BAB III METODE PENELITIAN. A. Waktu dan Tempat Penelitian. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-November 2012 di

Transkripsi

1 digilib.uns.ac.id BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-November 2012 di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta. B. Bahan dan Alat 1. Bahan a. Mikroorganisme Penelitian ini menggunakan isolat S. maltophilia strain Y28 yang diisolasi dari saluran pencernaan larva A. atlas oleh Fiatun (2010). Kultur bakteri dalam media LA disimpan pada suhu 4 o C. Peremajaan isolat dilakukan setiap bulan dengan menanam kembali dalam media LA. Bakteri yang dipilih adalah bakteri yang memiliki aktivitas xilanolitik tertinggi ditunjukkan dengan pembentukan zona bening yang paling luas berdasarkan hasil skrining dan identifikasi oleh Salupi (2011) yaitu S. maltophilia strain Y28 b. Media Media untuk peremajaan isolat adalah LB (Luria-Bertani Broth) dan media LA (Luria-Bertany Agar) dengan komposisi 3% LA dan 1% agar. Media produksi enzim dibuat dalam (g/l): KH 2 PO 4 1,0; K 2 HPO 4 1,45; MgSO 4.7H 2 O 0,4; (NH 4 ) 2 SO 4 5,0; CaCl 2.2H 2 O 0,05; FeSO 4.7H 2 O 0,00125; 20 g/l serbuk tongkol jagung sebagai sumber karbon dan 1 g yeast extract. 22

2 digilib.uns.ac.id 23 c. Serbuk tongkol jagung Sumber karbon yang digunakan adalah serbuk tongkol jagung Bisi 2 berasal dari limbah pertanian 2. Alat a. Alat untuk Pemeliharaan Isolat Bakteri A. atlas Cawan petri, jarum ose, erlenmeyer, bunsen, korek api, autoklaf, laminar air flow, inkubator. b. Alat untuk pembuatan serbuk tongkol jagung Pisau, blender, saringan 40 mesh, oven. c. Alat untuk pengukuran pertumbuhan bakteri S. maltophilia strain Y28 dan aktivitas xilanase cawan petri, Colony Counter, mikropipet, sentrifuge, dan spektrofotometer UV-VIS. C. Rancangan Percobaan Optimasi dilakukan secara bertahap meliputi: a) Optimasi suhu dilakukan selama 48 jam, dan pengambilan sampel setiap 4 jam sekali b) Optimasi suhu dengan variasi suhu 30, 40, 50 dan 60 ( o C) c) Optimasi ph dengan variasi ph 7, 8, 9 dan 10 D. Cara Kerja 1. Pembuatan Serbuk Tongkol Jagung Tongkol jagung dipotong kecil hingga berukuran 2 x 2 cm dan dikeringanginkan selama tujuh hari. Selanjutnya tongkol jagung tersebut

3 digilib.uns.ac.id 24 digiling dengan menggunakan blender hingga menjadi serbuk. Tongkol jagung disaring dengan saringan berukuran 40 mesh. 2. Perlakuan Pendahuluan Serbuk Tongkol Jagung Serbuk tongkol jagung direndam dalam NaOCl 15% (natrium hipoklorit) selama 4-5 jam. Delignifikasi ini bertujuan untuk menghilangkan lignin yang berikatan dengan xilan. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan akuades. Serbuk tongkol jagung direndam dalam larutan NaOH 1 gr/100 ml pada suhu ruang selama 24 jam. Perendaman dalam NaOH bertujuan agar menghasilkan serbuk tongkol jagung dengan warna lebih putih, relatif bersih dari pengotor dan mudah larut dalam air. Kemudian diasamkan dengan HCl 6 N hingga ph Asidifikasi dilakukan berdasarkan sifat xilan yang tidak larut dalam larutan asam. Setelah itu disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan putaran 4000 rpm untuk memisahkan endapan yang mengandung xilan dengan supernatan. Serbuk tongkol jagung dibilas dengan akuades sampai bersih. Dimasukkan ke dalam oven pada suhu 50 o C selama 12 jam. 3. Pembuatan Media a) Media Produksi Media produksi sebanyak 100 ml dibuat dengan memasukkan 2 g serbuk tongkol jagung yang telah dilakukan pretreatment; KH 2 PO 4 0,001 g; K 2 HPO 4 (0,00145 g; MgSO 4.7H 2 O 0,0004 g; (NH 4 ) 2 SO 4 0,005 g; CaCl 2.2H 2 O 0,00005 g; FeSO 4.7H 2 O 0, dan yeast extract 0,001 g ke dalam 80 ml aquades. Campuran kemudian dilarutkan dan diencerkan

