BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu

Transkripsi

1 15 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di laboratorium dan rumah kaca Hama dan Penyakit dan rumah kaca Balai penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO), Bogor; pada bulan Oktober 2008 Januari Kelimpahan bakteri endofit Eksplorasi bakteri endofit dilakukan di daerah sentra produksi tanaman obat. Beberapa contoh tanaman obat (jahe, kencur, kunyit) yang tidak menunjukkan gejala penyakit (tanaman sehat). Bagian tanaman yang diambil adalah rimpang, akar atau batang. Selanjutnya contoh tanaman diisolasi di laboratorium bakteri BALITTRO. Isolasi bakteri endofit dilakukan dengan cara mensterlisasi permukaan akar/batang menggunakan larutan NaOCL 10 dan air steril. Air cucian yang terakhir ditumbuhkan pada media 1/10 Tryptic Soy Agar (TSA), kemudian diinkubasikan pada suhu 37 o C. Bila pada medium tidak ada mikroorganisme yang tumbuh menandakan sterilisasi permukaan sudah berhasil. Contoh tanaman yang telah disterilisasi permukaannya digerus dengan mortar steril sampai halus dan diencerkan dengan air steril. 0,1 ml suspensi ekstrak tanaman ditumbuhkan pada medium 1/10 TSA dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 48 jam. Setelah 48 jam koloni bakteri yang tumbuh dimurnikan dan diperbanyak pada medium TSA. Isolat bakteri endofit dikoleksi dan disimpan dalam botol berisi air steril untuk diuji potensinya. Isolasi bakteri patogen Bakteri patogen diisolasi dari tanaman jahe terinfeksi bakteri R. solanacearum di lapang. Contoh tanaman dicuci dengan air mengalir sampai bersih kemudian permukaannya disterilisasi dengan alkohol 70 %. Selanjutnya

2 16 dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi air steril. Setelah 5 menit, suspensi bakteri yang terbentuk digoreskan pada medium selektif Tryphenyl Tetrazolium Chloride (TTZA) dengan menggunakan jarum ose. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 48 jam. Koloni bakteri virulen yang tumbuh dimurnikan dan diperbanyak pada medium Sucrose Peptone Agar (SPA). Isolat bakteri murni disimpan dalam botol berisi air steril dan siap untuk digunakan. Seleksi sifat antibiosis secara in vitro Isolat bakteri endofit yang diperoleh dari hasil isolasi diseleksi untuk mendapatkan isolat potensial. Isolat diseleksi berdasarkan kemampuannya memproduksi bakteriosin. Isolat ditumbuhkan pada medium SPA dalam cawan petri dengan metode titik dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 48 jam. Setelah biakan tumbuh dimatikan dengan uap chloroform selama 30 menit kemudian dituangi dengan suspensi R. solanacearum dengan kerapatan populasi 10 8 cfu/ml (OD 600 = 0,1) dan diinkubasikan lagi selama 24 jam. Pengamatan dilakukan terhadap zona bening (hambatan) yang terbentuk disekitar koloni bakteri endofit dan diukur diameternya. Diamater zona hambatan dikelompokkan menjadi tiga kategori, yaitu lemah (< 8mm), sedang (8-16 mm), dan kuat (> 16 mm). Isolat bakteri endofit yang mampu memproduksi bakteriosin atau bersifat antibiosis dikoleksi untuk diuji potensinya dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman pada benih dan tanaman mentimun di rumah kaca. Uji potensi dalam memacu pertumbuhan tanaman Biakan bakteri endofit berumur 48 jam disuspensikan dengan akuades steril hingga diperoleh kerapatan 10 8 cfu/ml. Benih mentimun yang telah disterilkan permukaanya dengan larutan natrium hipoklorit 1 % kemudian dibilas dengan akuades selanjutnya ditumbuhkan dalam nampan perkecambahan yang berisi campuran, pasir, dan pupuk kandang steril dengan perbandingan 2 : 1 : 1 didalam rumah kaca pada suhu kamar. Masing-masing suspensi bakteri endofit diteteskan sebanyak 1 ml pada benih mentimun, sedangkan untuk kontrol

