BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Percobaan Prosedur Penelitian Isolasi dan Seleksi Bakteri Proteolitik Isolasi Bakteri Proteolitik

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Percobaan Kegiatan isolasi dan seleksi bakteri proteolitik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Nutrisi, Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar (BRPBAT) Bogor, kegiatan ekstraksi enzim protease dilakukan di Laboratorium Institute de Recherche pour le Developpement (IRD-Perancis) di Balai Riset Budidaya Ikan Hias Depok, kegiatan pengujian aktivitas enzim protease dilakukan di Laboratorium Nutrisi Fakultas Peternakan IPB, pengujian hidrolisis pakan secara in vitro dan analisis proksimat bahan baku dan pakan percobaan dilakukan di Laboratorium Kimia Nutrisi, BRPBAT Bogor, dan percobaan in vivo dilakukan di Laboratorium Basah Nutrisi, BRPBAT Bogor. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari-September Prosedur Penelitian Isolasi dan Seleksi Bakteri Proteolitik Isolasi Bakteri Proteolitik Prosedur isolasi bakteri yang mempunyai aktivitas proteolitik dilakukan dengan metode selektif, yang mengacu pada metode yang dilakukan pada hewan terrestrial seperti petunjuk Hungate (1966), serta mengkombinasikannya dengan prosedur isolasi bakteri dari saluran pencernaan ikan seperti yang dilakukan oleh Nakayama et al. (1994); Hoshino et al. (1997); Jankauskiene (2002) dan Tae (2003). Sumber inokulum berasal dari saluran pencernaan ikan lele dan air kolam pemeliharaan ikan lele sebagai pembanding. Dasar pemikirannya adalah bahwa lele memiliki kelebihan dalam hal efisiensi pakan, dengan nilai konversi mendekati 1. Diduga kelebihannya ini disebabkan karena lele berasosiasi dengan bakteri yang mampu mensekresikan enzim-enzim pencernaan, terutama protease, pada saluran pencernaannya. Isolasi bakteri juga dilakukan terhadap sampel air kolam pemeliharaan lele, dengan anggapan bahwa komposisi bakteri di saluran pencernaan suatu organisme, dimungkinkan tidak akan berbeda jauh dengan komposisi bakteri di air media hidupnya. Pengambilan isi saluran pencernaan ikan lele sebagai sumber inokulum dilakukan dengan cara mengeluarkan saluran pencernaan (lambung dan usus) dari xl

2 ikan lele dewasa yang telah dimatikan. Lambung dan usus digerus, kemudian sebanyak 1 gram ditambah dengan 1 ml cairan fisiologis (NaCl 0.85%) steril (Aslamyah 2006) dan dihomogenkan dengan vortex. Sumber inokulum diambil sebanyak 1 ml dan diencerkan dalam tabung pengenceran serial yang berisi 9 ml larutan fisiologis, sebanyak 10 tabung pengencer (hingga pengenceran kali). Setelah dihomogenkan, maka dari setiap tabung pengencer diambil larutan sebanyak 0.1 ml, dan disebarkan dalam cawan petri berisi TSA yang dibuat secara duplo. Kultur ini kemudian diinkubasi pada suhu 29 o C selama jam sampai koloni bakteri dapat tumbuh, dalam suasana aerob. Koloni bakteri yang tumbuh diidentifikasi berdasarkan perbedaan warna, bentuk dan ukurannya. Setiap jenis koloni yang didapat dimurnikan dengan metode penggoresan kuadran, sampai didapatkan koloni bakteri yang tunggal dan seragam. Kultur murni selanjutnya diperbanyak atau diperkaya untuk mendapatkan isolat. Sebagian isolat bakteri digunakan sebagai kultur stok dan sebagian lagi dipakai sebagai inokulum pada percobaan berikutnya. Pengayaan dilakukan dengan cara menumbuhkan masing-masing isolat ke dalam media TSB kemudian diinkubasi pada suhu 29 o C selama 24 jam. Kultur yang didapat siap untuk diawetkan. Pengawetan dilakukan dengan menyimpan isolat-isolat yang telah diperoleh ke dalam media gliserol 15-20% yang selanjutnya disebut kultur stok. Seleksi Bakteri Proteolitik Untuk mendapatkan bakteri yang berpotensi tinggi sebagai penghasil enzim protease, maka seleksi bakteri dilakukan melalui tahapan pengujian aktivitas proteolitik dan pengujian patogenisitas. Pengujian aktivitas proteolitik bertujuan untuk mengukur besarnya aktivitas proteolitik masing-masing isolat dengan uji hidrolisis kasein (Lampiran 1). Aktivitas proteolitik ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling isolat yang ditumbuhkan pada media agar yang mengandung kasein 2%. Pengujian patogenisitas bertujuan untuk mengetahui apakah isolat bakteri yang diperoleh merupakan bakteri patogen terhadap ikan uji atau tidak. Masing-masing isolat disuntikkan pada kelompok ikan nila sehat (terdiri dari 5 ekor pada setiap akuarium) secara intramuscular sebanyak 0.2 m1 xli

