APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK ANALISIS PARASETAMOL, GUAIFENESIN DAN KLORFENIRAMIN MALEAT DALAM SIRUP SKRIPSI

Transkripsi

1 APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK ANALISIS PARASETAMOL, GUAIFENESIN DAN KLORFENIRAMIN MALEAT DALAM SIRUP SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Erfan Sriman Famarani Gulo NIM : FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

2 APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI UV DAN KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK ANALISIS PARASETAMOL, GUAIFENESIN DAN KLORFENIRAMIN MALEAT DALAM SIRUP SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Erfan Sriman Famarani Gulo NIM : FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016 i

3 Test ii

4 iii

5 iv

6 v

7 HALAMAN PERSEMBAHAN If you can run away and return, if you can fall asleep and wake up, if you're broken, you should be able to put yourself back together Noragami. No matter what anyone says...what you're about to do...is right! Yato You may face many disappointments. But don t lose hope - Lailah Gifty Akita, Pearls of Wisdom : Great Mind. Karya kecil yang kupersembahkan kepada : Tuhan Yang Maha Pengasih dan Penyayang Ayah dan Bunda yang tercinta, Fangato Gulö dan Afasari Dachi Saudara-Saudariku yang kusayangi, Kakak Erni, Fandi dan Sri Almamater Fakultas Farmasi Sanata Dharma vi

8 PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas berkat dan rahmat-nya sehingga skripsi ini yang berjudul Aplikasi Spektrofotometri UV dan Kalibrasi Multivariat Untuk Senyawa Parasetamol, Guaifenesin dan Klorfeniramin Maleat dapat penulis selesaikan dengan baik. Skripsi ini diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam proses penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini, banyak pihakpihak yang telah meluangkan waktu dan memberikan kontribusi yang besar, baik dalam materi, dukungan, kritik dan saran kepada penulis. Untuk itu, dalam kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada : 1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Bapak Prof. Dr. Abdul Rohman, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing yang dengan penuh kesabaran memberikan bimbingan dan pengarahan, ilmu, dukungan serta waktu dan tenaga dalam memecahkan setiap masalah selama proses penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini. 3. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing pendamping yang dengan penuh kesabaran memberikan dukungan, semangat, solusi, kritik dan saran selama proses penelitian dan penyusunan naskah ini. vii

9 4. Dosen penguji yang akan memberikan pengarahan, kritik dan saran kepada penulis dalam menyelasikan naskah skripsi ini. 5. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah membantu penulis selama proses perkuliahan. 6. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, yang telah memberikan izin untuk menggunakan fasilitas laboratorium untuk melaksanakan penelitian. 7. Balai besar POM di Yogyakarta yang telah memberikan informasi dan bantuan mencari sumber bahan baku kerja dalam proses penelitian ini. 8. P.T. Combiphar Indonesia, yang telah memberikan baku parasetamol yang sangat bermanfaat selama proses penelitian ini. 9. P.T. Konimex yang telah memberikan baku guaifenesin dan klorfeniramin maleat yang sangat bermanfaat selama proses penelitian ini. 10. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah mendidik dan membantu penulis selama proses perkuliahan. 11. Mas Bimo, Mas Kethul, dan Mas Ottok selaku Laboran, Karyawan Laboratorium Kimia Analisis Instrumental, dan Pengelola Gudang Laboratorium yang membantu penulis selama proses penelitian. 12. Ayah, Bunda, saudara-saudariku tercinta yang selalu mendoakan, memberikan dukungan, kesabaran, semangat, harapan kepada penulis selama proses penyusunan naskah skripsi ini. viii

10 13. Keponakanku yang kusayangi, Eca, Faiz dan Jeslyn atas doanya, yang selalu menghibur dan mendukung penulis dalam menyelesaikan naskah skripsi ini. 14. Ade, Arif dan Jalaq sebagai sahabat dan rekan kerja yang telah memberikan dukungan, kritik dan saran, meluangkan waktu dalam membantu penulis selama proses penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini. 15. Devina dan Sophia selaku rekan kerja yang telah berjuang bersama, memberikan dukungan, kritik dan saran dalam proses penelitian skripsi ini. 16. Mbak Yola, Teguh, Yonas dan Tomi sebagai sahabat yang telah memberikan solusi dan bantuan kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. 17. Teman-teman FST B 2011 dan seluruh teman-teman angkatan 2011 atas kekompakkan dan kebersamaan yang luar biasa. 18. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, yang turut membantu dalam penyelesaian naskah skripsi ini. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata kesempurnaan. Oleh karena itu, kritik dan saran sangat penulis harapkan. Penulis berharap, semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi pembaca dan dapat menjadi acuan dalam pengembangan ilmu kefarmasian. Yogyakarta, Mei 2016 Penulis ix

11 DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL... i HALAMAN PERSETUJUAN... ii HALAMAN PENGESAHAN... iii PERNYATAAN KEASLIAN PENULIS... iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA... v HALAMAN PERSEMBAHAN... vi PRAKATA... vii DAFTAR ISI... x DAFTAR TABEL... xiii DAFTAR GAMBAR... xv DAFTAR LAMPIRAN... xvii INTISARI... xix ABSTRACT... xx BAB I. PENGANTAR... 1 A. Latar Belakang... 1 B. Rumusan Masalah... 3 C. Keaslian Penelitian... 3 D. Manfaat Penelitian... 4 E. Tujuan Penelitian... 5 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA... 6 A. Sirup... 6 x

12 B. Parasetamol, Guaifenesin, Klorfeniramin maleat Parasetamol Guaifenesin Klorfeniramin maleat... 9 C. Spektrofotometri UV-Vis... 9 D. Analisis Multikomponen Secara Spektrofotometri UV E. Kemometrika F. Validasi Metode Analisis Presisi Akurasi Selektivitas G. Landasan Teori H. Hipotesis BAB III. METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian B. Variabel Penelitian Variabel Bebas Variabel Tergantung Variabel Pengacau C. Defenisi Operasional D. Bahan Penelitian E. Alat Penelitian xi

13 F. Tata Cara Penelitian Scanning spektra standar Pemilihan Interval dan Panjang Gelombang Penyiapan Larutan set Kalibrasi Pembuatan Standar Adisi CTM Analisis Sampel Analisis Statistik Analisis Data Sampel BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Analisis Senyawa Multikomponen B. Validasi Model Kalibrasi Multivariat Partial Least Square (PLS) C. Penetapan Kadar Sediaan Farmasi BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan B. Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN BIOGRAFI xii

