KARAKTERISASI ANTIMIKROB BAKTERIOSIN DARI Bacillus sp. GALUR LTC-8 ASAL TAMBAK UDANG ARISWATI BARUNO

Transkripsi

1 KARAKTERISASI ANTIMIKROB BAKTERIOSIN DARI Bacillus sp. GALUR LTC-8 ASAL TAMBAK UDANG ARISWATI BARUNO SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Karakterisasi Antimikrob Bakteriosin dari Bacillus sp. galur LTC-8 asal Tambak Udang adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum pernah dipublikasikan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Mei 2008 Ariswati NIM G

3 ABSTRACT ARISWATI BARUNO. Characterization of Bacteriocin Antimicrobe Produced by Bacillus sp. strain LTC-8 Isolated from Shrimp Pond. Under the direction of IMAN RUSMANA and NISA RACHMANIA MUBARIK. Shrimp disease caused by a luminuous bacterium Vibrio harveyi is the biggest problem in shrimp culture. Bacillus is a bacterium used widely as a probiotic in aquaculture. The bacterium produces polypeptides antimicrobe substances, such as bacteriocin, that inhibit growth of other bacteria. Purification and characterization of antimicrobe substances from Bacillus sp. LTC8 were conducted including their antimicrobe activity against Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. Antimicrobe activity was determined using double layer method. Extracellular polypeptides were precipitated using acetone and ethanol. Purification and molecular weight determination of antimicrobe polypeptides were done by chromatography analysis. The antimicrobes were produced during cell growth, and optimum production was achieved after 36 hours of incubation. The antimicrobe produced by Bacillus sp. strain LTC8 grown in TSB medium had better activity than that grown in SWC medium, either before or after precipitation using acetone and ethanol. The antimicrobe was stable in range ph of 3-11, and after heat treatment of either 50 o C or 100 o C for 20 minutes. Chromatography column analysis resulted 2 fractions (66 and 68 fractions) which had antimicrobe activity against Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. The molecular weight of the protein fractions was around 23 kda and 26 kda. Keywords: Bacillus, bacteriocin, antimicrobe.

4 RINGKASAN Produksi udang dunia dalam beberapa tahun terakhir menunjukkan laju pertumbuhan yang tinggi. Indonesia mampu mengekspor udang dengan nilai sampai 1 milyar dollar per tahun. Akan tetapi produksi ini menghadapi kendala akibat penyakit udang yang disebabkan oleh bakteri patogen Vibrio harveyi. Untuk mengendalikan Vibrio harveyi telah diupayakan dengan pemakaian antibiotik, tetapi efektivitasnya sekarang sangat rendah dan penggunaannya sudah dilarang. Sebagai alternatif, dikembangkan probiotik yang menguntungkan pada inang dan mampu memperbaiki kualitas lingkungan. Spesies Bacillus merupakan bakteri yang secara luas dipakai sebagai probiotik di perairan. Bakteri ini dapat menghasilkan zat polipeptida antimikrob seperti bakteriosin, yang menghambat pertumbuhan bakteri lain. Dalam upaya mengetahui lebih jauh atas antimikrob yang memiliki kemampuan sebagai probiotik tersebut, maka penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi zat antimikrob isolat bakteri Bacillus sp. galur LTC8 yang merupakan koleksi Laboratorium Mikrobiologi Institut Pertanian Bogor. Pengkarakterisasian dilakukan pada zat antimikrob dari Bacilllus sp. galur LTC8 dan diuji aktivitas antimikrobnya terhadap Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus, dan Escherichia coli. Langkah-langkah penelitian adalah dengan melakukan double layer method untuk menguji aktivitas antimikrob, memekatkan zat antimikrob dengan pengendapan memakai pelarut organik aseton dan etanol, uji Bradford untuk mengetahui kadar protein zat antimikrob, mengatur ph filtrat zat antimikrob setelah pemekatan dengan penambahan HCl dan NaOH kemudian menguji aktivitas antimikrobnya, memanaskan zat antimikrob sampai suhu 50 o C dan 100 o C masing-masing selama 10 dan 20 menit kemudian menguji aktivitas antimikrobnya, dan melakukan analisis kromatografi dan SDS-PAGE untuk mendapatkan berat molekul dari zat antimikrob. Hasil penelitian menunjukkan bahwa zat antimikrob mampu menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus, dan Escherichia coli. Zat antimikrob dihasilkan selama pertumbuhan sel Bacillus sp. dengan hasil optimum dicapai setelah inkubasi selama 36 jam. Zat antimikrob yang dihasilkan oleh Bacillus sp. galur LTC8 yang ditumbuhkan pada media TSB memiliki aktivitas yang lebih baik daripada yang ditumbuhkan di media SWC baik sebelum maupun setelah pengendapan dengan pelarut organik aseton dan etanol, menghambat pertumbuhan bakteri target pada kisaran ph 3-11, tetap memiliki aktivitas antimikrob pada pemanasan 100 o C selama 20 menit. Uji kromatografi menghasilkan 2 fraksi (fraksi 66 dan 68) yang memiliki aktivitas antimikrob terhadap V. harveyi, S. aureus, dan E. coli dengan berat molekul masing-masing berkisar 23 kda dan 26 kda. Kata kunci: Bacillus, bakteriosin, antimikrob