3 dengan kandungan bakteri sebanyak 10 7 cfu/ml. Sebagai kontrol digunakan larutan fisiologis yang juga disuntikkan pada satu kelompok ikan nila. Pemantauan dilakukan setiap hari selama dua minggu setelahnya, apakah didapatkan perbedaan mortalitas apabila dibandingkan dengan kontrol, atau adanya tanda klinis penyakit pada ikan uji. Setelah melakukan kedua tahap seleksi bakteri proteolitik, selanjutnya ditentukan isolat bakteri terpilih yang akan menjalani pengujian selanjutnya. Seleksi ditentukan berdasarkan peringkat luasnya zona hidrolisis kasein, dan yang terbukti tidak bersifat patogen terhadap ikan nila. Optimasi Potensi Bakteri Terpilih sebagai Sumber Enzim Protease Pemantauan Produksi Enzim Protease Bakteri Percobaan ini dilakukan dengan mengukur produksi enzim protease yang disekresikan oleh bakteri proteolitik terpilih dari waktu ke waktu, yang diukur dari aktivitasnya (Lampiran 2). Tujuannya untuk mendapatkan titik waktu yang optimal untuk pemanenan enzim protease. Pengamatan dilakukan dilakukan setiap 4 jam sekali selama 4 hari (25 titik pemantauan) dari waktu kulturnya. Pemantauan produksi enzim protease ini disertai dengan pengamatan optical density (OD) atau kerapatan optis dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm (Hadioetomo 1990). Nilai prosentase transmitan dikonversi menjadi nilai kerapatan optik mengikuti tabel menurut Hadieutomo (1993). Mula-mula bakteri proteolitik terpilih diperbanyak dalam media TSB di dalam tabung-tabung reaksi berkapasitas 15 ml (masing-masing 25 tabung). Produksi enzim kasar mengacu pada metode yang dilakukan Wang et al. (2008), dengan modifikasi pada suhu dan pengenceran media yang digunakan. Sebanyak 0.1 ml sumber inokulum bakteri proteolitik yang terpilih diinokulasikan dalam setiap 9.9 ml media di dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C. Setelah itu kultur dihentikan dengan cara sentrifus pada titik waktu yang diinginkan (waktu ke-0, 4, 8, 12, 16 jam, dan seterusnya) dengan kecepatan g selama 20 menit pada suhu 4 o C. Supernatan yang diperoleh (filtrat ekstrak enzim kasar) ditambah ammonium sulfat (608 g/l) dan disimpan semalam pada suhu 4 o C. Selanjutnya filtrat disentrifus kembali pada g dan suhu 4 o C selama 20 menit, dan endapan yang terbentuk dilarutkan dalam buffer fosfat 50 xlii