14 DAFTAR TABEL Tabel I. Kriteria penerimaan nilai RSD Tabel II. Nilai % recovery Tabel III. Komposisi campuran sintetik parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) untuk model kalibrasi Tabel IV. Nilai sebenarnya dan terhitung hasil kalibrasi PLS dari calibration set yang mengandung parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) tanpa validasi silang (cross validation) pada λ nm Tabel V. Nilai sebenarnya dan terhitung hasil kalibrasi PLS dari calibration set yang mengandung parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) validasi silang (cross validation) pada λ nm Tabel VI. Hasil persamaan, R 2, RMSECV dan PRESS yang diperoleh dari hubungan antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung validasi silang (cross validation) pada λ nm Tabel VII. Hasil penetapan kadar prediksi parasetamol (PCT) dalam sediaan farmasi sirup menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS Tabel VIII. Hasil penetapan kadar prediksi guaifenesin (GG) dalam sediaan farmasi sirup menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS xiii

15 Tabel IX. Hasil penetapan kadar prediksi klorfeniramin maleat (CTM) dalam sediaan farmasi sirup menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS xiv

16 DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur parasetamol... 7 Gambar 2. Struktur guaifenesin... 8 Gambar 3. Struktur klorfeniramin maleat... 9 Gambar 4. Instrumentasi spektrofotometri UV double beam Gambar 5. Overlay spektra UV parasetamol (PCT), guaifenesin (GG), klorfeniramin maleat (CTM) dan spektra UV campuran ketiga senyawa yang diukur pada λ nm Gambar 6. Overlay spektra UV sampel sediaan farmasi (sirup) dan spektra UV campuran baku parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) yang diukur pada λ nm Gambar 7. Overlay spektra UV campuran baku parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) yang diukur pada λ nm Gambar 8. Kurva hubungan nilai sebenarnya dengan nilai terhitung pada model kalibrasi multivariat PLS parasetamol Gambar 9. Kurva hubungan nilai sebenarnya dengan nilai terhitung pada model kalibrasi multivariat PLS guaifenesin Gambar 10. Kurva hubungan nilai sebenarnya dengan nilai terhitung pada model kalibrasi multivariat PLS klorfeniramin maleat Gambar 11. Data dan parameter hasil validasi silang parasetamol (PCT) dengan teknik leave-one-out xv

17 Gambar 12. Data dan parameter hasil validasi silang guaifenesin (GG) dengan teknik leave-one-out Gambar 13. Data dan parameter hasil validasi silang klorfeniramin maleat (CTM) dengan teknik leave-one-out Gambar 14. Kurva hubungan antara nilai parasetamol sebenarnya dan nilai terhitung hasil validasi silang leave one-out Gambar 15. Kurva hubungan antara nilai guaifenesin sebenarnya dan nilai terhitung hasil validasi silang leave one-out Gambar 16. Kurva hubungan antara nilai klorfeniramin maleat sebenarnya dan nilai terhitung hasil validasi silang leave one-out Gambar 17. Overlay spektra 6 sampel sediaan farmasi yang diukur pada panjang gelombang nm dengan interval pengukuran 2 nm xvi

18 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Sertifikat analisis baku parasetamol Lampiran 2. Sertifikat analisis baku guaifenesin Lampiran 3. Sertifikat analisis baku klorfeniramin maleat Lampiran 4. Data Penimbangan Standar Adisi Klorfeniramin maleat Lampiran 5. Data pengukuran spektrofotometer UV 20 campuran sintetik untuk model PLS pada panjang gelombang nm yang diukur dengan interval pengukuran 2 nm Lampiran 6. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) parasetamol dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi internal Lampiran 7. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) guaifenesin dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi internal Lampiran 8. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) klorfeniramin maleat dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi internal Lampiran 9. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) parasetamol dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik validasi internal xvii

19 Lampiran 10. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) guaifenesin dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik validasi internal Lampiran 11. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) klorfeniramin maleat dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik validasi internal Lampiran 12. Data nilai koefisien dari model PLS parasetamol Lampiran 13. Data nilai koefisien dari model PLS guaifenesin Lampiran 14. Data nilai koefisien dari model PLS klorfeniramin maleat Lampiran 15. Data pengukuran spektrofotometri UV enam replikasi sampel pada panjang gelombang nm yang diukur dengan interval pengukuran 2 nm Lampiran 16. Perhitungan kadar parasetamol pada sampel sirup menggunakan hasil koefisien validasi silang Lampiran 17. Perhitungan kadar guaifenesin pada sampel sirup menggunakan hasil koefisien validasi silang Lampiran 18. Perhitungan kadar klorfeniramin maleat pada sampel sirup menggunakan hasil koefisien validasi silang xviii

20 INTISARI Kebutuhan akan obat dengan zat aktif multikomponen semakin meningkat dalam kalangan masyarakat, sehingga membutuhkan peningkatan pengawasan mutu produk obat dalam menjamin keamanan dan khasiat yang dihasilkan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk penjaminan mutu produk obat, seperti metode spektrofotometri. Akan tetapi, metode spektrofotometri tidak dapat digunakan dalam analisis senyawa multikomponen, mengingat keterbatasan metode tersebut dalam mengatasi overlapping spektra senyawa. Oleh karena itu, diperlukan suatu modifikasi metode, yakni dengan mengkombinasikan kemometrika dan spektrofotometri, sehingga masalah overlapping tersebut dapat teratasi. Metode spektrofotometri yang dikombinasikan dengan kemometrika kalibrasi multivariat partial least square (PLS) digunakan dalam analisis sediaan farmasi sampel sirup dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat. Evaluasi metode didasarkan pada nilai koefisien determinasi (R 2 ), root mean square error of calibration (RMSEC), dan root mean square error of calibration validation (RMSECV). Hasil penelitian menunjukkan bahwa analisis sediaan farmasi sampel sirup dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat menggunakan metode kombinasi spektrofotometri dan kemometrika belum berhasil dilakukan. Untuk model kalibrasi, diperoleh nilai R 2 PCT 0,994, GG 0,999 dan CTM 0,999. Nilai RMSEC PCT 0,289, GG 0,099 dan CTM 0,078. Untuk model validasi, diperoleh nilai R 2 PCT 0,999, GG 0,999 dan CTM 0,998. Nilai RMSECV PCT 0,116, GG 0,084 dan CTM 0,219. KATA KUNCI : Spektrofotometri, kemometrika, partial least square. xix

