 23). Isolat Bacillus sp. LTC 8 terbukti memiliki penghambatan yang luas. Hal ini berdasarkan hasil uji aktivitas penghambatannya terhadap bakteri indikator V. harveyi, E. coli dan S. aureus, dengan menggunakan metode cross-streak, uji kompetisi dalam kultur campuran dan metode double layer. Oleh karena itu, isolat Bacillus sp. LTC 8 berpotensi untuk diaplikasikan di industri. SIMPULAN Dari 6 isolat Bacillus sp. hasil isolasi dari tambak udang yang memiliki aktivitas antimikrob yang paling baik ialah isolat Bacillus sp. LTC 8. Berdasarkan hasil uji aktivitas dengan metode double layer, metode cross-streak dan uji kompetisi, isolat tersebut dapat menghambat V. harveyi, E. coli dan S. aureus dan memiliki penghambatan paling baik terhadap S. aureus. Aktivitas senyawa antimikrob isolat Bacillus sp. LTW 4 dan LTC 8 dihasilkan pada fase eksponensial pertumbuhannya. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melakukan karakterisasi antimikrob terhadap ph dan suhu optimum, pemurnian dan penentuan bobot molekul zat antimikrob dari isolat Bacillus sp. LTC 8, sehingga dapat diketahui jenis senyawa antimikrobnya. DAFTAR PUSTAKA Aslim B, Saglam N, Beyatli Y. 22. Determination of some properties of Bacillus isolated from soil. Turk J Biol 26:

17 Bizani D, Motta AS, Morrissy JA, Terra RM, Souto AA, Brandelli A Antibacterial activity of cerein 8A, a bacteriocin-like peptide produced by Bacillus cereus. Microbiol Rev 59 (2): [BSN] Badan Standarisasi Nasional Standar nasional Indonesia produk perikanan: SNI udang segar. Jakarta: BSN. Chytanya R, Karunasagar I, Karunasagar I. 22. Inhibition of shirmp phatogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture 28: 1-1. Dajani AS, Wannamaker LW Demonstration of bactericidal substance against beta-hemolytic streptococci in supernatant fluids of stapylococcal cultures. J Bacteriol 97: Djazuli N. 22. Penanganan dan pengolahan produk perikanan budidaya dalam mengahadapi pasar global: peluang dan tantangan. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB. Feliatra, Efendi I, Suryadi E. 24. Isolasi dan identifikasi bakteri probiotik dari ikan kerapu macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam upaya efisiensi pakan ikan. J Natur Indones 6 (2): Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Philadelphia: Lipponicott Williams & Wilkins. Hurst A Nisin advances. J Appl Microbiol 27: Hyronimus B, Marrec CL, Urdaci MC Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produce by Bacillus coagulans I 4. J Appl Microbiol 85: Isnansetyo A. 25. Bakteri antagonis sebagai probiotik untuk pengendalian hayati pada aquakultur. J Perikan 7 (1): 1-1. Jack RW, Tagg JR, Ray B Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol Rev 59: Jo YB, Kyung MB, Sung-Koo K, Hong-ki J Evaluation at optimum conditions for bacteriocin production from Lactobacillus sp. JB-42 isolated from kimichi. J Microbiol Biotechnol 6: Joerger RD. 23. Alternative to antibiotics: bacteriocins, antimicrobial peptides and bacteriophages. Poultry Sci 85: Katz E, Demain AL Peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis and possible function. Bacteriol Rev 41: Klaenhammer TR Bacteriocins of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 12: Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 26. Characterization of a baktriosin-like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens islolated from the Brazillian atlantic forest. Intern Micobiol 9: Martirani L, Varcamonti M, Naclerio G, Felice M de. 22. Purification and partial characterization of bacillocin 49, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis. Microbiol Cell Factories 1: 1-5. Moriarty DJW Disesase control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. Di dalam: Bell CR, Brylinsky M, Johnson GP, editor. Microbial Biosystem: New Frontiers. Proceeding of the 8 th International Symposium on Microbial Ecology. Canada. Muliani, Suwanto A, Hala Y. 23. Isolasi dan karakterisasi bakteri asal laut Sulawesi untuk biokontrol penyakit vibriosis pada larva udang windu (Penaeus monodon Fab.). Hayati 1 (1): Rengpiapat S, Phianphak W, Piyatira titivorakul S, Menaveta P Effects of a probiotic bacterium on black tiger shirmp Penaeus monodon survival and growth. Aquaculture 167: Sudirman LI Potensi keragaman hayati mikroorganisme dalam menghasilkan senyawa antimikroba. Kumpulan Abstrak Konas 7 Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia; Denpasar, 8-1 Desember Torkar KG, Matijasic BB. 23. Partial characterisation of bacteriocins produced by Bacillus cereus isolat from milk and milk products. Food Technol 41 (2): Verschuere L, Geert R, Patrick S,Willy V. 2. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture [ulas balik]. J Microbiol and Mol Biol 64 (4): Williams RAD, Lambert PA, Singleton P Antimicrobial Drug Action. UK: Scientific Publisher Ltd.

18 LAMPIRAN

19 Lampiran 1 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTW 4 terhadap bakteri indikator (data menunjukkan rataan ± SE) % Penghambatan Rasio Inkubasi 24 jam Inkubasi 48 jam inokulum V. harveyi E. coli S. aureus V. harveyi E. coli S. aureus 1: ± ± ± ± ± ±.16 1: ± ± ± ± ± ±.9 1: ± ± ± ± ± ±.9 1: ± ± ± ± ± 1 ± Lampiran 2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. LTC 8 terhadap bakteri indikator (data menunjukkan rataan ± SE) % Penghambatan Rasio Inkubasi 24 jam Inkubasi 48 jam inokulum V. harveyi E. coli S. aureus V. harveyi E. coli S. aureus 1: ± ±.2 1 ± ± ±.26 1 ± 1: ± ± ± ± ± ± 1: ± ±.14 1 ± ± ± ± 1: ± ±.2 1 ± ± ± ± Lampiran 3 Aktivitas antimikrob sel Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus (data menunjukkan rataan ± SE) Jam ke- Jumlah sel (1 6 ) Zona hambat (mm) 6.47 ± ± ± ± ± ± ± ±.25 Lampiran 4 Aktivitas antimikrob sel dan supernatan Bacillus sp. LTW 4 terhadap S. aureus (data menunjukkan rataan ± SE) Zona hambat (mm) Jam ke- Jumlah sel (1 6 ) Sel Supernatan ± 18 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1 ± ± ±