4 mm ph 7, dan diuji aktivitas enzim proteasenya di laboratorium dengan metode Bergmeyer dan Graß1 (1986). Penentuan Dosis Enzim Protease Bakteri Percobaan ini bertujuan menguji secara in vitro dosis enzim protease yang optimal untuk mengkatalisis reaksi hidrolisis protein. Perlakuan yang diujikan adalah ekstrak enzim protease yang berasal dari kultur bakteri A1 dan L1 sebanyak 0, 200, 400, 600, 800 dan 1000 ml /kg pakan, dengan 2 ulangan. Stok kultur disiapkan dengan cara menumbuhkan 40 ml sumber inokulum cair bakteri dalam 3960 ml TSB baru dan diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37 o C. Homogenisasi dengan vortex dilakukan sesering mungkin selama inkubasi ini. Perlakuan dosis 1000 ml misalnya, disiapkan dengan cara mengambil stok kultur yang telah siap sebanyak 1000 ml. Kultur cair ini selanjutnya disentrifus dengan kecepatan g pada suhu 4 o C selama 20 menit. Supernatan diambil dan ditambah dengan ammonium sulfat (608 g/l), disimpan semalam pada suhu 4 o C, dan disentrifus kembali pada kecepatan , suhu 4 o C selama 20 menit. Endapan yang terbentuk diambil dan dilarutkan kembali dalam 50 ml buffer fosfat 50 mm ph 7. Sediaan ini dapat disimpan lama dalam freezer, dan dapat digunakan kembali apabila diperlukan. Perlakuan dosis yang lain disiapkan dengan cara yang sama, dengan menyesuaikan volume stok kultur yang diambil sesuai perlakuannya (0, 200, 400, 600 dan 800 ml stok kultur). Ekstrak enzim kasar yang telah dikeluarkan dari freezer dibiarkan dalam suhu kamar beberapa saat supaya suhunya menyesuaikan. Supaya tercampur rata pada campuran bahan baku pakan, maka sediaan ekstrak enzim kasar diencerkan dengan air hangat hingga volumenya 1000 ml, dihomogenkan, kemudian dicampurkan pada kombinasi bahan baku untuk 1 kg pakan yang telah dihaluskan dan diaduk merata. Bahan baku penyusun pakan formulasi dalam percobaan ini sebelumnya telah dianalisis komposisi proksimatnya dengan metode yang tercantum pada Lampiran 3, dan komposisi bahan dan proksimat pakan tercantum pada Lampiran 4 dan 5. Campuran pakan dan enzim kasar ini kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Parameter yang diamati adalah derajat hidrolisis protein (Lampiran 6). Uji Pertumbuhan dan Kecernaan pada Ikan Nila Uji Pertumbuhan xliii

5 Pakan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pakan buatan (formulasi) dan pakan komersial sebagai kontrol. Komposisi bahan pakan formulasi dan komposisi proksimat pakan percobaan tersaji di Lampiran 4 dan 5. Enzim yang diberikan pada pakan percobaan adalah enzim dari bakteri A1 dan L1, dengan dosis 1000 ml / kg pakan. Cairan enzim dituangkan ke dalam campuran bahan baku pakan formulasi atau pakan komersial yang sudah dihaluskan, sesuai dengan perlakuan yang ditentukan, dan diaduk merata. Selanjutnya inkubasi dilakukan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Rancangan dalam percobaan ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan perlakuan sebagai berikut : A. Pakan formulasi kontrol (kadar protein 28%) B. Pakan formulasi yang ditambah enzim dari bakteri A1 C. Pakan formulasi yang ditambah enzim dari bakteri L1 D. Pakan komersial kontrol berkadar protein 31% E. Pakan komersial yang ditambah enzim dari bakteri A1 F. Pakan komersial yang ditambah enzim dari bakteri L1 G. Pakan komersial berkadar protein 28% Ikan nila dengan berat rata-rata 4.07 ± 0.25 gram ditebar dengan kepadatan 10 ekor per akuarium. Wadah yang digunakan adalah akuarium berukuran 60 x 60 x 50 cm sebanyak 21 buah, yang masing-masing diisi air bervolume 90 liter dan dilengkapi sistem resirkulasi. Pengaturan dan penempatan wadah perlakuan dilakukan secara acak dengan menggunakan bilangan acak (Steel & Torrie 1995). Pemberian pakan dilakukan 3 kali sehari sebanyak 5% dari bobot biomassa ikan nila per akuarium per hari. Penyesuaian bobot biomassa ikan uji dilakukan dengan sampling setiap 15 hari sekali. Jumlah pakan yang diberikan dicatat untuk mendapatkan data konsumsi pakan, efisiensi pakan dan retensi protein. Percobaan pertumbuhan ini dilakukan selama 60 hari. Penggantian air di tandon filter dilakukan setiap 3 hari sekali, dan penyiponan kotoran dilakukan setiap hari. Pengukuran kualitas air dilakukan pada awal, tengah dan akhir masa pemeliharaan meliputi suhu, ph, oksigen terlarut dan amoniak. xliv