21 ABSTRACT The need of a drug with active ingredient multicomponent increasing in the community, thus requiring an increase in the quality control of medicinal products in ensuring the safety and efficacy of the resulting. Various methods have been developed for quality assurance of drug products, such as spectrophotometric method. However, the spectrophotometric method can not be used in the analysis of multicomponent compound, given the limitations of the method to resolve overlapping spectra of compounds. Therefore, we need a modification of the method, by combining chemometrics and spectrophotometry, so that the overlapping issue can be resolved. Spectrophotometric method combined with chemometrics multivariate calibration partial least square (PLS) was used in the analysis of pharmaceutical syrup samples with the composition of paracetamol, guaifenesin and chlorpheniramine maleate. Evaluation methods are based on the coefficient of determination (R2), root mean square error of calibration (RMSEC), and root mean square error of calibration validation (RMSECV). The results showed that the analysis of pharmaceutical syrup samples with the composition of paracetamol, guaifenesin and chlorpheniramine maleate using a combination of spectrophotometric and chemometrics method was unsuccessful. For the calibration models, the value of R 2 PCT 0,994, GG 0,999 and CTM 0,999. Value RMSEC PCT 0,289, GG 0,099 and CTM 0,078. For the model of validation, the value of R 2 PCT 0,999, GG 0,999 and CTM 0,998. Value RMSECV PCT 0,116, GG 0,084 and CTM 0,219. Keyword : Spectrophotometric, chemometrics, partial least square xx

22 BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Dewasa ini, obat merupakan suatu kebutuhan dalam kehidupan sehari-hari. Obat dalam arti luas adalah zat kimia yang dalam takaran tertentu dan dengan penggunaan yang tepat dapat dimanfaatkan untuk mencegah penyakit, menyembuhkan penyakit atau memelihara kesehatan. Hal tersebut selaras dengan kecenderungan masyarakat untuk mengobati dirinya sendiri (self medication) sebelum mendapat pertolongan tenaga medis, khususnya pada penyakit yang tergolong ringan seperti pilek, batuk, deman, dan sebagainya (Shankar et al., 2002). Seiring dengan berkembangnya dunia industri farmasi yang memproduksi obat-obat influenza dalam berbagai merek dagang, yang mana setiap komposisi dalam proses produksi produk sediaan farmasi yang kurang lebih sama. Peningkatan produksi sediaan farmasi ini perlu diimbangi dengan peningkatan dalam hal pengawasan mutu, sehingga setiap produk yang beredar tersebut dapat dipertanggungjawabkan keamanan dan khasiatnya. Adapun hal yang berkaitan langsung dengan kedua hal tersebut adalah kandungan bahan aktif dalam sediaan obat. Kombinasi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat sering digunakan sebagai zat aktif untuk meringankan gejala batuk dan pilek, penyakit yang hampir seluruh orang pernah mengalaminya (Hardman et al., 1996). 1

23 2 Dalam dunia industri farmasi, proses penjaminan mutu yang cepat dan handal mutlak diperlukan. Oleh karena itu, kebutuhan suatu metode analisis yang cepat dan memenuhi persyaratan kesahihan suatu metode yang dapat menunjang hal tersebut sangat tinggi. Spektrofotometer UV merupakan salah satu metode yang sederhana, cepat dan lazim digunakan dalam laboratorium industri farmasi untuk analisis suatu sediaan obat. Hanya saja, spektrofotometri UV biasanya digunakan dalam analisis sediaan obat dengan zat aktif tunggal. Penggunaan instrumen spektrofotometer UV dalam analisis sediaan obat multikomponen sangat sulit dilakukan, mengingat permasalahan spektra yang tumpang-tindih antar komponen. Untuk mengatasi permasalahan tersebut, diperlukan pengolahan data secara statistik yakni menggunakan metode kalibrasi multivariat kemometrika. Kombinasi metode spektrofotometri UV dengan kalibrasi multivariat dapat digunakan dalam menganalisis senyawa multikomponen yang memiliki spektra UV overlapping (Danzer et al, 2004). Metode kemometrika yang paling sering dikombinasikan dengan spektrofotometri UV adalah metode kalibrasi multivariat partial least square (PLS). Kalibrasi multivariat PLS merupakan metode yang menggunakan suatu kombinasi linier dari variabel prediktor daripada menggunakan variabel biasa. Pemilihan metode kalibrasi multivariat partial least square (PLS) didasarkan pada kelebihan metode ini yang mampu memprediksi dengan cara yang lebih baik ketika terdapat spektra yang tumpang tindih satu sama lain (Sohrabi et al., 2009). Kombinasi kedua metode ini diharapkan mampu untuk menganalisis senyawa multikomponen parasetamol,

24 3 guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan sirup farmasi, sehingga metode ini diharapkan dapat diaplikasikan secara rutin oleh pihak-pihak yang berkepentingan. 1. Rumusan Masalah Berdasarkan pada latar belakang permasalahan yang telah diuraikan di atas, maka dapat diuraikan beberapa rumusan masalah sebagai berikut: a. Apakah metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan teknik kemometrika kalibrasi multivariat PLS untuk analisis sediaan sampel sirup dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat merupakan metode yang valid? b. Apakah kombinasi metode spektroskopi UV dengan teknik kalibrasi multivariat PLS tanpa proses pemisahan dapat digunakan untuk menetapkan kadar parasetamol, guaifenesin, dan klorfeniramin maleat dalam sirup? 2. Keaslian Penelitian Hasil penelusuran publikasi-publikasi ilmiah menunjukkan bahwa analisis campuran parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat secara simultan dalam sediaan sampel sirup secara spektrofotometri UV-Vis yang dikombinasikan dengan kemometrika kalibrasi multivariat belum pernah dilaporkan. Beberapa penelitian yang telah berhasil menetapkan kadar senyawa multikomponen dengan metode kalibrasi multivariat PLS adalah sebagai berikut:

25 4 a. Kombinasi spektrofotometri UV dan kalibrasi multivariat untuk analisis parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan tablet secara simultan tanpa tahap pemisahan oleh Yani Ardiyanti (2014). b. Penetapan kadar parasetamol, ibuprofen, dan kafein secara simultan dengan kombinasi spektrofotometri UV dan pendekatan kalibrasi multivariat oleh Khosayand et al., (2008). 3. Manfaat Penelitian Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini: a. Manfaat Metodologis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah tentang penggunaan metode spektroskopi UV yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat dalam analisis kadar parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat sediaan sampel sirup. b. Manfaat Teoretis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi ilmiah mengenai validasi metode penetapan kadar sampel sirup dengan komposisi parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan farmasi secara spektrofotometri UV Vis. c. Manfaat Praktis Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk menetapkan kadar campuran parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sampel sirup yang beredar di pasaran.