3 17 diteteskan akuades steril dengan volume yang sama. Perlakuan diulang sebanyak 10 kali. Pengamatan dilakukan satu minggu setelah perlakuan terhadap panjang akar dan jumlah akar serabut bibit mentimun. Peningkatan pertumbuhan tanaman dihitung berdasarkan persentase panjang akar dan jumlah akar serabut bibit mentimun yang diberi perlakuan bakteri endofit dibandingkan dengan kontrol. Isolat bakteri endofit antibiosis yang berpotensi meningkatkan pertumbuhan tanaman dikarakterisasi dan diidentifikasi untuk digunakan dalam pengujian induksi ketahanan di rumah kaca. Karakterisasi bakteri endofit Isolat bakteri endofit bersifat antibiosis yang berpotensi meningkatkan pertumbuhan tanaman dikarakterisasi berdasarkan sifat morfologi koloni dan fisiologinya sebagaimana diuraikan dalam Supriadi (1994), Kerr (1980) dan Schaad et al. (2001). Beberapa tahapan yang dilakukan, antara lain : Karakter koloni. Bakteri endofit ditumbuhkan pada medium SPA dan King s B Agar (KBA) dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 48 jam. Karakter koloni bakteri yang tumbuh diamati. Menurut Kerr (1980), pembentukan pigmen fluorescens ditandai oleh adanya warna kuning kehijauan yang berpendar di bawah cahaya ultra violet). Reaksi Gram. Pada permukaan kaca objek diletakkan 1-2 tetes KOH 3%. Koloni bakteri dicampur dengan KOH menggunakan jarum ose selama 10 detik. Koloni yang membentuk lendir dan bila ditarik seperti benang menandakan bereaksi positif atau termasuk gram negatif, sebaliknya bila tidak berlendir bereaksi negatif atau gram positif (Schaad et al. 2001).

4 18 Reaksi oksidatif/fermentatif. Isolat bakteri ditusukkan ke dalam dua tabung reaksi yang berisi medium oksidatif-fermentatif, satu tabung ditutup dengan parafin cair steril dan satu lagi dibiarkan terbuka kemudian diinkubasikan selama 7 hari. Medium yang berwarna kuning pada tabung terbuka dan tertutup menandakan reaksi fermentatif, sedangkan reaksi oksidatif ditandai terbentuknya warna kuning pada medium hanya pada tabung yang terbuka (Kerr, 1980). Hidrolisis arginin. Isolat bakteri ditusukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi medium arginin dan diinkubasikan selama 7 hari. Terjadinya hidrolisis arginin ditandai dengan perubahan warna merah pada media (Kerr, 1980). Reaksi hipersensitif. Isolat bakteri ditumbuhkan pada medium TSA dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 48 jam, selanjutnya disuspensikan dalam air steril hingga diperoleh kerapatan populasi 10 8 (OD 600 = 0,1). Suspensi bakteri diinjeksikan pada tulang sekunder daun tembakau. Isolat yang bersifat patogen terlihat dari gejala putih transparan, kematian jaringan daun (collapse) dalam waktu jam setelah injeksi (Lelliot dan Stead, 1987). Uji potensi di rumah kaca Efektifitas isolat bakteri endofit yang bersifat antibiosis kuat dan berpotensi meningkatkan pertumbuhan tanaman diuji di rumah kaca. Bibit jahe yang digunakan adalah jahe putih besar. Aplikasi bakteri endofit dengan cara penyiraman 50 ml suspensi bakteri endofit 10 8 cfu/ml kedalam polibag yang telah ditanami bibit jahe umur 2 bulan, sebagai kontrol dilakukan penyiraman dengan menggunakan air steril. Satu minggu setelah aplikasi bakteri endofit tanaman

5 19 diinokulasi R. solanacearum isolat T-954 dengan cara menyiramkan 25 ml ml/tanaman inokulum dengan kerapatan populasi 10 8 cfu/ml (OD 600 = 0,1). Rancangan percobaan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan jumlah perlakuan tiga isolat bakteri endofit yang paling berpotensi dari uji in-vitro diulang tiga kali. Masing-masing unit perlakuan terdiri dari 10 bibit. Peubah yang diamati Kejadian penyakit Kejadian penyakit dihitung dengan menggunakan rumus : P = a / b x 100 % Keterangan : P = Kejadian penyakit layu a = Jumlah tanaman yang menunjukan gejala layu b = Jumlah tanaman yang diamati Keparahan penyakit Indeks penyakit dihitung menggunakan rumus seperti digunakan oleh Winstead dan Kelman (1954), Arwiyanto et al. (1994) yang dimodifikasi. Keparahan penyakit dihitung berdasarkan skala : 0 = tidak ada gejala daun menguning 1 = 10 % daun menguning 2 = % daun menguning 3 = semua daun menguning kecuali daun pucuk 4 = semua daun menguning 5 = tanaman mati.

6 20 Rumus keparahan penyakit (KP) adalah : (n1 x 1) + (n2 x 2) + (n3 x 3) + n4 x 4) + (n5 x 5) K P = x 100 % N x 5 n1 5 = jumlah tanaman dengan skala penyakit tertentu 0, 1,, 5 = skala penyakit N = Jumlah tanaman pada tiap perlakuan Penekanan penyakit Indeks penekanan penyakit dihitung dengan rumus : DIc DIb Indeks penekanan penyakit = x 100 % DIc DIc = Indeks penyakit pada kontrol DIb = indeks penyakit pada perlakuan agens biokontrol Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis secara statistika dengan dengan menggunakan Anova dan dilanjutkan dengan uji Tukey Test pada taraf 5 %.