6 Parameter kinerja pertumbuhan yang diamati adalah: Laju Pertumbuhan Spesifik (LPS) Laju pertumbuhan spesifik ikan uji dihitung mengikuti rumus yang digunakan oleh Mundheim et al. (2004) yaitu: LPS = (ln Wt ln Wo) x 100 T Keterangan: LPS = laju pertumbuhan spesifik (%) Wt = rata-rata bobot individu pada akhir penelitian (g) Wo = rata-rata bobot individu pada awal penelitian (g) T = lama waktu pemeliharaan (hari) Jumlah Konsumsi Pakan Jumlah pakan yang dikonsumsi ikan uji dihitung dengan cara menimbang pakan yang diberikan setiap hari, dan juga pakan yang tersisa setiap hari sebagai pengurangnya. Jumlah keseluruhan pakan yang dikonsumsi pada setiap unit percobaan selama 60 hari dicatat sebagai data jumlah konsumsi pakan. Retensi Protein Nilai retensi protein dihitung berdasarkan persamaan Takeuchi (1988) sebagai berikut : RP (%) = [(F-I)/P] x 100% Keterangan : RP = retensi protein (%) F = jumlah protein tubuh ikan pada akhir penelitian (g) I = jumlah protein tubuh ikan pada awal penelitian (g) P = jumlah protein yang dikonsumsi ikan (g) Efisiensi Pakan Perhitungan efisiensi pakan didasarkan pada NRC (1977), yaitu besarnya rasio perbandingan antara pertambahan bobot ikan yang didapatkan dengan jumlah pakan yang dikonsumsi ikan. Semakin besar nilai pertambahan bobot maka efisiensi pakan semakin besar. EP (%) = (Wt + D) Wo x 100 JKP Keterangan : EP = efisiensi pakan (%) W t = biomassa ikan pada akhir pemeliharaan (g) W o = biomassa ikan pada awal pemeliharaan (g) D = bobot ikan yang mati selama penelitian (g) xlv

7 JKP = Jumlah pakan yang diberikan selama penelitian (g) Tingkat Kelangsungan Hidup Tingkat kelangsungan hidup dihitung berdasarkan persamaan yang dikemukakan oleh Huisman (1987) yaitu: SR (%) = N t x 100% N o Keterangan; Nt = jumlah ikan pada akhir penelitian (ekor) No = jumlah ikan pada awal penelitian (ekor) Uji Kecernaan Protein dan Total Pakan Pengujian daya cerna pakan oleh ikan nila dilakukan secara terpisah dari uji pertumbuhan. Hal ini dimaksudkan agar kegiatan pengumpulan feses tidak mengganggu pertumbuhan ikan uji. Akuarium yang digunakan untuk uji kecernaan berukuran lebih besar, yaitu 100 x 60 x 50 cm. Pembuatan pakan percobaan untuk uji kecernaan dilakukan sama seperti pakan untuk uji pertumbuhan, namun ditambahkan 0.6% Cr 2 O 3 sebagai indikator kecernaan. Pakan diberikan pada ikan selama 3 minggu dan pengumpulan feses mulai dilakukan pada hari ketujuh dengan cara menyedot feses di dasar akuarium dengan selang kecil dan ditampung di ember. Selanjutnya feses yang mengendap di dasar ember disaring dan dikumpulkan dalam botol film. Feses yang terkumpul dikeringkan dalam oven bersuhu 110 selama 4-6 jam, dan dianalisis kandungan Cr 2 O 3 (Lampiran 7) dan kadar proteinnya. Penghitungan nilai kecernaan berdasarkan Takeuchi (1988): KT = 100 x (1 b/b ) KP = 100 x [1 (a /a x b/b )] Keterangan : KT = kecernaan total (%) KP = kecernaan protein (%) a = kadar nutrien (protein) dalam pakan (bobot kering) a = kadar nutrien (protein) dalam feses (bobot kering) b = kadar indikator Cr 2 O 3 dalam pakan (% bobot kering) b = kadar indikator Cr 2 O 3 dalam feses (% bobot kering) Analisis Data xlvi