26 5 B. Tujuan Penelitian Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan spektrofotometri UV untuk analisis campuran parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan sampel sirup secara langsung tanpa melakukan pemisahan terlebih dahulu. Secara khusus, penelitian ini bertujuan untuk : 1. Mengetahui validitas metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat PLS untuk analisis campuran parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat secara simultan dalam sediaan sirup. 2. Menetapkan kadar sediaan sampel sirup parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dengan metode spektrofotometri UV yang digabungkan dengan teknik kalibrasi multivariat PLS.

27 BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Sirup Sirup adalah larutan oral yang merupakan sediaan cair yang dibuat untuk pemberian oral, mengandung sukrosa (tidak kurang dari 64,0 % dan tidak lebih dari 66,0 %) atau gula lain kadar tinggi dengan atau tanpa bahan pengaroma, atau pewarna yang larut dalam air atau campuran kosolven-air (Anonim, 1979; Anonim, 1995). Sirup yang mengandung bahan pemberi rasa tapi tidak mengandung zat-zat obat (bahan aktif) dinamakan pembawa. Sirup dimaksudkan pembawa yang memberikan rasa enak pada zat obat yang ditambahkan kemudian, baik dalam peracikan resep atau dalam pembuatan formula standar. Sedangkan sirup obat adalah sirup yang mengandung bahan terapeutik atau bahan obat (Ansel, 1989). Kandungan sakarosa dalam sirup terletak antara 50 sampai 65 %, akan tetapi umumnya terletak antara 60 sampai 65 %. Dalam larutan gula yang jenuh (kira-kira 66%) tidak memungkinkan pembentukan jamur karena dengan larutan berkonsentrasi tinggi, air yang penting untuk perkembangan jamur ditarik melalui osmosis. Atas dasar ini sediaan dengan sukrosa berkonsentrasi tinggi dinilai lebih baik. Meskipun demikian harus diperhatikan, bahwa dengan meningkatnya kandungan gula dari sirup dapat menyebabkan berkurangnya kelarutan bahan obat tertentu (Voight, 1995). 6

28 7 B. Parasetamol, Guaifenesin, Klorfeniramin maleat Parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat sering dijumpai dalam sediaan farmasi untuk mengatasi batuk dan pilek. Kebanyakan batuk dan pilek disebabkan oleh infeksi virus pada saluran pernafasan bagian atas (ISPA). Penyakit ini sebenarnya dapat sembuh dengan sendirinya, namun masyarakat memilih untuk mengkonsumsi obat-obatan untuk mengurangi gejala yang timbul. Obat-obatan ini dapat diperoleh tanpa menggunakan resep dokter (Over the Counter/OTC) (Blenkinsoop et al., 2009). Obat batuk dan pilek merupakan salah satu segmen terbesar obat OTC. Dengan adanya peningkatan kebutuhan obat batuk dan pilek, maka mendorong kompetisi perusahaan-perusahaan farmasi untuk memproduksi obat-obatan tersebut. Dengan demikian diperlukan pula metode analisis yang cepat, handal dan sederhana untuk menganalisis obat-obat batuk dan pilek multikomponen tersebut (Sawant dan Borkar, 2012). 1. Parasetamol Parasetamol (PCT) (Gambar 1) dengan rumus kimia C 8 H 9 NO 2 (BM 151,2) berbentuk kristal atau serbuk berkristal, sedikit larut dalam air dingin, lebih larut dalam air panas; larut dalam etanol, metanol, dimetilformamid, etilen diklorid, aseton, dan etil asetat; sangat sedikit larut dalam kloroform; sedikit larut dalam eter; praktis tidak larut dalam petroleum eter, pentane, dan benzen. Spektrum UV parasetamol pada larutan asam mempunyai panjang gelombang maksimal di sekitar 245 nm

29 8 dengan nilai A 1% 1cm = 688, pada larutan alkali 257 nm (A 1% 1cm = 715) (Moffat et al., 2004). 2. Guaifenesin Gambar 1. Struktur Parasetamol Guaifenesin (GG) (Gambar 2) dengan rumus kimia C 10 H 14 O 4 (BM 198,2) berbentuk kristal putih atau sedikit kristal abu-abu atau agregrat yang berbentuk kristal. Kelarutan guaifenesin adalah 1 g dalam 33 ml air, 1 g dalam 11 ml etanol, 1 g dalam 11 ml kloroform, 1 g dalam 100 ml eter, larut dalam gliserol dan propilen glikol, sebagian larut dalam benzen, praktis tidak larut dalam petroleum eter. Spektrum UV guaifenesin pada larutan asam mempunyai panjang gelombang maksimal di sekitar 273 nm dengan nilai A 1% 1cm = 125 (Moffat et al., 2004). Gambar 2. Struktur Guaifenesin

30 9 3. Klorfeniramin Maleat Klorfeniramin maleat (CTM) (Gambar 3) dengan rumus kimia C 16 H 19 CIN 2, C 4 H 4 O 4 (BM 390,9) berbentuk serbuk kristal putih, larut 1 mg/ml dalam 300 ml ethanol, 1 mg/ml dalam 240 ml Kloroform, 1 mg/ml dalam 160 ml air, 1 mg/ml dalam 130 ml metanol, sukar larut dalam benzen dan eter. Klorfeniramin maleat memiliki absorbansi pada panjang gelombang 265 nm dalam pelarut asam dengan nilai A 1% 1cm = 302, dan pada panjang gelombang 262 nm pada pelarut basa dengan nilai A 1% 1cm = 205 (Moffat et al., 2004). Gambar 3. Struktur Klorfeniramin Maleat C. Spektrofotometri UV-Vis Spektrofotometri ultraviolet-visibel (UV-Vis) adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik pada daerah panjang gelombang nm (UV) atau nm (Vis) (Mulja dan Suharman, 1995). Spektrofotometri UV adalah pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada panjang