5 Hak Cipta milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

6 KARAKTERISASI ANTIMIKROB BAKTERIOSIN DARI Bacillus sp. GALUR LTC-8 ASAL TAMBAK UDANG ARISWATI BARUNO Tesis sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

7 Judul Tesis Nama NIM : Karakterisasi Antimikrob Bakteriosin dari Bacillus sp. galur LTC-8 asal Tambak Udang : Ariswati Baruno : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. Ketua Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dedy Duryadi, DEA. Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodipuro, MS. Tanggal ujian: 19 Mei 2008 Tanggal lulus:

8 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Dinamella Wahyuningrum

9 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jayapura, 21 April 1969, yang merupakan putri kedua dari empat bersaudara pasangan Ayahanda Iman Slamet Subagyo dan Ibunda Suprapti. Penulis menikah dengan Ir. Achadi Budi Cahyono, M.Kes. dan dikaruniai satu putera dan tiga putri. Pendidikan yang telah ditempuh penulis adalah di SDN Keputran VI Yogyakarta tahun 1982, kemudian SMPN 2 Yogyakarta tahun 1985, dan SMA Muhammadiyah I Yogyakarta tahun Pendidikan tinggi ditempuh di Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan (IKIP) Yogyakarta Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FPMIPA) jurusan Biologi dan lulus pada tahun Saat ini penulis bekerja sebagai Pegawai Negeri Sipil Kota Yogyakarta sebagai guru Biologi pada Madrasah Aliyah Negeri I Yogyakarta dan melanjutkan pendidikan pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Program Studi Biologi dengan mendapatkan Beasiswa Utusan Daerah dari Departemen Agama RI.

10 PRAKATA Alhamdulillah, Segala Puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan berkah dan rahmat-nya sehingga dengan perkenan-nya jualah Tesis ini dapat diselesaikan. Penulis menyadari bahwa akanlah sulit untuk dapat menyelesaikan penelitian sampai tesis ini tanpa bantuan moril dan semangat dari banyak pihak, sehingga pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesarbesarnya pada : 1. Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si., Ketua Pembimbing yang selalu memberi bimbingan dalam penelitian dan semangat untuk berkarya dengan sebaikbaiknya serta dalam menyediakan bahan penelitian. 2. Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si., Pembimbing anggota yang memberikan bimbingan dalam penelitian dan penulisan tesis. 3. Dr. Dinamella Wahyuningrum, sebagai dosen penguji luar komisi atas saran dan masukan yang diberikan. 4. Dra. Alina Ahdiya, M.Si yang telah memberikan pengarahan dalam menganalisis zat antimikrob dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel. 5. Departemen Agama RI, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti program peningkatan kemampuan Strata-2 di Institut Pertanian Bogor melalui Beasiswa Utusan Daerah. 6. Drs. Muzilanto, M.Ag., Kepala Madrasah Aliyah Negeri Yogyakarta I, atas ijin dan dukungan dalam melanjutkan studi S2 di IPB. 7. Ir. Achadi Budi Cahyono, M.Kes. dan keluarga atas dukungan, semangat, dan kasih sayang yang diberikan. 8. Hanum, Ratna, Haryanto, Ahmad, Rika, Ibu It, Ria, dan Irul yang banyak memberi bantuan dan perkawanan yang baik dan berkesan. 9. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat. Bogor, Mei 2008 Ariswati Baruno

11 DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN DAFTAR ISI Halaman xiii xiv xv PENDAHULUAN Latar Belakang 1 Tujuan Penelitian 2 Waktu dan Tempat 2 TINJAUAN PUSTAKA Probiotik 3 Bakteriosin 3 Biosintesis Bakteriosin 7 Mekanisme Antibakteri Bakteriosin 8 Vibrio harveyi 11 Staphylococcus aureus 12 Escherichia coli 12 METODE PENELITIAN Bahan 13 Aktivitas Penghambatan isolat Bacillus sp. galur LTC8 13 Penentuan Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob 13 Karakterisasi Zat Antimikrob 14 Pengendapan dengan Aseton dan Etanol 14 Pengukuran Konsentrasi Protein 15 Pengaruh ph terhadap Stabilitas Aktivitas Antimikrob 15 Pengaruh panas terhadap Stabilitas Aktivitas Antimikrob 15 Kromatografi Filtrasi Gel 16 Penentuan Berat Molekul Zat Antimikrob dengan Analisis Elektroforesis 16 HASIL Aktivitas Penghambatan isolat Bacillus LTC8 Penghasil Zat Antimikrob 17 Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob pada Media SWC dan TSB 17 Karakterisasi Zat Antimikrob 19 Stabilitas terhadap ph 20 Stabilitas terhadap Panas 21 Penentuan Berat Molekul Polipeptida Antimikrob dengan Kromatografi dan SDS-PAGE 22