4 digilib.uns.ac.id 25 hingga 100 ml. Media disterilisasi pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. b) Media LB (Luria-Bertany Broth) Sebanyak 0,5% yeast ekstrak, 0,5% NaCl, dan 1% Tripton dan akuades dihomogenkan dengan magnetic stirrer dan dipanaskan hingga larut. Larutan disterilisasi pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. c) Media LA (Luria-Bertany Agar) Sebanyak 0,5% yeast ekstrak, 0,5% NaCl, 1% Agar, 1% Tripton dan akuades dihomogenkan dengan magnetic stirrer dan dipanaskan hingga larut. Larutan disterilisasi pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. 4. Pemeliharaan Biakan Isolat bakteri TSA-6.A/TTS-D dipelihara pada media miring LA dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah tumbuh sebagian biakan disimpan dalam lemari pendingin (4 o C) sebagai biakan stok (stock culture) dan sebagian lagi digunakan sebagai inokulum. 5. Penyiapan Inokulum Penyiapan inokulum dilakukan dengan memindahkan biakan (satu ose) dari media LA miring ke dalam Erlenmeyer 250 ml yang berisi 50 ml media LB. Inokulum diinkubasi pada incubator shacker dengan kecepatan 120 rpm dan suhu 37 o C selama 24 jam. 6. Pembuatan Kurva Standar Bakteri Kurva standar bakteri dibuat dengan media LB sebanyak 9 ml ditambahkan 1 ml inokulum secara bertingkat. Satu seri pengenceran biakan

5 digilib.uns.ac.id 26 dibuat dengan pengenceran 1/2, 1/4, 1/18, 1/16 dan tanpa pengenceran. Selanjutnya diukur Optical Density (OD) dari seri pengenceran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Biakan dari salah satu tingkat pengenceran dihitung jumlah bakterinya dengan metode cawan sebar permukaan. Dibuat kurva standar antara jumlah bakteri (Sumbu x) dengan OD (Sumbu y). 7. Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Kurva pertumbuhan dibuat untuk mengetahui fase logaritmik. Inokulum yang akan digunakan diambil pada fase logaritmiknya. Biakan bakteri dalam media LB umur 24 jam diambil 2 ml, kemudian dimasukkan ke dalam media LB steril 98 ml dalam erlenmeyer. Setiap 4 jam sekali OD diamati sampai mencapai fase stasioner. 8. Penghitungan Jumlah Koloni Bakteri Sampel sebanyak 1 ml diinokulasikan secara aseptis ke dalam 9 ml NaCl 0,85% sehingga diperoleh pengenceran 10-1, kemudian digojog. Pengenceran selanjutnya dilakukan hal yang sama sampai pengenceran Sebanyak 0,1 ml suspensi dari setiap pengenceran diisolasikan pada media NA dengan metode pour plate, kemudian homogenkan dengan cara memutarmutar cawan seperti angka delapan. Langkah tersebut dilakukan secara duplo. Biakan lalu diinkunbasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Jumlah koloni bakteri dihitung menggunakan Colony Counter dengan persyaratan jumlah koloni bakteri yang tumbuh koloni/cawan.

6 digilib.uns.ac.id Produksi Xilanase a. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Penentuan waktu inkubasi optimum pada produksi xilanase dilakukan dengan mengukur menumbuhkan bakteri pada 98 ml media produksi dan dimasukkan 2 ml inokulum dengan ph awal medium 7. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 o C selama 48 jam dan sampling dilakukan setiap 4 jam. Setelah itu sampel yang didapat disentrifugasi selama 15 menit, suhu 4 o C dan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya diukur gula reduksi untuk menghitung aktivitas xilanase. b. Penentuan Suhu Optimum Penentuan suhu optimum pada produksi xilanase dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada 98 ml media produksi dan dimasukkan 2 ml inokulum dengan ph awal 7. Inkubasi dilakukan dengan variasi suhu 30, 40, 50 dan 60 o C dan waktu inkubasi sesuai hasil optimasi. Setelah itu sampel yang didapat disentrifugasi selama 15 menit, suhu 4 o C dan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya diukur gula reduksi untuk menghitung aktivitas xilanase. c. Penentuan ph Optimum Penentuan ph optimum pada produksi xilanase dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada 98 ml media produksi dan dimasukkan 2 ml inokulum dengan variasi ph 6, 7, 8 dan 9 selama waktu dan suhu optimum. Setelah itu sampel yang didapat disentrifugasi selama 15

7 digilib.uns.ac.id 28 menit, suhu 4 o C dan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya diukur gula reduksi untuk menghitung aktivitas xilanase. 10. Pengukuran Kadar Gula Reduksi dan Aktivitas Xilanase Aktivitas xilanase diukur dengan metode Bailey (1989) yang dimodifikasi yaitu dengan mengukur kadar gula reduksi yang dibebaskan selama reaksi hidrolisis xilan oleh xilanase. Kadar gula reduksi diukur dengan menggunakan metode DNS (Miller, 1959). Substrat yang digunakan adalah oat spelt xylan sebanyak 1 g dalam 100 ml. Sebanyak 0,5 ml enzim kasar dicampur dengan 0,5 ml substrat oat spelt xylan, ditambah 1 ml buffer fosfat (ph 7). Campuran, lalu diinkubasi dalam inkubator shaker selama 30 menit pada suhu 50 o C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 2 ml (3,5 asam dinitrosalisilat) DNS. Campuran dimasukkan dalam pada air mendidih selama 5 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Setelah dingin ditambahkan 1 ml 40% garam rocelle lalu campuran disentrifugasi selama 15 menit pada suhu 4 o C dan 5500 rpm. Gula reduksi yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 540 nm menggunakan spektrofotometer. Kontrol terdiri dari larutan glukosa dengan konsentrasi 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 dan 0,5 mg/ml, masing-masing sebanyak 0,2 ml. Blanko terdiri dari 0,5 ml substrat ditambah 0,5 buffer fosfat ph 7, ditambah 2 ml DNS. Tabung reaksi dimasukkan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Setelah dingin ditambahkan 1 ml 40% garam rocelle lalu campuran divortex. Gula reduksi yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 540 nm menggunakan spektrofotometer.

8 digilib.uns.ac.id 29 Kadar xilosa yang terbentuk selama reaksi ditentukan berdasarkan kurva standar glukosa. Aktivitas enzim xilanase ditentukan dengan persamaan : Pr = (Pt - Po) x P U/ml = Keterangan: Pr Pt : Produk (kadar gula reduksi dalam mg) : Kadar gula reduksi setelah inkubasi (ditentukan berdasarkan kurva standar glukosa) (mg) 1000 : Faktor konversi dalam µmol Po : Kadar gula reduksi kontrol (T=0) ditentukan berdasarkan kurva standar glukosa (mg/ml) P BM T V : Faktor pengenceran : berat molekul glukosa (180,18 g/mol) : Waktu inkubasi : Jumlah volume enzim yang dimasukkan per tabung reaksi (Ghose, 1987) Unit aktivitas xilanase = 1µmol/ menit. Satu unit aktivitas enzim adalah jumlah xilanase yang diperlukan untuk mengubah 1µmol substrat atau menghasilkan 1µmol produk dalam waktu 1 menit (Yang et al., 2005). 11. Pembuatan Kurva Standar Glukosa Sebanyak 0,5 ml larutan glukosa dari masing-masing konsentrasi dimasukkan dalam eppendorf commit dan ditambah to user dengan 0,5 ml substrat oat spelt

9 digilib.uns.ac.id 30 xilan 1% dalam 0,2 buffer fosfat ph 7. Lalu ditambah 2 ml DNS dan diinkubasi pada air mendidih selama 5 menit dan didinginkan pada suhu kamar kemudian ditambahkan 1 ml garam rocelle. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 595 nm. Kurva standar glukosa adalah grafik hubungan absorbansi dengan variasi konsentrasi glukosa. Konsentrasi glukosa dibuat dengan variasi antara 0,1-0,5 (mg/ml). E. Analisis Data Data mengenai optimasi waktu inkubasi, suhu, dan ph yang diperoleh selanjutnya dianalisis menggunakan Analysis of Variance (ANOVA). Uji ANOVA bertujuan untuk mengetahui pengaruh perlakuan (variasi waktu, suhu, ph) terhadap parameter yang diukur. Apabila terdapat beda nyata antara perlakuan dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf signifikan 5%.