31 10 gelombang (λ) nm (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan atom, ion, atau molekul. Serapan atom menyebabkan peralihan atau transisi elektronik, yaitu peningkatan energi elektron dari keadaan dasar (ground state) ke satu atau lebih tingkat energi yang lebih tinggi atau tereksitasi (excited state). Transisi terjadi jika energi yang dihasilkan oleh radiasi sama dengan energi yang diperlukan untuk melakukan transisi (Watson, 2003). Pada umumnya prinsip kerja spektrofotometri adalah berdasarkan atas interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan materi. Materi dapat berupa atom, ion atau molekul, sedangkan radiasi elektromagnetik merupakan salah satu jenis energi yang ditransmisikan dalam ruang kecepatan tinggi (Khopkar, 1990). Interaksi radiasi elektromagnetik dengan bahan yaitu bila cahaya jatuh pada senyawa maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai struktur dari molekul. Setiap senyawa mempunyai tingkatan tenaga yang spesifik. Semua molekul dapat menyerap radiasi elektromagnetik di daerah UV-Vis karena memiliki elektron sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi. Sementara panjang gelombang yang menunjukkan terjadinya serapan tergantung pada kuat lemahnya ikatan elektron dalam molekul (Day and Underwood, 1986).

32 11 Spektrofotometer double beam (Gambar 4) merupakan pengembangan dari spektrofotometer single beam karena keterbatasan yang dimiliki oleh spektrofotometer single beam. Gambar 4. Instrumentasi spektrofotometri UV double beam Spektrofotometer double beam memiliki dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin yang digunakan untuk memecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blanko dan sinar kedua melewati sampel. Dengan dilakukannya sistem ini maka spektrofotometer double beam dapat mengkoreksi perubahan respon absorbansi akibat perbedaan intensitas cahaya, fluktuasi pada kelistrikan instrumen dan absorbansi blanko (Haven et al., 1994). Penyerapan (absorpsi) sinar UV dan sinar tampak umumnya dihasilkan oleh eksitasi elektron-elektron ikatan, sehingga panjang gelombang pita yang menyerap dapat dihubungkan dengan ikatan yang ada dalam suatu molekul. Dalam spektrofotometer UV-Vis, suatu radiasi dikenakan pada larutan (sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh sampel ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan

33 12 yang diserap. Serapan terjadi jika radiasi/foton yang mengenai sampel memiliki energi yang sama dengan energi yang diperlukan untuk perubahan tenaga. Kekuatan radiasi dapat mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan pemantulan cahaya (Rohman, 2012). Kesalahan dalam pengukuran menggunakan spektrofotometer dapat ditimbulkan oleh beberapa hal, antara lain: adanya bekas jari yang menempel pada dinding kuvet, adanya gelembung gas atau partikel yang tidak larut yang berada dalam jalan optis, stabilitas sampel serta konsentrasi analit. Untuk meminimalkan kesalahan tersebut salah satunya dengan cara mengendalikan konsentrasi analit sehingga didapatkan nilai serapan antara 0,2-0,8. Persentase kesalahan analisis yang dihasilkan pada pembacaan serapan 0,2-0,8 yang masih dapat diterima yaitu sebesar 0,5-1 % (Mulja dan Suharman, 1995). D. Analisis Multikomponen Secara Spektrofotometri UV Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu metode pengukuran berdasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan sampel di daerah panjang gelombang nm. Berbagai publikasi telah melaporkan analisis parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat secara spektrofotometri UV-Vis, dalam campuran dengan obat lain, terutama dihubungkan dengan perkembangan perangkat lunak kemometrika (Khosayand, 2008). Khosayand et al. (2008) telah berhasil menetapkan kandungan parasetamol, ibuprofen dan kafein dalam sediaan farmasi kapsul secara bersama-sama

34 13 menggunakan spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kemometrika kalibrasi multivariat PLS dan principal component-artificial neural network. Yani Ardiyanti (2014) telah berhasil melakukan analisis penetapan kandungan parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat secara simultan dengan menggunakan metode kombinasi antara spektrofotometri UV dan kemometrika kalibrasi multivariat PLS dalam sediaan tablet. Hasil uji yang didapatkan untuk parasetamol 639,38 mg/tab ± 0,82, guaifenesin 102,61 mg/tab ± 1,45 dan klorfeniramin maleat 1,98 mg/tab ± 2,64. Penggunaan kalibrasi multivariat-spektrofotometri UV telah dilaporkan untuk analisis parasetamol, difenhidramin serta fenilpropanolamin, yang mana parasetamol adalah komponen dalam jumlah banyak, sementara dua lainnya dalam jumlah sedikit. Analisis campuran ini dapat dilakukan tanpa pemisahan terlebih dahulu dengan kalibrasi multivariat PLS terhadap spektra campuran ketiganya. Meskipun rasio molaritas parasetamol dengan lainnya adalah 38 : 1 (dengan difenhidramin) dan 25 : 1 (dengan fenilpropanolamin), akan tetapi keduanya dapat dianalisis dengan akurasi dan presisi yang baik tanpa adanya gangguan dari bahan tambahan tablet (Goicoechea dan Olivieri, 1999). Peneliti ini juga melaporkan bahwa penggunaan CLS kurang memuaskan karena rendahnya nilai absorbansi komponenkomponen minor.