12 PEMBAHASAN Aktivitas Penghambatan isolat Bacillus sp. galur LTC8 Penghasil Zat Antimikrob 24 Waktu Optimum Produksi Zat Antimikrob pada Media SWC dan TSB 24 Karakterisasi Zat Antimikrob 26 Stabilitas terhadap ph 26 Stabilitas terhadap Panas 27 Penentuan Berat Molekul Polipeptida Antimikrob dengan Kromatografi dan SDS-PAGE 28 SIMPULAN DAN SARAN 29 DAFTAR PUSTAKA 30 LAMPIRAN 35

13 DAFTAR TABEL Halaman 1 Jenis bakteriosin genus Enterobacillus 5 2 Jenis bakteriosin genus Streptococcus 6 3 Pengelompokan bakteriosin 6 4 Indeks penghambatan dan persentase peningkatannya setelah pengendapan menggunakan aseton dan etanol 20

14 DAFTAR GAMBAR 1 Permeabilisasi membran oleh bakteriosin kelas IIa 8 2 Aktivitas penghambatan Bacillus LTC8 terhadap (a) V. harveyi, (b) S. aureus, dan (3) E. coli setelah 24 jam inkubasi menggunakan metode double layer 17 3 Kurva turbiditas pertumbuhan Bacillus sp. galur LTC8 pada media SWC dan TSB 18 4 Produksi zat antimikrob Bacillus sp. galur LTC8 terhadap V. harveyi, S. aureus, dan E. coli pada media (a) SWC dan (b) TSB 18 5 Aktivitas penghambatan zat antimikrob Bacillus sp. galur LTC8 pada (a) V. harveyi, (b) S. aureus, dan (c) E. coli setelah 36 jam inkubasi menggunakan disk diffusion method 18 6 Hasil pengujian kadar protein sebelum pengendapan di media (1) SWC dan (2) TSB, setelah pengendapan dengan aseton di media (3) SWC dan (4) TSB, dan setelah pengendapan dengan etanol di media (5) SWC dan (6) TSB 19 7 Aktivitas antimikrob sebelum dan setelah pengendapan pada media (a) SWC dan (b) TSB terhadap V. harveyi, S. aureus, dan E. coli 20 8 Aktivitas antimikrob terhadap ph setelah pengendapan dengan etanol pada media (a) TSB dan (b) SWC, dan dengan aseton pada media (c) TSB dan (d) SWC terhadap V. harveyi, S. aureus, dan E. coli 21 9 Aktivitas antimikrob setelah perlakuan panas dari zat antimikrob setelah pengendapan dengan etanol pada media (a) TSB dan (b) SWC, dan dengan aseton pada media (c) TSB dan (d) SWC terhadap V. harveyi, S. aureus, dan E. coli Kromatogram E2-TSB-etanol menggunakan kolom Hi Prep 16/60 Sephacryl S-200 High Resolution (HR), dengan sistem AKTApurifier Swedia Hasil SDS-PAGE untuk E2-TSB-Etanol (S1), E2-SWC-Etanol, E2-SWC-Aseton, dan E2-TSB-Aseton dan pita protein E2-TSB-Etanol dengan berat molekulnya dalam kda 23 Halaman

15 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi TSB 36 2 Komposisi SWC 50% dan 100% 36 3 Standar protein marker LMW untuk kromatografi 36 4 Standar protein marker LMW untuk SDS - PAGE 36 5 Komposisi gel akrilamid 10% (resolusi pemisahan kda) 37 6 Hasil uji statistik (dengan program SPSS) aktivitas penghambatan setelah 24 jam inkubasi menggunakan metode double layer 37 7 Kurva standar Bradford untuk menghitung kadar protein sampel 37 8 Kadar protein dan persentase kenaikan dan penurunannya setelah diendapkan dengan etanol dan aseton 38 9 Indeks penghambatan hasil perlakuan ph Indeks penghambatan hasil perlakuan panas Perhitungan berat molekul fraksi 66 dan Kurva standar marker LMW untuk menentukan berat molekul sampel dengan metode elektroforesis (SDS-PAGE) 40