35 14 E. Kemometrika Menurut International Chemometrics Society, kemometrika adalah ilmu pengetahuan yang menghubungkan pengukuran yang dibuat pada suatu proses atau sistem kimiawi melalui penggunaan ilmu matematika dan metode statistik. Dari sini dapat diketahui bahwa ilmu matematika dan statistika mendukung pemahaman kemometrika. Kemometrika dikenalkan ke dalam spektroskopi untuk meningkatkan kualitas data yang diperoleh. Meskipun pada awal penggunaannya hanya untuk mengolah data spektra, akan tetapi saat ini kemometrika memungkinkan untuk memperlakukan sejumlah besar informasi yang berasal dari konsentrasi komponen sampel dalam jangka waktu yang cepat (Rohman, 2014). Metode kemometrika telah dikenalkan dan digunakan secara luas dalam bidang analisis obat seperti kalibrasi multivariat dan analisis pengelompokkan seperti principle component analysis dan discriminant analysis (Massart and Buydens, 1988). Kalibrasi multivariat merupakan teknik yang paling sering digunakan terutama untuk analisis multi-komponen (Miller and Miller, 2010). Diantara jenis kalibrasi multivariat, teknik kalibrasi classical least squares (CLS), stepwise multiple linear regression (SMLR), principle component regression (PCR) dan partial least squares (PLS) merupakan jenis yang paling sering digunakan. Kalibrasi PCR merupakan analisis faktor yang mana hanya spektra yang tidak memberi ko-linieritas yang digunakan dalam kalibrasi. PCR mengaplikasikan teknik multivariat analisis komponen utama atau principal component analysis (Che Man et al., 2010). Sementara itu, kalibrasi PLS merupakan jenis regresi yang dihitung

36 15 dengan algoritma kuadrat terkecil yang menghubungkan antara dua matriks, data spectra pada matriks X dan nilai referens pada matriks Y. PLS sering digunakan dalam spektroskopi untuk mengekstrak informasi spektra yang mengandung puncakpuncak yang tumpang suh, adanya pengganggu, serta adanya derau (noise) dari instrumen yang digunakan untuk mengumpulkan data (Syahariza et al., 2005). Teknik kalibrasi PCR dan PLS dilakukan dalam 3 tahap yaitu : (1) kalibrasi; (2) validasi; dan (3) analisis sampel yang tidak diketahui (Osborne et al., 1997). Secara umum, kalibrasi multivariat mempunyai tahap kalibrasi yang diikuti validasi (dengan validasi sampel secara terpisah atau dengan validasi silang tengan teknik leave one out) dan tahap prediksi (sampel baru). Jika hasil tahap kalibrasi dan validasi yang digunakan memenuhi kriteria (korelasi yang tinggi, kesalahan yang kecil) maka model yang dikembangkan selanjutnya digunakan untuk mengestimasi konsentrasi campuran dari sampel yang belum diketahui konsentrasinya. Kalibrasi PLS dievaluasi dengan menggunakan root mean square error of calibration (RMSEC) dan koefisien determinasi (R 2 ). Selanjutnya model PLS diujisilangkan menggunakan teknik leave one out. Dalam teknik ini, salah satu sampel kalibrasi dikeluarkan dari model PLS dan sisa sampel yang ada digunakan untuk pemodelan dengan PLS. Sampel yang dihilangkan selanjutnya dihitung dengan model PLS baru yang dikembangkan. Prosedur tersebut dilakukan berulang kali, menghilangkan satu demi satu sampel kalibrasi hingga didapatkan harga R 2 yang sesuai dengan yang diinginkan (Rohman and Che Man, 2011).

37 16 F. Validasi Metode Analisis Danzer et al. (2004) menuliskan bahwa kalibrasi di dalam analisis kimia mengacu pada hubungan antara jumlah atau kadar sampel x = fs (Q) dan fungsi terukur y = f(z) yang bisa berupa spektrum, kromatogram atau yang lain. Kehandalan analisis multikomponen harus divalidasi sesuai dengan kriteria yang umum yaitu selektivitas, akurasi dan presisi, selanjutnya dapat dihitung nilai kritis multivariat dan batas deteksi. Dalam kalibrasi multivariat, harus dihindari kolinieritas variabel yang disebabkan oleh konsentrasi sampel kalibrasi. 1. Presisi Ketidakpastian kalibrasi dan prediksi kadar yang tidak diketahui dihitung dengan root mean standard error of calibration (RMSEC) dan root mean square error of cross validation (RMSECV) dengan persamaan dibawah ini : RMSEC = ŝ cal = n ca 煜 c true,cs (y i yi ) 2 i=1 n (1) RMSECV = ŝ pred = n calc true,ts (y i yi ) 2 i=1 n (2) (true, y cs) (true, i adalah kadar aktual sampel kalibrasi, y ts) i adalah kadar aktual sampel validasi dan y (calc) i adalah kadar prediksi sampel. Parameter lain untuk mengukur presisi kalibrasi multivariat adalah nilai predictive residual error sum of squares (PRESS), yang dihitung dengan persamaan berikut : n 2 2 calc PRESS = s res = i=1 e i = (y i y 䟒 n 〱rue ) 2 i=1 (3) PRESS dihitung seperti menghitung SEP dengan menggunakan sampel validasi.

38 17 Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang untuk kadar analit 100%. Kriteria tersebut sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium seperti pada Tabel I. Tabel I. Kriteria penerimaan nilai RSD (Horwitz cit. Gonzales, Herrador, and Asuero, 2010). Analit % Fraksi analit Konsentrasi analit Nilai RSD (%) % % 2, % 4 0, ,10% 5,7 0, ppm 8 0, ppm 11,3 0, ppm 16 0, ppb 22,6 0, ppb 32 0, ppb 45,3 2. Akurasi Ada tidaknya suatu kesalahan sistematik dapat diketahui dari fungsi recovery. Kadar yang diprediksi model (ĉ) dibandingkan dengan kadar actual sampel validasi (c) dengan persamaan regresi sebagai berikut : ĉ=α + βc (4) Koefisien regresi ideal adalah jika nilai α = 0 dan β = 1 (Danzer et al., 2004). Akurasi dinyatakan sebagai persen kembali analit yang ditambahkan, nilai kecermatan dapat dinyatakan dengan persen perolehan kembali (% recovery). Batasan nilai akurasi dapat dilihat pada Tabel II.

39 18 Tabel II. Nilai % recovery sebagai fungsi dari nilai konsentrasi analit dalam matriks sampel (Wood, 1998) Analit pada matrix sampel (%) Recovery yang diterima (%) > > >0, , , ,0001 (1 ppm) ppb ppb ppb Selektivitas Secara umum, selektivitas sistem multikomponen dapat ditetapkan secara kualitatif dan kuantitatif. Dalam kalibrasi multivariat, selektivitas biasanya dihitung dengan condition number. Namun condition number tidak memperhitungkan kadar masing-masing komponen dan hanya memberikan batasan besarnya kesalahan yang diperbolehkan (Danzer et al., 2004). G. Landasan Teori Kombinasi senyawa obat parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat sering digunakan sebagai zat aktif untuk meringankan gejala batuk dan pilek, penyakit yang hampir seluruh orang pernah mengalaminya. Indikasi obat tersebut adalah sebagai analgesik, antipiretik, ekspektoran dan antihistamin (Hardman et al., 1996). Ketiga zat aktif tersebut mempunyai sifat kelarutan yang mirip. Parasetamol larut dalam air dan mudah larut didalam etanol. Guaifenesin larut dalam air dan

40 19 dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. Klorfeniramin maleat sangat mudah larut dalam air, mudah larut dalam etanol, agak sukar larut dalam kloroform. Parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat masing-masing dapat ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Spektrum UV parasetamol dalam larutan asam memiliki serapan maksimum di sekitar 245 nm dan serapan maksimum dalam larutan basa pada 257 nm. Spektrum UV guaifenesin dalam larutan asam memiliki serapan maksimum di sekitar 273 nm. Spektrum UV klorfeniramin maleat dalam larutan asam memiliki serapan maksimum pada 265 nm, dan serapan maksimum dalam larutan basa pada 262 nm. Serapan maksimum ketiga zat aktif tersebut berada dalam range panjang gelombang yang berdekatan, yang menyebabkan spektrum serapan ketiga senyawa tersebut tumpang tindih. Untuk itu, metode analisis spektrofotometri UV-Vis yang dikombinasikan dengan kemometrika kalibrasi multivariat dapat digunakan sebagai metode analisis untuk ketiga senyawa yang tumpang tindih tersebut. Proses penetapan kadar secara simultan dari dua atau lebih kombinasi senyawa obat multikomponen yang mengkombinasikan metode analisis spektrofotometri UV dengan kemometrika kalibrasi multivariat dikategorikan berhasil apabila nilai koefisien determinasi (R 2 ) hubungan antara kadar sebenarnya dengan kadar terprediksi >0,99, dan RMSECV (root mean square error of cross validation) yang dihasilkan kecil.

41 20 H. Hipotesis 1. Spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat dapat digunakan untuk analisis campuran parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan sampel sirup. 2. Spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan sampel sirup.

42 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis penelitian ini termasuk penelitian noneksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif. Jenis penelitian noneksperimental karena subyek penelitian tidak diberi perlakuan. Rancangan penelitian bersifat deskriptif karena peneliti hanya mendeskripsikan keadaan yang ada. B. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Variabel bebas penelitian ini adalah variasi konsentrasi larutan campuran senyawa parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat. 2. Variabel Tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah konsentrasi sampel larutan parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat. 3. Variabel Pengacau Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian standar analisis parasetamol, guaifenesin, dan klorfeniramin maleat yang digunakan, kualitas pelarut yang digunakan dan kontaminasi dari alat gelas. 21

43 22 C. Defenisi Operasional 1. R 2 atau R-sq merupakan koefisien determinasi yang menggambarkan kemampuan nilai konsentrasi sebenarnya dalam menjelaskan hubungan terhadap nilai terhitung. 2. RMSE (root mean square of error) merupakan standar deviasi dari sebuah pemodelan yang menjelaskan seberapa mungkin suatu model kalibrasi melakukan kesalahan saat memprediksikan sampel. 3. PRESS (predicted error sum of square) merupakan nilai kesalahan yang dilakukan saat prediksi sampel oleh model kalibrasi dalam proses crossvalidation dengan teknik leave-one-out. D. Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah standar kerja parasetamol yang diperoleh dari PT. Combiphar Indonesia, baku guaifenesin dan klorfeniramin maleat yang diperoleh dari PT. Konimex dengan Certificate of Analysis (sebagaimana dalam lampiran 1-3), akuades, metanol teknis, sediaan sirup dengan merk paten produksi perusahaan farmasi Indonesia dibeli dari apotek di Yogyakarta. Komposisi zat aktif dalam sampel sediaan farmasi sirup terdiri atas parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat, dan kertas saring. E. Alat Penelitian Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu) tipe UV-1800 dengan kuvet kwarsa merk Hellma, alat sonikasi, timbangan analitik (Ohauss) tipe PAJ1003 dengan kepekaan 0,1 mg (maksimal 120 gram, minimal 0,001 gram), pipet mikro dengan

44 23 skala µl dan µl merk Socorex, pipet volum dengan ukuran 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, serta gelas-gelas yang lazim digunakan dalam laboratorium analisis kimia yang terdapat di laboratorium di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. F. Tata Cara Penelitian Penelitian ini merupakan proses penetapan kadar parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dalam sediaan sampel sirup dengan metode kombinasi spektrofotometri UV-kalibrasi multivariat tanpa tahap pemisahan. Analisis secara spektrofotometri UV-kalibrasi multivariat dilakukan dengan cara: 1. Scanning spektra standar Scanning standar dilakukan dengan membuat standar parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dengan konsentrasi 5 µg/ml dan dilakukan scanning spketra pada panjang gelombang nm. 2. Pemilihan interval dan panjang gelombang pengukuran untuk set kalibrasi a. Dilakukan pengamatan spektra dari hasil pengukuran campuran standar parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat. Kemudian dipilih rentang panjang gelombang saat campuran senyawa mulai memberikan serapan sampai campuran memberikan serapan mendekati nilai 0. b. Rentang panjang gelombang yang dipilih adalah nm. Interval pengukuran yang dipilih adalah 2 nm agar diperoleh data pengamatan dalam jumlah yang cukup untuk dapat menggambarkan hubungan variabel.

45 24 3. Penyiapan larutan set kalibrasi a. Standar parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat masing-masing ditimbang seksama 50 mg, dimasukkan dalam labu takar 100 ml, dilarutkan dengan pelarut akuades, disonikasi selama 15 menit, dan ditambahkan dengan pelarut sampai batas tanda. b. Dibuat 20 larutan model kalibrasi dengan cara setiap larutan standar intermediet dipipet sejumlah tertentu, dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan diencerkan dengan pelarut akuades hingga diperoleh kadar sesuai Tabel III untuk set kalibrasi. Tabel III. Komposisi campuran sintetik parasetamol (PCT), guaifenesin (GG) dan klorfeniramin maleat (CTM) untuk model kalibrasi. No PCT GG CTM PCT GG CTM No (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) 1 5,0 3,0 9, ,0 11,0 14,0 2 12,0 11,0 13,0 12 4,0 19,0 6,0 3 10,0 15,0 10,0 13 6,0 8,0 8,0 4 15,0 12,0 20,0 14 4,0 5,0 7,0 5 11,0 11,0 8, ,0 8,0 14,0 6 6,0 7,0 20,0 16 9,0 7,0 2,0 7 8,0 17,0 10,0 17 3,0 16,0 7,0 8 8,0 6,0 15,0 18 8,0 5,0 6,0 9 10,0 16,0 3,0 19 2,0 17,0 16, ,0 17,0 8,0 20 2,0 6,0 15,0

46 25 4. Pembuatan Standar Adisi CTM a. Ditimbang seksama 50 mg baku CTM, dimasukkan dalam labu takar 50 ml dan dilarutkan dengan sebagian pelarut akuades, diultrasonikasi selama 15 menit, kemudian ditambahkan dengan pelarut akuades sampai batas tanda. b. Dari larutan (a) tersebut, dipipet sebanyak 5 ml, dimasukkan dalam labu takar 50 ml, kemudian di tambahkan dengan pelarut sampai batas tanda. 5. Analisis Sampel a. Sediaan sampel sirup dipipet 5 ml, yang setara dengan 120 mg PCT, 25 mg GG dan 1 mg CTM, dimasukan ke dalam labu takar 50 ml, lalu dilarutkan dalam sebagian pelarut akuades, diultrasonikasi selama 15 menit, kemudian ditambahkan akuades sampai batas tanda. b. Dari larutan (5a) tersebut, sejumlah 5 ml larutan diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml, kemudian diencerkan dengan pelarut akuades sampai batas tanda. c. Dari larutan (5b) tersebut, sejumlah 1 ml larutan diambil, lalu dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml, dan ditambahkan dengan pelarut akuades sampai batas tanda. d. Dilakukan scanning dari larutan tersebut pada panjang gelombang nm dengan interval pengukuran sebesar 2 nm. e. Dilakukan penetapan kadar PCT, GG dan CTM sebanyak 6 kali replikasi, dimana 5 replikasi (replikasi 2 sampai replikasi 6) dilakukan adisi dengan menggunakan baku ctm, dengan menambahkan secara bertingkat masing-masing 1 ml, 2 ml, 3

47 26 ml, 4 ml dan 5 ml. Kadar dihitung dengan metode kalibrasi multivariat partial least square (PLS). 6. Analisis Statistik Kalibrasi Multivariat PLS a. Model Kalibrasi Multivariat PLS 1. Data konsentrasi dan absorbansi kelompok larutan kalibrasi yang disajikan dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel dipindahkan ke dalam kertas kerja Minitab 16 (trial). 2. Pengolahan data statistik partial least square (PLS) dipilih dengan menggunakan pilihan Stat pada panel kerja Minitab 16, kemudian dipilih regression partial least square. 3. Setelah muncul jendela baru dari program Minitab 16, dilakukan pembuatan model PLS parasetamol dengan cara: kolom response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi PCT dan kolom model dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang nm. Untuk pembuatan model PLS guaifenesin dibuat dengan cara: kolom response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi GG dan kolom model dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang nm. Untuk pembuatan model PLS klorfeniramin maleat dibuat dengan cara: kolom response diisi dengan pilihan variabel konsentrasi CTM dan kolom model dipilih variabel absorbansi pada panjang gelombang nm. 4. Diperoleh nilai terhitung dan nilai sebenarnya dari model kalibrasi multivariat PLS parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat, nilai

48 27 tersebut kemudian dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel. 5. R 2 didapat dari hubungan korelasi atau kedekatan nilai antara nilai sebenarnya (sumbu X) dengan nilai terhitung (sumbu Y). 6. RMSEC dapat dihitung menggunakan rumus (x y) 2 n 1 yang mana x adalah nilai sebenarnya (actual), y adalah nilai terhitung (calculated), dan n adalah banyaknya data konsentrasi yang dirandomisasi, yaitu 20. b. Cross Validation Leave-one-out 1. Data dipindahkan dari kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel ke dalam kertas kerja Minitab Dipilih model kalibrasi PLS dengan menekan pilihan stat pada panel kerja, kemudian dipilih regression partial least square. 3. Proses validasi model kalibrasi dilakukan dengan memasukkan variabel konsentrasi PCT ke dalam response dan variabel absorbansi ke dalam kolom model. Kemudian tekan tombol option yang selanjutnya ditentukan tambahan proses leave-one-one. Perlakuan sama diberlakukan untuk proses validasi GG dan CTM. 4. Diperoleh nilai sebenarnya dan nilai terhitung, serta nilai PRESS dari tahap validasi internal dan selanjutnya dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel.

49 28 5. Akurasi dan presisi model kalibrasi ditinjau dari nilai R 2 dan nilai RMSECV dengan membuat hubungan linier antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung. Diperoleh persamaan regresi linier y = bx+a hubungan antara nilai sebenarnya dan terhitung yang nantinya akan digunakan untuk memperoleh nilai RMSECV. 7. Analisis data sampel a. Akurasi dan presisi model kalibrasi multivariat parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat dinyatakan secara statistik dengan nilai R 2, RMSEC, RMSECV, RMSEP dan PRESS. b. Konsentrasi sampel dihitung dengan memasukkan koefisien dari masing-masing model untuk senyawa parasetamol, guaifenesin dan klorfeniramin maleat sesuai dengan rumus: X = t 1 p 1 + t 2 p t s p s + ε Keterangan : X t s p s ε = Konsentrasi terhitung sampel (µg/ml) = Koefisien dari model kalibrasi = Absorbansi dari masing-masing pengukuran sampel = Koreksi kesalahan yang mungkin terjadi pada model kalibrasi PLS c. Kadar sampel dihitung dengan menggunakan rumus : Faktor Pengenceran x Calculated.

50 29 d. Akurasi proses penetapan kadar ditetapkan dengan persen perolehan kembali dengan rentang yang dapat diterima menurut Wood (1998) adalah sebesar %. e. Presisi proses penetapan kadar ditetapkan dengan nilai RSD dengan nilai maksimal yang masih dapat diterima menurut Gonzales dan Herrador (2007) adalah sebesar 8%. Analisis kalibrasi multivariat dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Minitab 16. Kertas kerja perangkat lunak Excel 2007 digunakan untuk menentukan konsentrasi secara random masing masing zat aktif dan untuk menghubungkan antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung.