PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Transkripsi

1 KOMBINASI SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET DAN KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK ANALISIS GUAIFENESIN, CHLORPHENIRAMINE MALEAT DAN DEXTROMETHORPAN HBr DALAM SEDIAAN TABLET SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Sophia Sari Asdini NIM : FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

2 KOMBINASI SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET DAN KALIBRASI MULTIVARIAT UNTUK ANALISIS GUAIFENESIN, CHLORPHENIRAMINE MALEAT DAN DEXTROMETHORPAN HBr DALAM SEDIAAN TABLET SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Sophia Sari Asdini NIM : FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015 i

3 ii

4 iii

5 HALAMAN PERSEMBAHAN Tugas kita bukanlah untuk berhasil. Tugas kita adalah untuk mencoba, karena di dalam mencoba itulah kita menemukan dan belajar membangun kesempatan untuk berhasil ~Mario Teguh. TERUNTUK - Allah SWT yang Maha Pemberi Petunjuk - Ibu Bapak dan Kakak untuk segala doa dukungan perhatian dan yang selalu ada di dalam suka maupun duka - Almamater Fakultas Farmasi Sanata Dharma iv

6 v

7 vi

8 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan naskah skripsi ini. Skripsi yang berjudul Kombinasi Spektrofotometri Ultraviolet dan Kalibrasi Multivariat untuk Analisis Guaifenesin, Chlorpheniramine Maleat dan Dextromethorphan HBr dalam Sediaan Tablet ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Universitas Sanata Dharma. Penulis sadar bahwa keberhasilan dalam penulisan skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan dari segala pihak yang telah memberikan saran dan kritik kepada penulis. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini perkenankanlah penulis untuk menyampaikan rasa terimakasih yang setulus-tulusnya kepada : 1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D.Apt, selaku dekan Universitas Sanata Dharma. 2. Prof. Dr. Abdul Rohman, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing yang dengan penuh kesabaran memberikan masukan, semangat, dukungan, saran dan kritik kepada penulis baik dalam proses penelitian sampai dengan penyusunan naskah ini. vii

9 3. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing kedua yang juga selalu memberikan semangat, arahan, bimbingan, kritik dan saran kepada penulis selama proses penelitian sampai penyusunan naskah. 4. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen pembimbing akademik yang memberikan masukan, dukungan dan semangat kepada penulis dalam proses pengerjaan skripsi ini dan selama menjalankan studi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 5. Dosen penguji yang akan memberikan kritik dan saran yang akan membuat penulisan naskah ini menjadi lebih baik. 6. PT. Konimex yang telah bersedia memberikan baku guaifenesin dan chlorpheniramine maleat yang berguna dalam skripsi ini. 7. PT. Combiphar yang telah bersedia memberikan baku dextromethorphan HBr yang berguna dalam skripsi ini. 8. Mas Bimo dan Pak Kethul selaku staff Laboratorium Kimia Analisis Instrumental yang telah memberikan banyak kemudahan kepada penulis dan tim selama proses penelitian. 9. Seluruh keluarga besar tercinta. Bapak, Ibu, Mba Ega untuk segala doa, dukungan dan perhatian kepada penulis selama ini. 10. Teresa Devina Hani Wijaningtyas, sebagai rekan satu perjuangan yang selalu memberikan semangat, kekuatan, dorongan untuk selalu tetap semangat dan kuat dalam menyelesaikan tugas akhir ini. viii

10 11. Ade, Arif, Jalaq dan Erfan, selaku rekan sekelompok yang sudah berjuang bersama dan selalu memberikan dukungan, semangat dan bantuan kepada penulis selama proses penelitian. 12. Muhammad Fauzan Hermady, atas kebersamaan, kesabaran, pengertian, doa, dukungan dan semangat yang tidak henti-hentinya kepada penulis. 13. Bratbrot team yang dengan selalu mendengarkan keluh kesah dan selalu memberikan doa dan semangat sehingga memberikan motivasi kepada penulis untuk selalu berusaha lebih keras. 14. Wirna, Satrio, Kiki, Lika, Miko, Devi serta seluruh teman yang berjuang bersama dalam melakukan penelitian di Laboratorium Kimia Analisis Instrumental. 15. Teman teman FST B 2011 yang selalu memberikan semangat dalam pembuatan skripsi ini. 16. Seluruh teman, baik di Fakultas Farmasi maupun dari luar yang selalu memberikan semangat dan dukungan kepada penulis. 17. Semua pihak yang membantu penulis selama proses penelitian dan penyusunan tugas akhir ini, yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu. Penulis menyadari bahwa tugas akhir ini masih memiliki banyak kekurangan dan ketidaksempurnaan, karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak. ix

11 Akhir kata, semoga penelitian skripsi yang penulis lakukan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu kefarmasian. Yogyakarta, Juli 2015 Penulis x

12 DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING... ii HALAMAN PENGESAHAN... iii HALAMAN PERSEMBAHAN... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA... v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI... vi PRAKATA... vii DAFTAR ISI... xi DAFTAR TABEL... xv DAFTAR GAMBAR... xvii DAFTAR LAMPIRAN... xxi INTISARI... xxiv ABSTRACT... xxv BAB I. PENGANTAR... 1 xi

13 A. Latar Belakang Perumusan masalah Keaslian penelitian Manfaat penelitian... 4 B. Tujuan Penelitian... 4 BAB II. DASAR TEORI... 6 A. Guaifenesin... 6 B. Chlorpheniramine maleat... 7 C. Dextromethorphan HBr... 7 D. Spektrofotometri Ultraviolet Instrumentasi spektrofotometer ultraviolet Hukum Lambert Beer E. Analisis Multikomponen secara Spektrofotometri Ultraviolet F. Kemometrika G. Validasi Metode Analisis Pengertian dan alasan validasi metode analisis xii

14 2. Parameter dan kategori validasi metode analisis Validasi metode kalibrasi multivariat H. Landasan Teori I. Hipotesis BAB III. METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian B. Variabel Penelitian Variabel Bebas Variabel Tergantung Variabel Pengacau C. Definisi Operasional D. Bahan Penelitian E. Alat Penelitian F. Tata Cara Penelitian Penyiapan Larutan Standar Uji Keseragaman Bobot xiii

15 3. Penyiapan Larutan Sampel Analisis Statistik dan Pengolahan Data BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Analisis guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat dengan menggunakan spektrofotometri uv B. Kalibrasi multivariat dengan menggunakan Partial Least Square PLS) C. Validasi model kalibrasi multivariat PLS D. Penetapan kadar sampel sediaan farmasi BAB V KESIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN BIOGRAFI PENULIS xiv

16 DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Karakteristik validasi metode analisis menurut ISO/IEC 17025, USP dan ICH Tabel 2. Kriteria penerimaan nilai RSD Tabel 3. Kriteria penerimaan nilai % recovery Tabel 4. Elemen elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi menurut USP Tabel 5. Komposisi campuran sintetik guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr untuk kalibrasi Tabel 6. Komposisi campuran sintetik guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr untuk validasi Tabel 7. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi PLS dari 20 sampel kalibrasi Tabel 8. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi PLS dari 10 sampel validasi Tabel 9. Rekapitulasi evaluasi parameter validasi metode spektrofotometri UV-PLS xv

17 Tabel 10. Hasil penetapan kadar prediksi guaifenesin dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV- PLS Tabel 11. Hasil penetapan kadar prediksi dextromethorphan HBr dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS Tabel 12. Hasil penetapan kadar prediksi chlorpheniramine maleat dalam sediaan tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS xvi

18 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Struktur Guaifenesin... 6 Gambar 2. Struktur Chlorpheniramine Maleat... 7 Gambar 3. Dextromethorphan HBr... 8 Gambar 4. Spektrum absorpsi pada panjang gelombang masing- masing komponen tidak saling tumpang tindih Gambar 5. Spektrum absorpsi tumpang tindih satu arah Gambar 6. Spektrum absorpsi tumpang tindih dua arah Gambar 7. Overlay spektra uv guaifenesin, chlorpheniramine maleat, dextromethorphan HBr dan campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat, dextromethorphan HBr pada konsentrasi 20 µg/ml Gambar 8. Overlay spektra uv campuran baku (guaifenesin, chlorpheniramine maleat, dextromethorphan HBr) dan sampel sedian farmasi yang mengandung guaifenesin, chlorpheniramine maleat, dextromethorphan HBr xvii

19 Gambar 9. Overlay spektra uv campuran baku guaifenesin, dextromethorphan HBr dan clorpheniramine maleat Gambar 10. Kurva hubungan antara kadar guaifenesin sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) guaifenesin dengan metode spektrofotometri uv- PLS pada panjang λ nm Gambar 11. Kurva hubungan antara kadar dextromethorphan HBr sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) guaifenesin dengan metode spektrofotometri uv- PLS pada λ nm Gambar 12. Kurva hubungan antara kadar chlorpheniramine maleat sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) guaifenesin dengan metode spektrofotometri uv- PLS pada λ nm Gambar 13. Data dan parameter hasil validasi silang guaifenesin dengan teknik leave one out Gambar 14. Data dan parameter hasil validasi silang dextromethorphan HBr dengan teknik leave one out Gambar 15. Data dan parameter hasil validasi silang chlorpheniramine maleat dengan teknik leave one out xviii

20 Gambar 16. Kurva hubungan antara kadar guaifenesin sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respon) hasil validasi silang (leave one out) dengan metode spektrofotometri UV-PLS Gambar 17. Kurva hubungan antara kadar dextromethorphan HBr sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respon) hasil validasi silang (leave one out) dengan metode spektrofotometri UV-PLS Gambar 18. Kurva hubungan antara kadar chlopheniramine maleat sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respon) hasil validasi silang (leave one out) dengan metode spektrofotometri UV-PLS Gambar 19. Kurva hubungan antara kadar guaifenesin sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) hasil validasi eksternal dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada λ nm Gambar 20. Kurva hubungan antara kadar dextromethorphan HBr sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) hasil validasi eksternal dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada λ nm xix

21 Gambar 21. Kurva hubungan antara kadar chlorpheniramine maleat sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) hasil validasi eksternal dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada λ nm Gambar 22. Overlay spektra 6 sampel sediaan farmasi dalam pelarut etanol pada λ nm xx

22 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Keseragaman Bobot Lampiran 2. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat Partial Least Square (PLS) Guaifenesin dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi silang leave one out Lampiran 3. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat Partial Least Square (PLS) Dextromethorphan HBr dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi silang leave one out Lampiran 4. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat Partial Least Square (PLS) Chlorpheniramine maleat dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi silang leave one out Lampiran 5. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat Partial Least Square (PLS) Guaifenesin dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one out xxi

23 Lampiran 6. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat Partial Least Square (PLS) Dextromethorphan HBr dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one out Lampiran 7. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat Partial Least Square (PLS) Chlorpheniramine maleat dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one out Lampiran 8. Data pengukuran spektrofotometri uv 20 campuran sintetik untuk model kalibrasi Partial Least Square (PLS) Lampiran 9. Data pengukuran spektrofotometri uv 10 campuran sintetik untuk validasi model kalibrasi PLS Lampiran 10. Perhitungan kadar guaifenesin terprediksi dari sampel validasi eksternal 10 campuran sintetik menggunakan koefisien hasil validasi silang Lampiran 11. Perhitungan kadar CTM terprediksi dari sampel validasi eksternal menggunakan koefisien hasil validasi silang xxii

24 Lampiran 12. Perhitungan kadar Dextromethorphan HBr terprediksi dari sampel validasi eksternal menggunakan koefisien hasil validasi silang Lampiran 13. Perhitungan kadar guaifenesin terprediksi dari sampel tablet sediaan farmasi menggunakan koefisien hasil validasi silang Lampiran 14. Perhitungan kadar dextromethorphan HBr terprediksi dari sampel tablet sediaan farmasi menggunakan koefisien hasil validasi silang Lampiran 15. Perhitungan kadar chlorpheniramine maleat terprediksi dari sampel tablet sediaan farmasi menggunakan koefisien hasil validasi silang Lampiran 16. Certificate of Analysis (CoA) Guaifenesin Lampiran 17. Certificate of Analysis (CoA) Dextromethorphan HBr Lampiran 18. Certificate of Analysis (CoA) Chlorpheniramine maleat xxiii

25 INTISARI Metode pilihan untuk melakukan analisis sediaan multi-komponen adalah dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) namun seiring dengan semakin banyaknya sediaan multi-komponen yang beredar di masyarakat maka diperlukan pengembangan metode yang lebih sederhana seperti spektrofotometri karena penggunaan metode kromatografi untuk analisis sediaan multi-komponen memerlukan waktu yang lama dan biaya yang besar. Spektrofotometri Uv yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat partial least square (PLS) telah digunakan untuk analisis multi-komponen dalam sediaan farmasi tanpa didahului oleh tahap pemisahan. Suatu model campuran obat guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat akan dioptimasi untuk dianalisis dengan spektroskopi uv dan kalibrasi multivariat. Model kalibrasi disiapkan dengan membuat 20 dan 10 sampel campuran obat dengan proporsi tertentu dan dievaluasi berdasarkan nilai koefisien determinasi (R 2 ) untuk menyatakan nilai akurasi dan nilai root mean square error of calibration (RMSEC), root mean squared error cross validation (RMSECV) dan root mean square error of prediction (RMSEP) untuk menyatakan nilai presisi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa spektrofotometri Uv yang dikombinasikan dengan PLS belum berhasil digunakan untuk analisis senyawa obat campuran guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat. dilihat dari nilai koefisien determinasi yang dihasilkan < 0,99. Nilai RMSEC untuk guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat masing masing 0,130 µg/ml, 0,027 µg/ml dan 0,049 µg/ml, sementara nilai RMSECV masingmasing 1,377 µg/ml, 0,409 µg/ml dan 0,571 µg/ml. Nilai RMSEP masing-masing obat adalah 2,817 µg/ml, 2,136 µg/ml dan 131,068 µg/ml. Kata kunci : Spektrofotometri Uv, kalibrasi multivariat, multi-komponen. xxiv

26 ABSTRACT The method of choice for analysis of multi-component preparation is by using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) but along with the increasing number of multi-component preparations that circulate in society will require the development of simpler methods such as spectrophotometry because of the use of chromatographic method for the analysis multi- components require a long time and huge costs. Uv spectrophotometry combined with multivariate calibration techniques of Partial Least Square (PLS) was used for the analysis of multi-component in pharmaceutical preparations without preceded by phase separation. A mixed model drug of guaifenesin, dextromethorphan HBr and chlorpheniramine maleate would be optimized for analysis with uv spectroscopy and multivariate calibration. Model calibration was prepared by making a mixture of 20 and 10 samples of drugs with a certain proportion and evaluated based on the value of the coefficient of determination (R 2 ) to declare the value of accuracy and value of the Root Mean Square Error of Calibration (RMSEC), Root Mean Squared Error of Cross Validation (RMSECV) and Root Mean Square Error of Prediction (RMSEP) to declare the value of precision. The results showed that uv spectrophotometry combined with PLS has not been successfully used for the analysis of drug compounds of guaifenesin, dextromethorphan HBr and chlorpheniramine maleate, from the result coefficient of determination that produced < RMSEC value to guaifenesin, dextromethorphan HBr and chlorpheniramine maleate 0,130 mg/ml, 0,027 mg/ml and 0,049 mg/ml, while the RMSECV value 1,377 mg/ml, 0,409 mg/ml and 0,571 mg/ml. RMSEP value of each drug 2,817 mg/ml, 2,136 mg/ml and 131,068 mg/ml. Keyword : Spectrophotometry Uv, multivariate calibration, multi component xxv

27 BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Salah satu obat yang digunakan luas di masyarakat adalah obat batuk dan flu. Saat ini banyak obat batuk dan flu yang beredar dengan sediaan obat lebih dari satu komponen zat aktif. Salah satu kombinasi obat yang digunakan adalah campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr yang tersedia dalam bentuk sediaan tablet dengan berbagai merek dagang. Dalam bidang farmasi khususnya dalam bidang pembuatan obat, pemeriksaan kadar zat aktif merupakan persyaratan yang harus dipenuhi untuk menjamin kualitas obat. Sediaan obat yang berkualitas baik akan mendukung tercapainya efek terapeutik yang diharapkan. Salah satu persyaratan mutu adalah kadar yang terkandung harus memenuhi persyaratan kadar seperti yang tercantum dalam Farmakope Indonesia atau buku resmi lainnya. Oleh karena itu, diperlukan suatu metode yang sederhana dan cepat seperti spektrofotometri uv sehingga hampir semua laboratorium kimia dapat melakukannya (Givianrad and Mohagheghian, 2011; Bano et al., 2013; Islam et al., 2013). Dilihat dari struktur guaifenesin (Gambar 1), chlorpheniramine maleat (Gambar 2) dan dextromethorpan HBr (Gambar 3) yang mempunyai gugus kromofor, maka senyawa ini dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet. Menurut Moffat (2011), guaifenesin memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada λ 273 nm 1

28 2 ( = 125), chlorpheniramine maleat memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada λ 265 nm ( = 302) dan serapan maksimum dalam larutan basa pada λ 262 nm ( = 205), dextromethorpan HBr memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada λ 278 nm ( = 70). Penetapan kadar secara simultan dari dua atau lebih kombinasi obat dilakukan menggunakan metode kromatografi dan elektroforesis yang memerlukan biaya besar dan waktu yang cukup lama, sehingga kurang sesuai untuk kontrol kualitas secara rutin (Ni et al., 2006). Dengan semakin banyak dan beragamnya produk farmasi kombinasi ini, maka menjadi suatu tantangan untuk mengembangkan metode analisis yang sederhana, cepat dan tidak memerlukan biaya besar serta meminimalkan penggunaan reagen yang berbahaya bagi kesehatan analis. Saat ini dengan berkembangnya perangkat lunak komputer terutama analisis multivariat, spektrofotometri UV/Vis telah banyak digunakan untuk menganalisis campuran beberapa senyawa obat secara simultan (de Luca et al, 2009). Spektrofotometri UV/Vis yang digabungkan dengan kemometrika merupakan metode yang sangat baik untuk menganalisis senyawa campuran multikomponen tanpa proses pemisahan (Miller and Miller, 2010). Metode spektrofotometri memiliki keuntungan antara lain dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam jumlah kecil, pengerjaannya mudah, sederhana, cukup sensitive, selektif, biayanya relatif murah dan mempunyai kepekaan analisis yang cukup tinggi (Munson, 1991).

29 3 Pada penetapan kadar campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr secara spektrofotometri ultraviolet yang menjadi kendala adalah terjadinya tumpang tindih (overlapping) spektrum ketiga senyawa tersebut, yang mana ketiga senyawa ini memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang yang berdekatan (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Berdasarkan hal tersebut, peneliti tertarik untuk memeriksa kadar guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr dengan metode spektrofotmetri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat. 1. Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang sudah diuraikan di atas, maka permasalahan yang muncul adalah : a. Bagaimana validasi spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat untuk analisis campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr dalam sediaan tablet tanpa tahap pemisahan? b. Bagaimana aplikasi spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat untuk penetapan kadar guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr dalam sediaan tablet?

30 4 2. Keaslian Penelitian Hasil penelusuran publikasi-publikasi ilmiah menunjukkan bahwa analisis campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr secara simultan dalam sediaan farmasi secara spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat belum pernah dilaporkan. Berikut adalah beberapa penelitian yang sukses dengan spektrofotometri ultraviolet dan kemometrika. Khoshayand et al. (2008) telah sukses menetapkan kandungan parasetamol, ibuprofen dan kafein dalam sediaan farmasi kapsul secara bersama-sama menggunakan spektrofotometri ultraviolet yang dihubungkan dengan kemometrika kalibrasi multivariat PLS dan principal component-artificial neural network. Campuran tiga komponen yang terdiri atas parasetamol, fenileprin HCl dan klorfeniramin maleat juga telah dianalisis dengan spektrofotometri ultraviolet dengan kombinasi kalibrasi multivariat PLS dan PCR tanpa pemisahan terlebih dahulu, pada kisaran 1-15 ppm. Validasi dilakukan dengan validasi silang. Prosedur yang dikembangkan ini sukses diaplikasikan untuk analisis ketiga kompponen dalam sediaan farmasi tablet (Samadi-Maybodi and Nejad-Darzi, 2010). 3. Manfaat Penelitian a. Manfaat Metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif metode analisis untuk menetapkan kadar guaifenesin, chlorpheniramine maleat

31 5 dan dextromethorpan HBr dalam sediaan farmasi yang memenuhi persyaratan validitas yang baik. b. Manfaat Teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi ilmiah mengenai validasi metode penetapan kadar guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr dalam sediaan farmasi secara spektrofotometri ultraviolet. c. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk menetapkan kadar campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr dalam sediaan farmasi yang banyak beredar di pasaran. B. Tujuan Penelitian a. Melakukan validasi spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat untuk analisis campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr dalam sediaan tablet. b. Untuk mengetahui apakah spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr dalam sediaan tablet.

32 BAB II DASAR TEORI A. Guaifenesin Guaifenesin (Gambar 1) memiliki absorbansi pada panjang gelombang 273 nm dalam pelarut asam dengan nilai = 125 (Moffat, 2011). Guaifenesin (C 10 H 14 O 4 ) memiliki berat molekul 198,2. Guaifenesin mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 102,0% C 10 H 14 O 4, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Pemerian guaifenesin berupa serbuk hablur, putih sampai agak kelabu, bau khas lemah dan memiliki rasa pahit. Guaifenesin larut dalam air, etanol, kloroform dan dalam propilen glikol, agak sukar larut dalam gliserin (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Gambar 1. Struktur Guaifenesin 6

33 7 B. Chlorpheniramine Maleat Chlorpheniramine maleat (Gambar 2) memiliki absorbansi pada panjang gelombang 265 nm dalam pelarut asam dengan nilai = 302 dan pada λ 262 nm pada pelarut basa dengan nilai = 205 (Moffat, 2011). Chlorpheniramine maleat (C 16 H 19 ClN 2.C 4 H 4 O 4 ) memiliki berat molekul 390,87. Chlorpheniramine maleat mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 100,5% C 16 H 19 ClN 2.C 4 H 4 O 4, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Pemerian chlorpheniramine maleat berupa serbuk hablur putih; tidak berbau. Kelarutan sangat mudah larut dalam air, larut dalam etanol, dan dalam kloroform, sukar larut dalam eter dan dalam benzene (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Gambar 2. Struktur Chlorpheniramine Maleat C. Dextromethorpan HBr Dextromethorpan HBr (Gambar 3) memiliki absorbansi pada panjang gelombang 278 nm dalam pelarut asam dengan nilai = 70 (Moffat, 2011).

34 8 Dextromethorpan HBr (C 18 H 25 NO.HBr) memiliki berat molekul 352,31. Dextromethorpan HBr mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 102,0 % C 18 H 25 NO.HBr, dihitung sebagai anhidrat (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Pemerian dextromethorpan HBr berupa hablur hampir putih atau serbuk hablur. Melebur pada suhu 126 C disertai peruraian. Kelarutan agak sukar larut dalam air, mudah larut dalam etanol dan dalam kloroform, tidak larut dalam eter (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Gambar 3. Struktur Dextromethorpan HBr D. Spektrofotometri Ultraviolet Spektrofotometri ultraviolet adalah teknik analisis yang digunakan dengan cara mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi panjang gelombang pada nm. Pada analisis menggunakan spektrofotometri ultraviolet, dilakukan pembacaan absorbansi (penyerapan) atau transmitansi (penerusan) radiasi elektromagnetik oleh suatu

35 9 molekul. Hasil pembacaan absorbansi disebut sebagai absorban (A) dan tidak memiliki satuan %T (Mulja dan Suharman, 1995). Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat ( nm) dan sinar tampak ( nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri ultraviolet melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak digunakan untuk analisis kuantitatif dibandingkan dengan analisis kualitatif (Mulja dan Suharman, 1995). Sinar ultraviolet memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi elektronik. Keadaan paling rendah disebut keadaan dasar (ground state). Transisitransisi elektronik akan meningkatkan energi molekular dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi. Jika molekul dikenakan radiasi elektromagnetik maka molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai dan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi, yang disebut orbital elektron anti ikatan (Gandjar dan Rohman, 2007). a. Instrumentasi Spektrofotometer Ultraviolet Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum ultraviolet dan sinar tampak terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang nm. Komponen-komponennya meliputi sumber-sumber sinar, monokromator, dan sistem optik (Gandjar dan Rohman, 2007).

36 10 i. Sumber Lampu : lampu deuterium digunakan untuk daerah ultraviolet pada panjang gelombang dari nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (pada daerah panjang gelombang antara nm). ii. Monokromator : digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam komponenkomponen panjang gelombangnya yang selanjutnya dipilih oleh celah (slit). Monokromator berputar sedemikian rupa sehingga kisaran panjang gelombang dilewatkan pada sampel sebagai scan instrumen melewati spektrum. iii. Optik optik: dapat dirancang untuk memecah sumber sinar sehingga sumber sinar melewati 2 kompartemen, dan sebagaimana dalam spektrofotometer berkas ganda (double beam), suatu larutan blanko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk mengkoreksi pembacaan atau spektrum sampel. Larutan yang paling sering digunakan sebagai blanko dalam spektrofotometri adalah semua pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi (Gandjar dan Rohman, 2007). Dilihat dari sistem optik spektrofotometer dapat dibagi menjadi 2 jenis : 1. Spektrofotometer berkas tunggal (single beam) Spektrofotometer berkas tunggal (single beam) melakukan pengukuran absorbansi dengan cara cahaya melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai absorbansi dari larutan yang dimasukkan. Keuntungan spektrofotometer berkas tunggal lebih sederhana dan lebih murah dibandingkan spektrofotometer

37 11 berkas ganda (double beam). Kelemahannya adalah tidak dapat mengoreksi perubahan respon absorbansi akibat turbiditas sampel atau perbedaan intensitas cahaya baik dari sumber radiasi maupun dari pengaruh luar. 2. Spektrofotometer berkas ganda (double beam) Spektrofotometer double beam merupakan alat pengembangan dari spektrofotometer single beam karena keterbatasan yang dimiliki oleh spektrofotometer single beam. Spektrofotometer double beam memiliki dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin yang digunakan untuk memecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blanko dan sinar kedua melewati sampel. Dengan dilakukannya sistem ini maka spektrofotometer double beam dapat mengkoreksi perubahan respon absorbansi akibat perbedaan intensitas cahaya, fluktuasi pada kelistrikan instrumen dan absorbansi blanko (Haven dkk, 1994). Secara umum ada tiga macam distribusi elektron didalam suatu senyawa organik yang selanjutnya dikenal sebagai orbital elektron pi (π), sigma (σ), dan elektron tidak berpasangan (n). Apabila pada molekul tersebut dikenakan radiasi elektromagnetik maka akan terjadi eksitasi elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron anti bonding (Mulja dan Suharman, 1995). Suatu molekul dapat menyerap radiasi elektromagnetik bila mempunyai kromofor dan auksokrom. Kromofor adalah bagian yang mengabsorpsi dalam daerah ultraviolet dan daerah sinar tampak (Gearien, 1969). Sedangkan auksokrom sendiri tidak

38 12 dapat menyerap radiasi, tetapi keberadaannya dalam molekul dapat mempertinggi absorpsi kromofor atau menggeser absorpsi panjang gelombang serapan bila terikat pada kromofor. Elektron elektron tidak berikatan (n) pada auksokrom dapat berinteraksi dengan elektron electron µ kromofor (Christian, 2004). Ada empat macam pergeseran yang disebabkan oleh auksokrom yaitu pergeseran batokromik, pergeseran hipsokromik, pergeseran hiperkromik dan hipokromik (Sastrohamidjojo, 2001). Pergeseran batokromik adalah pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang lebih panjang, disebabkan substitusi atau pengarah pelarut. Pergeseran ini disebut juga pergeseran merah atau red shift (Connors, 1982). Pergeseran hipsokromik adalah pergeseran ke arah panjang gelombang yang lebih pendek disebabkan substitusi atau pengarah pelarut, misalnya dari pelarut nonpolar ke pelarut polar (Sastrohamidjojo, 2001). Hiperkromik adalah kenaikan intensitas serapan disebabkan oleh perubahan struktur atau medium, sedangkan hipokromik adalah penurunan intensitas serapan (Connors, 1982). b. Hukum Lambert Beer Menurut hukum Lambert, absorbansi berbanding lurus terhadap ketebalan kuvet yang disinari. Menurut hukum Beer, hanya berlaku untuk cahaya monokromatik dan larutan yang sangat encer, absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu dalam hukum Lambert Beer, sehingga diperoleh bahwa absorbansi berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan kuvet, yang dapat ditulis dalam persamaan :

39 13 Log Io/It = A = ɛ.b.c Keterangan: Io : intensitas radiasi yang masuk It A ɛ b c : intensitas radiasi yang ditransmisikan : absorbansi : konstanta koefisien molar ekstingsi : ketebalan kuvet yang dinyatakan dalam cm : konsentrasi analit (mol.l-1) Absorbansi adalah jumlah cahaya yang diabsorpsi oleh larutan sampel yang diukur. Konstanta koefisien molar ekstingsi merupakan absorbansi analit dalam larutan dengan konsentrasi 1Molar. Pada produk farmasi, konsentrasi atau jumlah sering dinyatakan dalam gram atau miligram dibandingkan dengan mol. Oleh karena itu pada analisis produk farmasi Hukum Lambert-Beer sering dituliskan dengan persamaan berikut: ɛ = A (1%,1cm).b.c Keterangan: :absorbansi sampel dengan konsentrasi 1% (b/v) dengan ketebalan kuvet 1 cm b c :ketebalan kuvet yang dinyatakan dalam cm :konsentrasi sampel yang dinyatakan dalam g/100 ml Monografi dalam British Pharmacope (BP) selalu menulis untuk baku pembanding atau standar yang dapat digunakan untuk uji kuantifikasi (Watson, 2003).

40 14 Aspek penggunaan spektrofotometri UV dalam analisis kualitatif dilihat dari parameter panjang gelombang maksimum, intensitas, nilai absortivitas molar dan nilai absortivitas yang spesifik untuk senyawa yang dilarutkan dalam pelarut tertentu. Aspek dalam analisis kuantitatif terjadi ketika sampel dikenakan suatu radiasi, dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Analisis kuantitatif juga dilakukan dengan menggunakan metode regresi yaitu dengan menggunakan persamaan garis regresi yang didasarkan pada nilai absorbansi dan konsentrasi baku yang dibuat dalam beberapa konsentrasi. Pada pengukuran absorbansi senyawa, digunakan panjang gelombang maksimum untuk mendapatkan absorbansi yang maksimum (Mulja dan Suharman, 1995). E. Analisis Multikomponen secara Spektrofotometri UV Apabila dua atau lebih komponen mempunyai absorbansi pada panjang gelombang yang sama dan keduanya tidak saling bergantung satu sama lain maka pengukuran spektrofotometri memberikan harga penjumlahan absorbansi dari setiap komponen (Swarbrick, 1997). Prinsip tersebut dapat digunakan dalam analisis multikomponen dengan cara mencari absorban atau beda absorban tiap-tiap komponen yang akan memberikan korelasi yang linier terhadap konsentrasi, sehingga akan dapat dihitung masing-masing kadar campuran tersebut secara serentak atau salah satu komponen dalam campurannya dengan komponen yang lainnya (Mulja dan Suharman, 1995). Menurut Day and Underwood (1980), ada tiga kemungkinan profil spektrum absorpsi yang dihasilkan dari dua komponen campuran yaitu:

41 15 1. Kemungkinan pertama, spektra tanpa tumpang tindih atau sekurangnya dimungkinkan untuk menemukan suatu panjang gelombang yang mana x menyerap dan y tidak, serta panjang gelombang serupa untuk mengukur y. Konstituen x dan y diukur masing masing pada panjang gelombang λ 1 dan λ 2. Gambar 4. Spektrum absorpsi pada panjang gelombang masing masing komponen tidak saling tumpang tindih (Day dan Underwood, 1980) 2. Kemungkinan kedua, spektra tumpang tindih satu arah, y tidak menganggu pengukuran x pada λ 1, tetapi x menyerap cukup banyak bersama sama y pada λ 2. Konsentrasi x ditetapkan dan absorbansi larutan pada λ 1. Absorbansi yang diberikan oleh konsentrasi x pada λ 2 dihitung pada absorptivitas molar x pada λ 2. Absorbansi ini dikurangkan dari absorbansi terukur larutan pada λ 2 sehingga akan diperoleh absorbansi yang disebabkan oleh y, konsentrasi y dapat diukur dengan cara yang lazim.

42 16 Gambar 5. Spektrum absorpsi tumpang tindih satu arah (Day dan Underwood, 1980) 3. Kemungkinan ketiga, spektra tumpang tindih dua arah. Bila tidak ditemukan panjang gelombang yang mana x atau y menyerap secara eksklusif, maka perlu memecahkan dua persamaan serempak dengan dua derivative. Analisis kuantitatif jenis ini dapat dilakukan dengan aplikasi metode panjang gelombang berganda atau derivative. A 1 = ɛ x1 b C x + ɛ y1 b C y A 2 = ɛ x2 b C x + ɛ y2 b C y Yang mana : A 1 = serapan terukur pada λ 1 A 2 = serapan terukur pada λ 2 ɛ x1 = daya serap molar pada ɛ y1 = daya serap molar pada ɛ x2 = daya serap molar ɛ y2 = daya serap molar pada

43 17 C x = konsentrasi (mol/l) pada x C Y = konsentrasi (mol/l pada y b = tebal sel Gambar 6. Spektrum absorpsi tumpang tindih dua arah (Day dan Underwood, 1980) F. Kemometrika Kemometrika adalah ilmu kimia yang menggunakan matematika dan metode statistik untuk memperoleh informasi yang optimal pada suatu sistem. Secara umum, kemometrika mengungkap bahwa ada korelasi antara data yang terukur dengan konsentrasi komponen. Berbagai metode kemometrika telah dikenalkan dan digunakan secara luas dalam bidang analisis obat seperti kalibrasi multivariat dan analisis pengelompokkan seperti principle component analysis dan discriminant analysis (Massart and Buydens, 1988). Salah satu metode kemometrika adalah teknik kalibrasi multivariat. Kalibrasi multivariat adalah kumpulan teknik matematika

44 18 yang kuat yang dapat diterapkan untuk mengatasi kompleksitas dalam kimia analisis. Kalibrasi multivariat berguna dalam analisis spektra karena penjumlahan intensitas spektra yang muncul secara simultan dapat memperbaiki presisi dan dapat digunakan untuk analisis kuantitatif campuran multikomponen yang tidak dapat diselesaikan dengan metode spektrofotometri konvensional (Sohrabi et al, 2009). Kalibrasi multivariat merupakan teknik yang paling sering digunakan terutama untuk analisis multi-komponen (Miller and Miller, 2005). Diantara jenis kalibrasi multivariat, teknik kalibrasi classical least squares (CLS), stepwise multiple linear regression (SMLR), principle component regression (PCR) dan partial least squares (PLS) merupakan jenis yang paling sering digunakan. Aplikasi kemometrik pada data spektroskopi adalah: Kalibrasi classical least squares (CLS) didasarkan pada hukum Beer dengan absorbansi pada setiap panjang gelombang proporsional terhadap konsentrasi komponen. Kalibrasi principle component regression (PCR) dan partial least squares (PLS) termasuk jenis Inverse Least square (ILS) (Rohman, 2012). Metode kalibrasi multivariat yang paling banyak digunakan dalam analisis farmasi terutama model analisis instrumental (spektroskopi ultraviolet dan inframerah) adalah principal component regression (PCR), stepwise multiple linear regression (SMLR), dan partial least square (PLS) (Rohman, 2012; Ragno et al.,2004; El Gindy et al., 2006). PLS berpotensi tinggi dalam metodologi kalibrasiprediksi untuk memproses sinyal absorbansi obat (Ghasemi and Vosough, 2002;

45 19 Rohman et al., 2013). PLS memiliki beberapa keunggulan yaitu menggunakan semua data spektral penuh untuk pemisahan campuran multikomponen, prosedur analitis dapat dilakukan dalam waktu singkat, biasanya tanpa pemisahan fisik, dan model kalibrasinya hanya mengolah konsentrasi analit yang diinginkan (Escandar et al, 2006). PLS mampu memprediksi secara lebih baik daripada PCR ketika ada baseline linier yang acak dan atau spektral komponen utama yang tumpang tindih (Sohrabi et al., 2009). Dalam PLS, variabel yang menunjukkan korelasi tinggi dengan variabel respon lebih dipilih karena lebih efektif untuk memprediksi. Kombinasi linier variabel prediktor dipilih dari yang memiliki korelasi tinggi dengan variabel respon dan dapat menjelaskan variasi dalam variabel prediktor (Miller and Miller, 2010). Kalibrasi PCR dan PLS dilakukan dalam 3 tahap yaitu: (1) kalibrasi; (2) validasi; dan (3) analisis sampel yang tidak diketahui (Osborne et al., 1997). Secara umum, kalibrasi multivariat mempunyai tahap kalibrasi yang diikuti validasi (dengan validasi sampel secara terpisah atau dengan validasi silang tengan teknik leave one out) dan tahap prediksi (sampel baru). Jika hasil tahap kalibrasi dan validasi yang digunakan memenuhi kriteria (korelasi yang tinggi, kesalahan yang kecil) maka model yang dikembangkan selanjutnya digunakan untuk mengestimasi konsentrasi campuran dari sampel yang belum diketahui konsentrasinya.

46 20 Kalibrasi PLS dievaluasi dengan menggunakan root mean square error of calibration (RMSEC) dan koefisien detreminasi (R 2 ). Selanjutnya model PLS diujisilangkan menggunakan teknik leave one out. Dalam teknik ini, salah satu sampel kalibrasi dikeluarkan dari model PLS dan sisa sampel yang ada digunakan untuk pemodelan dengan PLS. sampel yang dihilangkan selanjutnya dihitung dengan model PLS baru yang dikembangkan. Prosedur tersebut dilakukan berulang kali, menghilangkan satu demi satu sampel kalibrasi hingga didapatkan harga R 2 yang sesuai dengan yang diinginkan (Rohman and CheMan, 2011). G. Validasi Metode Analisis a. Pengertian dan alasan validasi metode analisis Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter-parameter tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter itu tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Validasi merupakan suatu persyaratan dasar untuk menjamin kualitas dan kehandalan hasil dari semua aplikasi metode analisis (Ermer and Miller, 2005). Menurut United States Pharmacopeia (USP), validasi metode analisis dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis adalah akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Secara singkat, validasi merupakan aksi konformasi bahwa metode analisis yang akan digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan. Sementara itu menurut ISO 17025: (2005),

47 21 validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi. Suatu metode analisis harus divalidasi jika: (1) Merupakan metode tidak baku, misalnya dari diktat, buku teks dan jurnal yang belum diakui secara luas; (2) berupa metode yang dikembangkan oleh laboratorium; (3) metode standar yang digunakan di luar ruang lingkupnya; (4) perubahan sekecil apapun dari metode standar, misalnya perubahan prosedur dan perubahan volume reagensia; (5) gabungan dari dua atau lebih metode standar; dan (6) gabungan antara metode standar dan metode bukan standar (ISO 17025, 2005). b. Parameter dan kategori validasi metode analisis ISO/IEC 17025: 2005 yang menjadi standar internasional bagi laboratorium pengujian dan laboratorium kalibrasi mempersyaratkan beberapa parameter uji yang harus dilakukan dalam validasi metode analisis. USP dan ICH membagi parameter uji dalam validasi metode analisis dalam beberapa langkah yang sedikit berbeda. Parameter dalam validasi metode yang dipersyaratkan oleh ketiga aturan tersebut dapat digambarkan dalam Tabel 1 di bawah ini.

48 22 Tabel 1. Karakteristik validasi metode analisis menurut ISO/IEC 17025, USP dan ICH Presisi Akurasi Parameter Uji Batas Deteksi (LOD ) Batas Kuantifikasi (LOQ) ISO/IEC 17025:2005 Spesifitas - USP Selektivitas - - Linearitas Rentang Ukur Ketahanan (Robustness) Kesesuaian system - Ketidakpastian hasil - - Sensitivitas silang terhadap gangguan dari matrik ICH Presisi Presisi suatu prosedur analisis menunjukkan kedekatan nilai (derajat penyebaran) antara serangkaian pengukuran yang dilakukan dari proses sampling ganda (multiple sampling) dari sekumpulan sampel homogen dengan kondisi yang telah ditentukan. Presisi dapat dipertimbangkan dalam tiga tingkatan, yaitu: keterulangan (repeatibility), intermediate precision, dan reproduciblity. Presisi seringkali diekspresikan dengan simpangan baku (SD) atau simpangan baku relatif (RSD) dari serangkaian data. Perhitungan RSD dapat digunakan rumus: RSD = x 100%

49 23 Keterangan: SD = simpangan baku serangkaian data = Rata rata data (Gandjar dan Rohman, 2007). Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang untuk kadar analit 100%. Kriteria tersebut sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Tabel 2. Kriteria penerimaan nilai RSD Analit (%) Fraksi analit Konsentrasi analit Nilai RSD (%) % % 2, % 4 0, ,1% 5,7 0, ppm 8 0, ppm 11,3 0, ppm 16 0, ppb 22,6 0, ppb 32 0, ppb 45,3 (Horwitz cit. Gonzales, Herrador, and Asuero, 2010) 2. Akurasi Akurasi suatu prosedur analisis menunjukkan kedekatan penerimaan antara hasil yang diterima sebagai nilai konvensional yang sebenarnya atau hasil referensi yang diterima dengan hasil yang ditemukan (Emer and Miller, 2005). ICH (International Conference on Harmonisation) merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 kosentrasi yang berbeda (misal 3 level konsentrasi dengan masing-masing 3 replikasi) untuk

50 24 mendokumentasikan akurasi. Data akurasi dilaporkan dalam nilai persen perolehan kembali (Gandjar dan Rohman, 2007). Persen perolehan kembali seharusnya tidak melebihi nilai presisi RSD. Rentang kesalahan yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit pada matriks dapat dilihat pada Tabel 3 dibawah ini. Tabel 3. Kriteria penerimaan nilai % recovery Analit (%) Fraksi analit Konsentrasi analit Rentang recovery % % % , ,1% , ppm , ppm , ppm , ppb , ppb , ppb (AOAC cit.gonzales and Herrador, 2007) 3. Linieritas Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasilhasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbedabeda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasinya (Gandjar dan Rohman, 2007).

51 25 Linieritas sebaiknya dievaluasi secara visual dengan merajahkan respon analit sebagai fungsi konsentrasi analit atau komponen. Untuk pengukuran linieritas, dianjurkan minimal untuk 5 konsentrasi larutan (Anonim,2004). Syarat suatu metode dikatakan memiliki lineritas yang baik apabila memiliki nilai koefisien korelasi (r) 0,999, terutama untuk pendapatan kadar senyawa tunggal (Snyder et al., 1997). 4. Kisaran (range) Kisaran suatu metode didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi, dan linieritas yang mencukupi. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode dan kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama (mayor), maka konsentrasi baku harus di dekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang diharapkan (Gandjar dan Rohman,2007). 5. Batas Deteksi (limit of detection) Batas deteksi didefinisikan sebagai kadar analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Pada metode kromatografi, batas deteksi dapat ditunjukkan penyuntikkan analit yang menghasilkan tinggi puncak setidaknya 2 sampai 3 kali tinggi derau (signal to noise ratio = 3 : 1) (Huber, 2007).

52 26 6. Batas Kuantifikasi (limit of quantification) Batas kuantifikasi adalah kadar analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Penentuan batas kuantifikasi dapat dilakukan dengan mengukur tinggi puncak setidaknya 10 sampai 20 kali tinggi derau (signal to noise ratio = 10:1) (Huber, 2007). 7. Ketahanan ( Robustness ) Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Evaluasi ketahanan metode biasanya dilakukan dengan variasi ph, laju air, suhu kolom, volume penyuntikan atau komposisi fase gerak (Huber, 2007). Baik USP maupun ICH telah memperkenalkan bahwa tidak selamanya parameter untuk mengevaluasi validasi metode harus diuji. USP membagi metodemetode analisis ke dalam kategori-kategori yang terpisah, yaitu : 1. Penentuan kuantiatif komponen-komponen utama bahan aktif 2. Penentuan pengotor (impurities) atau produk-produk hasil degradasi 3. Penentuan karakteristik-karakteristik 4. Pengujian identifikasi Untuk mengetahui elemen elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi menurut USP dapat dilihat pada Tabel 4.

53 27 Tabel 4. Elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi menurut USP Parameter Kineja Pengujian Uji Kategori II Uji Kategori Analisis kategori I Kuantitatif Uji Batas III Akurasi Ya Ya * * Presisi Ya Ya Tidak Ya Spesifisitas Ya Ya Ya * LOD Tidak Tidak Ya * LOQ Tidak Ya Tidak * Linearitas Ya Ya Tidak * Kisaran ( range ) Ya Ya * * Ruggedness Ya Ya Ya Ya Keterangan : *mungkin dibutuhkan, tergantung pada uji spesifiknya. c. Validasi metode kalibrasi multivariat Danzer et al. (2004) menuliskan bahwa kalibrasi dalam analisis kimia mengacu pada hubungan antara jumlah atau kadar sampel X = dan fungsi terukur Y = yang dapat berupa spektrum, kromatogram atau yang lain. Kehandalan analisis multikomponen harus divalidasi sesuai dengan kriteria yang umum yaitu selektivitas, akurasi, presisi, interval kepercayaan dan interval prediksi, selanjutnya dapat dihitung nilai kritis multivariat dan batas deteksi. Dalam kalibrasi multivariat, harus dihindari ko-linearitas variabel yang disebabkan oleh konsentrasi sampel kalibrasi.

54 28 1. Selektivitas Secara umum, selektivitas sistem multikomponen dapat ditetapkan secara kualitatif dan kuantitatif. Dalam kalibrasi multivariat, selektivitas biasanya dihitung dengan condition number. Namun condition number tidak memperhitungkan kadar masing-masing komponen dan hanya memberikan batasan besarnya kesalahan yang diperbolehkan. 2. Presisi Ketidakpastian kalibrasi dan prediksi kadar yang tidak diketahui dihitung dengan standard error of calibration (SEC) dan standard error of prediction (SEP). Parameter lain untuk mengukur presisi kalibrasi multivariat adalah nilai predictive residual error sum of squares (PRESS). PRESS dihitung seperti menghitung SEP dengan menggunakan sampel validasi. 3. Akurasi Ada tidaknya suatu kesalahan sistematik dapat diketahui dari fungsi recovery. Kadar yang diprediksi model (ĉ) dibandingkan dengan kadar aktual sampel validasi ( c ) dengan persmaan regresi sebagai berikut: Ĉ = α + βc Koefisien regresi ideal jika nilai α = 0 dan β = 1

55 29 H. Landasan Teori Dalam sediaan obat sering digunakan campuran zat aktif untuk memperoleh efek terapeutik yang lebih baik. Salah satunya adalah campuran guaifenesin, pseudoefedrine HCl dan dextromethorphan HBr. Sifat kelarutan dari ketiga zat aktif tersebut mirip. Guaifenesin larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut didalam etanol. Chlorpheniramine maleat sangat mudah larut dalam air, mudah larut dalam etanol, agak sukar larut dalam kloroform. Dextromethorphan HBr agak sukar larut dalam air, mudah larut dalam etanol dan dalam kloroform, tidak larut dalam eter. Guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr masing-masing dapat ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometri ultraviolet. Guaifenesin memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada λ 245 nm dan serapan maksimum dalam larutan basa pada λ 257 nm, Chlorpheniramine maleat memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada λ 251 dan 257 nm, dextromethorpan HBr memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada 278 nm. Dengan adanya serapan maksimum pada panjang gelombang yang berdekatan tersebut menyebabkan spektrum serapan ketiga senyawa tumpang tindih. Metode spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kemometrika dapat digunakan sebagai alat analisis untuk ketiga senyawa yang tumpang tindih tersebut.

56 30 I. Hipotesis 1. Spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat dapat digunakan untuk analisis campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr dalam sediaan tablet. 2. Spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan teknik kalibrasi multivariat dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr dalam sediaan tablet.

57 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif. B. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Variabel bebas dari penelitian ini adalah kadar senyawa guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr. 2. Variabel Tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah absorbansi masing-masing senyawa yang diberikan dari spekroskopi UV. 3. Variabel Pengacau a. Variabel pengacau Terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian bahan baku, kualitas pelarut yang digunakan, pengotor dari alat gelas. b. Variabel Pengacau Tak Terkendali Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kontaminasi dari luar, kondisi alat yang digunakan. 31

58 32 C. Definisi Operasional 1. Spektrofotometer yang digunakan merupakan seperangkat alat spektrofotometer UV merk Shimadzu UV-1800 yang dihubungkan dengan seperangkat computer merk Advance dan printer merk Hp. 2. Absorbansi yang diukur merupakan absorbansi guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr. 3. Campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr yang digunakan memiliki komposisi 33,3 : 2 : 1. D. Bahan Penelitian Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku guaifenesin, chlorpheniramine maleat (PT Konimex) dan dextromethorpan HBr (PT Combiphar), sediaan tablet yang mengandung, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr, etanol 95% pro analysis (E. Merck), kertas saring, dan akuades. E. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi spektrofotometer ultraviolet merek Shimadzu UV-1800, kuvet kuarsa merek Hellma, neraca analitik merek Ohaus tipe PAJ1003 dengan kepekaan 0,1 mg (maksimal 120 gram, minimal 0,001 gram), mikro pipet skala µl merk Socorex dan seperangkat alat-alat gelas yang umum digunakan di laboratorium.

59 33 1. Penyiapan Larutan Standar F. Tata Cara Penelitian Larutan standar kerja disiapkan setiap kali melakukan analisis dalam kisaran kalibrasi linier dengan mengencerkan larutan stok pada setiap zat aktif. Larutan standar disiapkan dalam 2 set: kalibrasi sebanyak 20 larutan sampel dan 10 larutan sampel untuk validasi. Konsentrasi larutan ditentukan secara random. Setiap larutan disiapkan dalam labu takar 10 ml. Sejumlah tertentu guaifenesin, asetosal, dan kafein dalam kisaran kalibrasi dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml kemudian ditambahkan etanol hingga tanda batas. Spektra uv larutan tersebut direkam pada rentang panjang gelombang nm. Untuk menyiapkan sampel kalibrasi dan validasi digunakan kombinasi sebagaimana dalam Tabel 5 dan Tabel 6 berikut: Tabel 5. Komposisi campuran sintetik guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr untuk kalibrasi No. Guaifenesin Chlorpheniramine maleat Dextromethorphan HBr 1 20,6 1,5 4,0 2 24,0 1,2 4,8 3 22,4 2,0 3,8 4 17,2 1,8 4,2 5 19,6 2,4 2,1 6 21,6 3,6 2,7 7 27,0 1,0 3,6 8 23,0 3,8 2,0 9 24,4 1,4 3, ,6 3,7 5, ,6 3,5 3, ,0 2,6 2, ,0 2,8 3, ,0 1,6 4, ,4 3,4 5, ,0 2,5 2, ,6 3,0 4, ,0 2,2 3, ,6 3,2 2, ,0 2,8 2,5

60 34 Tabel 6. Komposisi campuran sintetik guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorpan HBr untuk validasi No. Guaifenesin Chlorpheniramine maleat Dextromethorphan HBr 1 17,0 2,0 0,5 2 18,6 4,6 2,8 3 20,8 3,0 1,0 4 17,5 5,2 1,8 5 18,0 4,0 2,0 6 21,6 2,8 2,4 7 21,0 5,0 3,0 8 19,0 3,4 3,5 9 19,5 6,0 1, ,0 6,5 0,8 2. Uji Keseragaman Bobot Sejumlah 20 sediaan tablet, dihitung bobot rata-rata tiap tablet. Sediaan tablet memenuhi syarat apabila ditimbang satu per satu, tidak ada lebih dari 2 tablet yang menyimpang dari bobot rata-rata lebih besar dari 5% dan tidak ada satu tablet pun yang bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata lebih dari 10% (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). 3. Penyiapan Larutan Sampel Sebanyak 20 tablet yang telah diuji keseragaman bobot diserbukkan dan dihomogenkan dalam mortir. Sejumlah tertentu serbuk yang setara dengan satu tablet ditimbang dan dilarutkan dengan etanol. Larutan disaring ke dalam labu takar 100 ml dengan kertas saring kemudian ditambahkan etanol hingga tanda batas. Larutan ini merupakan larutan stok sampel untuk dianalisis menggunakan spektrofotometer ultraviolet dengan aplikasi kemometrika.

61 35 4. Analisis Statistik dan Pengolahan Data Analisis kalibrasi multivariat dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Minitab 17 (trial). Kertas kerja perangkat lunak Excel 2010 digunakan untuk menentukan konsentrasi secara random masing-masing zat aktif dan untuk menghubungkan antara konsentrasi sebenarnya dan konsentrasi yang ditemukan atau terprediksi.

62 BAB IV HASIL & PEMBAHASAN Metode spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat belum berhasil digunakan dalam melakukan penetapan kadar senyawa multikomponen guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat dalam sediaan tablet. Tahap awal dilakukan dengan pemodelan kalibarasi dari 20 senyawa sampel kalibrasi dan didapatkan hasil yaitu nilai koefisien determinasi (R 2 ) dan nilai root mean square of calibration (RMSEC) 0,9993 dan 0,130 µg/ml untuk guaifenesin, 0,9997 dan 0,027 µg/ml untuk dextromethorphan HBr dan 0,9976 dan 0,049 µg/ml untuk chlorpheniramine maleat, kemudian dilakukan validasi model kalibrasi multivariat PLS dan dihasilkan nilai PRESS untuk guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat masing masing adalah 37,93 µg/ml, 3,36 µg/ml dan 6,54 µg/ml, sedangkan untuk nilai RMSECV 1,377 µg/ml, 0,409 µg/ml dan 0,571 µg/ml. Nilai R 2 prediksi yang dihasilkan untuk masingmasing senyawa adalah 0,9214 untuk guaifenesin, 0,9169 untuk dextromethorphan HBr dan 0,6669 untuk chlorpheniramine maleat, kemudian dilakukan konfirmasi kebaikan model kalibrasi PLS dengan menggunakan validasi eksternal dan dihasilkan persamaan regresi untuk guaifenesin mempunyai nilai R 2 0,3862 dan nilai RMSEP 2,817 µg/ml untuk dextromethorphan HBr, nilai R 2 0,4677 dan nilai RMSEP 2,136 36

63 37 µg/ml, sedangkan untuk chlorpheniramine maleat nilai R 2 0,0003 dan nilai RMSEP 131,068 µg/ml. Melihat dari parameter yang dihasilkan dapat disimpulkan bahwa model ini belum sesuai digunakan untuk melakukan penetapan kadar dalam sampel sediaan farmasi senyawa campuran guifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat. A. Analisis guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat dengan menggunakan spektrofotometri ultraviolet Penelitian diawali dengan melakukan scanning masing-masing larutan baku guaifenesin, dextromethorphan HBr dan clorpheniramine maleat untuk mengetahui overlapping spektra masing-masing senyawa tersebut jika diukur dalam campuran. Pada tahap ini, dilakukan pengukuran absorbansi masing-masing senyawa tersebut dengan membuat konsentrasi 20 µg/ml pada tiap larutan. Pada pembuatan larutan baku untuk tiap-tiap guaifenesin, dextromethorphan HBr dan clorpheniramine maleat digunakan etanol pro analysis sebagai pelarut pada pembuatan larutan stok baku maupun pada pembuatan larutan stok sampel karena ketiga komponen tersebut mudah larut dalam pelarut etanol dan memberikan bentuk spektrum yang baik. Scanning ketiga senyawa dengan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang menunjukkan adanya overlapping yang tampak seperti pada gambar 7. Adanya overlapping tersebut menyebabkan analisis guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat secara spektrofotometri konvesional tanpa tahap pemisahan tidak dapat dilakukan. Analisis masing-masing

64 38 komponen dalam campuran yang mempunyai spektra overlapping hanya bisa diatasi dengan metode pemisahan secara kromatografi atau spektrofotometri yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat (Millier & Miller, 2010). Spektra UV camp guaifenesin, dextro dan ctm guaifenesin CTM Dextromethorphan HBr Gambar 7. Overlay spektra uv guaifenesin, chlorpheniramine maleat, dextromethorphan HBr dan campuran guaifenesin, chlorpheniramine maleat, dextromethorphan HBr pada konsentrasi 20 µg/ml. Sebelum dilakukan penelitian lebih lanjut dilakukan pengecekan profil spektra campuran sintetik baku dibandingkan dengan sampel sediaan farmasi pada konsentrasi yang sama. Hal ini dimaksudkan untuk mengecek apakah ada eksipien dalam sediaan yang turut memberikan serapan pada kisaran panjang gelombang tersebut. Dari gambar 8 terlihat bahwa antara spektra campuran baku guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat dengan spektra sampel sediaan farmasi mempunyai profil yang mirip sehingga bisa disimpulkan bahwa tidak ada eksipien yang mengganggu analisis.

65 39 Gambar 8. Overlay spektra uv campuran baku (guaifenesin, chlorpheniramine maleat, dextromethorphan HBr) dan sampel sedian farmasi yang mengandung guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr. B. Kalibrasi multivariat dengan menggunakan PLS Metode kalibrasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah PLS karena mampu memprediksi dengan cara yang lebih baik ketika ada spektra yang tumpang tindih, dan lebih efektif dalam memprediksi karena hanya menggunakan variabel yang paling berkorelasi terhadap variabel respon (Sohrabi et al., 2009; Miller & Miller, 2010), dan juga metode PLS mampu menggunakan informasi spektra dari daerah yang luas dan menghubungkan perubahan spektra terhadap konsentrasi komponen secara bersamaan dengan menghitung kontribusi spektra lain yang dapat mengganggu spektrum (Che Man et al., 2005). Ada tiga tahapan dalam analisis menggunakan regresi PLS, yaitu : pemodelan kalibrasi, validasi dan analisis sampel (Osborne, 1997). Pada tahap yang pertama yakni pemodelan kalibrasi, dilakukan pengukuran absorbansi dari 20 senyawa campuran baku guaifenesin, dextromethorphan HBr dan clorpheniramine maleat seperti yang tertera pada Tabel 5 yang diukur pada panjang

66 40 gelombang nm dengan interval 2 nm. Dilakukan pemilihan panjang gelombang dengan cara data absorbansi dari ketiga senyawa dimasukkan ke dalam program Minitab pada beberapa daerah panjang gelombang yang berbeda kemudian dipilih daerah panjang gelombang yang memberikan kolerasi paling dekat antara kadar prediksi dengan kadar sebenarnya/actual. Pemilihan panjang gelombang ini merupakan tahap yang penting karena akan menentukan kualitas analisis multikomponen. PLS dirancang sebagai metode yang semua spektranya dapat diolah secara komputasi sehingga pemilihan panjang gelombang sepertinya tidak diperlukan, tetapi pengukuran spektra pada panjang gelombang yang tidak informatif dalam model kalibrasi dapat menurunkan kinerja model (El Gindy et al, 2006). Gambar 9 berikut menunjukkan overlay spektra dari 20 campuran sintetik baku untuk model kalibrasi. Gambar 9. Overlay spektra uv campuran baku guaifenesin, dextromethorphan HBr dan clorpheniramine maleat. Setelah dilakukan pemilihan panjang gelombang, diperoleh panjang gelombang yang optimal untuk pemodelan yaitu dari nm untuk guaifenesin

67 41 dan dextromethorphan HBr dan nm untuk chlorpheniramine maleat. Kedua daerah tersebut dipilih karena ketiga komponen memberikan serapan pada panjang gelombang tersebut dan menghasilkan nilai recovery yang besar, yang dinyatakan dengan nilai koefisien determinasi (R 2 ) yang tinggi dan nilai root mean square of calibration (RMSEC) yang kecil yaitu 0,9993 dan 0,130 µg/ml untuk guaifenesin, 0,9997 dan 0,027 µg/ml untuk dextromethorphan HBr dan 0,9976 dan 0,049 µg/mluntuk chlorpheniramine maleat. Tabel 7. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi PLS dari 20sampel kalibrasi Konsentrasi (µg/ml) Guaifenesin Dextromethorpan HBr CTM aktual terhitung aktual terhitung aktual terhitung 1 10,0 10,0785 4,7 4, ,5 1, ,0 13,8272 0,9 0, ,8 0, ,2 16,9156 1,3 1, ,0 1, ,0 18,0575 2,6 2, ,8 1, ,6 19,4352 4,1 4, ,8 2, ,0 23,1471 1,0 0, ,6 3, ,6172 3,5 3, ,0 0, ,0 22,1408 3,8 3, ,8 3, ,0 24,0639 2,0 2, ,4 1,39952 No Camp ,8 26,8635 0,5 0, ,7 3, ,0 25,9076 3,0 2, ,5 3, ,0 17,9549 5,0 5, ,6 2, ,2 19,3628 2,2 2, ,4 2, ,4 24,3882 4,5 4, ,6 1, ,6 11,6907 1,5 1, ,4 3, ,2 17,0611 4,3 4, ,5 2, ,0 27,8230 2,8 2, ,0 2, ,4 12,4257 1,8 1, ,2 2, ,6 18,7380 4,0 4, ,2 3, ,8 20,9016 4,9 4, ,5 0,45304 Persamaan : Persamaan : Persamaan : y = 0,9993x + 0,0131 y = 0,9997x + 0,001 y = 0,9976x + 0,0057 R 2 = 0,9993 R 2 = 0,9997 R 2 = 0,9976 RMSEC = 0,130 RMSEC = 0,027 RMSEC = 0,049 µg/ml µg/ml µg/ml

68 42 Tabel 7 tersebut menunjukkan bahwa ketiga komponen tersebut memiliki nilai RMSEC yang mendekati 0 dan R 2 yang mendekati 1. Hal ini membuktikan bahwa model memiliki korelasi antara nilai aktual dengan nilai prediksi yang baik. Koefisien determinasi mencerminkan seberapa besar kemampuan variabel bebas dalam memprediksi varians variabel terikat. Parameter R 2 mempunyai nilai antara 0-1, yang mana nilai R 2 mendekati 1 menunjukkan bahwa kemampuan memprediksi semakin baik karena semua variasi variabel respon (absorbansi) dapat diterangkan oleh variabel prediktor sehingga nilai terprediksi mendekati nilai aktual (Minitab Statistical Glossary, 2010). RMSEC menunjukkan selisih kadar prediksi dengan kadar aktual sehingga jika nilai RMSEC nya semakin kecil maka model model tersebut dapat dikatakan semakin baik karena faktor kesalahannya semakin kecil (Pindyck and Rubinfeld, 1998). Adapun kurva hubungan antara nilai kadar terprediksi dan nilai aktual guaifenesin. dextromethorphan HBr dan Chlorpheniramine maleat dalam set kalibrasi dapat dilihat pada Gambar dan 12 berikut:

69 Calculated Response Calculated Response PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLS Response Plot (response is gg) 10 components Actual Response Gambar 10. Kurva hubungan antara kadar guaifenesin sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) guaifenesin dengan metode spektrofotometri uv-pls pada panjang λ nm 5 PLS Response Plot (response is dextro) 10 components Actual Response 4 5 Gambar 11. Kurva hubungan antara kadar dextromethorphan HBr sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) guaifenesin dengan metode spektrofotometri uv-pls pada λ nm

70 Calculated Response PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 44 4 PLS Response Plot (response is ctm) 10 components Actual Response 3 4 Gambar 12. Kurva hubungan antara kadar chlorpheniramine maleat sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) guaifenesin dengan metode spektrofotometri uv- PLS pada λ nm C. Validasi model kalibrasi multivariat PLS Salah satu kelemahan dari kalibrasi multivariat adalah dapat terjadi overfitting. Overfitting diartikan sebagai model yang tampak sempurna dengan nilai korelasi yang tinggi dan kesalahan yang kecil tetapi model ini tidak dapat memberikan hasil yang baik jika diterapkan pada data lain yang berbeda dari bahan atau sampel uji yang sama. Cara untuk mengatasi overfitting tersebut dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan melakukan validasi eksternal dan validasi internal (Faber and Rajko, 2007). Pada penelitian ini dilakukan dua macam validasi, validasi internal dengan metode validasi silang menggunakan teknik leave one out dan validasi eksternal dengan menyiapkan 10 campuran baku guaifenesin., dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat (set validasi) yang independen. Validasi silang dengan teknik leave one out dilakukan dengan cara mengeluarkan satu data dari set kalibrasi. kemudian sisa sampel digunakan untuk

71 45 membuat persamaan. Kemudian persamaan yang sudah dibuat tadi digunakan untuk menghitung kadar terprediksi dari data yang sudah dikeluarkan sebelumnya. prosedur ini dilakukan secara bergantian sampai semua sampel dari set kalibrasi dikeluarkan satu kali (Faber and Rajko, 2007). Selisih antara kadar prediksi dan kadar aktual dari setiap sampel dihitung. kemudian dihitung jumlah kuadrat dari selisih tadi yang disebut sebagai predicted residual error sum of squares (PRESS) yang merupakan salah satu indikator kebaikan model yang menggambarkan kemampuan prediksi. Semakin rendah nilai PRESS maka kemampuan model untuk memprediksi semakin baik (Rohman and Che Man, 2011). Root mean squared error cross validation (RMSECV) juga menggambarkan kemampuan prediksi. nilai RMSECV dapat ditentukan dari nilai PRESS, semakin kecil nilai RMSECV maka kemampuan model untuk memprediksi semakin baik (El-Gindy et al., 2006). Parameter RMSECV dihitung dengan menggunakan rumus: (El-Gindy et al., 2006). Dari validasi silang dapat juga ditentukan jumlah komponen yang mencirikan data. Pada penelitian ini didapatkan 3 komponen untuk guaifenesin, 8 komponen untuk dextromethorphan HBr dan 10 komponen untuk chlorpheniramine maleat. Semakin banyak persamaan spektra maka semakin sedikit jumlah komponen. sedangkan impurity dan noise akan menambah jumlah komponen (Brereton, 2000). Data dan parameter hasil validasi silang guaifenesin, dextromethorphan HBr dan

72 46 chlorpheniramine maleat dengan teknik leave one out dapat dilihat pada Gambar 13, 14 dan 15. Hasil seleksi model validasi silang untuk guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat masing-masing adalah untuk nilai PRESS 37,93 µg/ml, 3,36 µg/ml dan 6,54 µg/ml, sedangkan untuk nilai RMSECV 1,377 µg/ml. 0,409 µg/ml dan 0,571 µg/ml. Nilai R 2 prediksi menunjukkan korelasi antara kandungan nilai aktual dan nilai prediksi. Semakin tinggi nilai prediksi (mendekati 1) maka korelasi antara nilai aktual dan nilai prediksi semakin baik. Pada penelitian ini nilai R 2 prediksi yang dihasilkan untuk masing -masing senyawa adalah 0,9214 untuk guaifenesin, 0,9169 untuk dextromethorphan dan 0,6669 untuk chlorpheniramine maleat. Dari hasil tersebut dapat dilihat bahwa nilai R 2 prediksi yang dihasilkan < 0,999 yang mengindikasikan bahwa model ini mempunyai linieritas yang tidak bagus sehingga sebenarnya tidak tepat digunakan untuk mengolah data. Profil kolerasi antara kadar prediksi dan kadar aktual guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat dengan validasi silang leave one out dapat dlihat pada gambar 16, 17 dan 18.

73 47 Gambar 13. Data dan parameter hasil validasi silang guaifenesin dengan teknik leave one out. Gambar 14. Data dan parameter hasil validasi silang dextromethorphan HBr dengan teknik leave one out.

74 Calculated Response PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 48 Gambar 15. Data dan parameter hasil validasi silang chlorpheniramine maleat dengan teknik leave one out. 30 PLS Response Plot (response is gg) 3 components Variable Fitted Crossval Actual Response Gambar 16. Kurva hubungan antara kadar guaifenesin sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respon) hasil validasi silang (leave one out) dengan metode spektrofotometri UV-PLS

75 Calculated Response Calculated Response PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLS Response Plot (response is dextro) 8 components Variable Fitted Crossval Actual Response Gambar 17. Kurva hubungan antara kadar dextromethorphan HBr sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respon) hasil validasi silang (leave one out) dengan metode spektrofotometri UV-PLS 4 3 PLS Response Plot (response is ctm) 10 components Variable Fitted Crossval Actual Response 3 4 Gambar 18. Kurva hubungan antara kadar chlopheniramine maleat sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated respon) hasil validasi silang (leave one out) dengan metode spektrofotometri UV-PLS

76 Terhitung (calculated) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 50 Konfirmasi kebaikan model kalibrasi PLS dilakukan juga dengan menggunakan validasi eksternal. Validasi ekternal dilakukan dengan cara menghitung kadar prediksi dari set validasi yang terdiri dari 10 campuran sintetik seperti pada tabel 6. Nilai absorban yang diperoleh dihitung dengan menggunakan koefisien yang diperoleh dari validasi silang sehingga didapatkan kadar prediksi. Evaluasi untuk baik tidaknya data validasi eksternal dilakukan dengan menggunakan nilai R 2, PRESS dan root mean square error of prediction (RMSEP). Semakin kecil nilai RMSEP menandakan bahwa prediksi terhadap konsentrasi sampel baru memiliki tingkat kesalahan yang semakin rendah kadar sebenernya vs terhitung Validasi Guaifenesin Sebenarnya (actual) y = 1.068x R² = Series1 Linear (Series1) Gambar 19. Kurva hubungan antara kadar guaifenesin sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) hasil validasi eksternal dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada λ nm

77 Terhitung (calculated) Terhitung (calculated) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Kadar sebenernya vs terhitung Validasi Dextromethorphan HBr Sebenarnya (actual) y = 0.926x R² = Series1 Linear (Series1) Gambar 20. Kurva hubungan antara kadar dextromethorphan HBr sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) hasil validasi eksternal dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada λ nm Kadar sebenarnya vs terhitung Validasi Chlorpheniramine maleat Sebenarnya (actual) y = 0.281x R² = Series1 Linear (Series1) Gambar 21. Kurva hubungan antara kadar chlorpheniramine maleat sebenarnya (actual response) vs kadar terhitung (calculated response) hasil validasi eksternal dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada λ nm

78 52 Tabel 8. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi PLS dari sampel validasi eksternal yang mengandung guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat Nomor Camp. Konsentrasi (µg/ml) Guaifenesin Dextromethorpan HBr CTM aktual Terhitung aktual Terhitung aktual Terhitung 1 17,0 15, ,0 1, ,5-42, ,6 21, ,6 3, ,8-46, ,8 20, ,0 0, ,0-10, ,5 19, ,2 2, ,8-43, ,0 20, ,0 2, ,0-28, ,6 22, ,8 1, ,4-47, ,0 22, ,0 1, ,0-8, ,0 21, ,4 2, ,5-44, ,5 25, ,0 3, ,4-31, ,0 22, ,5 7, ,8-50, Persamaan : Persamaan : Persamaan : y = 1,0687x + 0,4588 y = 0,9267x -1,1778 y = 0,2811x - 35,856 R 2 = 0,3862 R 2 = 0,4677 R 2 = 0,0003 RMSEP = 2,817 RMSEP = 2,136 RMSEP = 131,068 PRESS = 71,4132 PRESS = 41,0758 PRESS = ,6 Persamaan regresi yang dihasilkan untuk guaifenesin mempunyai nilai R 2 = 0,3862 dan nilai RMSEP = 2,817 µg/ml untuk dextromethorphan HBr R 2 = 0,4677 dan nilai RMSEP = 2,136 µg/ml, sedangkan untuk chlorpheniramine maleat R 2 = 0,0003 dan nilai RMSEP = 131,068 µg/ml. Dari hasil diatas dapat dilihat bahwa nilai R 2 (mendekati 1) yang dihasilkan masih jauh mendekati 1 dan nilai RMSEP yang di dapat belum cukup rendah pada set validasi ini dapat mengkonfirmasi bahwa model kalibrasi PLS dengan validasi silang

79 53 leave one out tidak sesuai digunakan untuk analisis guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat. Berdasarkan uraian di atas sudah dilakukan validasi model kalibrasi terhadap kriteria ketelitian dan ketepatan. Ketelitian dinyatakan dengan nilai presisi. nilai presisi di deskripsikan dengan nilai RMSEC, RMSECV, RMSEP dan PRESS. Analisis RMSEC, RMSECV dan PRESS dilakukan pada sampel kalibrasi sedangkan RMSEP dilakukan pada sampel validasi dimana semakin kecil nilainya maka semakin baik presisinya. Akurasi atau ketepatan dinyatakan dengan nilai koefisien determinasi (R 2 ), semakin mendekati 1 berarti akurasinya tinggi. Selain itu, akurasi juga bisa dideskripsikan dengan persamaan garis y = bx + a, dimana x = kadar sebenarnya dan y = kadar terprediksi. Jika nilai a mendekati 0 dan nilai b mendekati 1 maka akurasinya baik (Danzer et al ). Tabel 9. Rekapitulasi evaluasi parameter validasi metode spektrofotometri uv-kalibrasi multivariat PLS Tahap Parameter validasi GG Dextro CTM Kalibrasi RMSEC 0,130 0,027 0,049 R 2 0,9993 0,9997 0,9976 a 0,0131 0,0001 0,0057 b 0,9993 0,9997 0,9976 Validasi 1.Internal (validasi silang) RMSECV 1,377 0,409 0,571 R 2 0,9214 0,9169 0,6669 PRESS 37,93 3,36 6,54 a b 2. Eksternal RMSEP 2,817 2, ,068 R 2 0,3862 0,4677 0,0003 PRESS 7,144, , ,6 a 0, ,778-35,856 b 10,687 0,

80 54 Melihat parameter yang dihasilkan dari uji validasi silang maupun validasi eksternal yang sudah dilakukan dapat disimpulkan bahwa model ini tidak baik dan tidak sesuai digunakan untuk melakukan penetapan kadar dalam sampel sediaan farmasi. D. Penetapan kadar sampel sediaan farmasi Setelah model kalibrasi selesai di validasi maka model tersebut bisa digunakan untuk memprediksi sampel baru yang tidak diketahui, dengan catatan bahwa sampel baru tersebut harus memiliki kesamaan dengan set kalibrasi, jika tidak maka akan terjadi outlier prediction (Rimbaud et al ). Pada penelitian ini yang digunakan sebagai sampel adalah sediaan farmasi dalam bentuk tablet yang memiliki komposisi yang mengandung guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat dan dibuat dalam konsentrasi yang berada dalam kisaran yang tercakup dalam set kalibrasi. Pada penelitian penulis terlebih dahulu melakukan uji keseragaman bobot tablet. Uji keseragaman bobot tablet dilakukan dengan cara mengambil sampel tablet sebanyak 20 tablet kemudian dihitung bobot rata-ratanya. Tablet yang sudah digerus menjadi serbuk kemudian dilarutkan ke dalam etanol, sedangkan bahan-bahan tambahan lain yang tidak larut disaring dengan menggunakan kertas saring. Pada penelitian ini dilakukan replikasi sebanyak 6 kali. Dari hasil penimbangan, didapatkan bobot rata-rata 20 tablet adalah 299,785 mg sehingga diketahui bahwa tablet merk x mengandung bahan tambahan kurang

81 55 lebih 190 mg karena kandungan tablet seharusnya 107 mg yang mengacu pada komposisi yang terkandung di dalam tablet merk x yaitu chlorpheniramine maleat 2 mg, dextromethorphan HBr 5 mg dan guaifenesin 100 mg. Menurut Farmakope Indonesia edisi III untuk tablet tidak bersalut dengan bobot rata-rata diantara mg syarat keseragaman bobotnya tidak lebih dari 2 tablet yang masing masing bobot menyimpang dari bobot rata-ratanya lebih besar dari 7,5% dan tidak satu pun yang bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata lebih dari 15 % (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Dari hasil penimbangan tidak ada satu pun bobot tablet yang menyimpang dari bobot rata-rata tablet. Penetapan kadar sampel dilakukan dengan melarutkan sejumlah serbuk yang setara dengan 50 mg guaifenesin dalam tablet sediaan farmasi ke dalam pelarut etanol sehingga diperoleh konsentrasi guaifenesin sebesar 26 µg/ml, sehingga secara teoritis didapatkan konsentrasi dextromethorphan HBr 1,30 µg/ml dan konsentrasi chlorpheniramine maleat 0,52 µg/ml. Profil overlay spektra dari 6 sampel terlihat pada gambar berikut : Gambar 22. Overlay spektra 6 sampel sediaan farmasi dalam pelarut etanol pada λ nm

82 56 Data absorban larutan sampel dengan interval 2 nm pada panjang gelombang nm dikalikan dengan koefisien yang didapatkan dari validasi silang, sehingga didapatkan hasil penetapan kadar guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat pada sampel sediaan farmasi secara spektrofotometri ultraviolet-kalibrasi multivariat PLS. Adapun hasil penetapan kadar sampel sediaan farmasi dapat dilihat pada tabel 10, 11 dan 12. Tabel 10. Hasil penetapan kadar prediksi guaifenesin dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS Evaluasi GG Sampel Calculated (µg/ml) 23, , , , , , Penimbangan sampel (mg) 148, ,9 149,4 149,9 149,9 Pengenceran Bobot rata - rata (mg) 299, , , , , ,785 Etiket (mg) Kadar (mg) 91,25 98,92 89,78 97,17 96,26 93,94 Kadar (%) 91,25 98,92 89,78 97,17 96,26 93,94 Rata - rata 94,55 mg/tablet = 94,55 % SD 3,55 RSD 3,75 %

83 57 Tabel 11. Hasil penetapan kadar prediksi dextromethorphan HBr dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS Evaluasi Dextromethorphan HBr Sampel Calculated (µg/ml) 1, ,2237 2, , , , Penimbangan sampel (mg) 148, ,9 149,4 149,9 149,9 Pengenceran Bobot rata - rata (mg) 299, , , , , ,785 Etiket (mg) Kadar (mg) 5,15 4,71 10,25 9,48 10,24 5,05 Kadar (%) 5,15 4,71 10,25 9,48 10,24 5,05 Rata - rata 7,48 mg/tablet = 7,48 % SD 2,77 RSD 37,03 % Tabel 12. Hasil penetapan kadar prediksi chlorpheniramine maleat dalam sediaan farmasi tablet menggunakan metode spektrofotometri UV-PLS Evaluasi CTM Sampel Calculated (µg/ml) 0, , , , , , Penimbangan sampel (mg) 148, ,9 149,4 149,9 149,9 Pengenceran Bobot rata - rata (mg) 299, , , , , ,785 Etiket (mg) Kadar (mg) 3,29 5,07 1,49 2,24 9,79 1,85 Kadar (%) 3,29 5,07 1,49 2,24 9,79 1,85 Rata - rata 3,96 mg/tablet = 3,96% SD 3,14 RSD 79,39 % Pada penetapan kadar ini dapat diketahui ketelitian yang berupa repeatability, yaitu derajat kedekatan hasil yang diperoleh pada kondisi kerja yang sama dalam waktu pengukuran yang dekat (Snyder et al., 1997). Penentuan ketelitian sampel dilakukan dengan 6 replikasi dengan kondisi kerja yang sama. Ketelitian

84 58 dinyatakan dengan simpangan baku relatif (RSD). Pada penelitian ini simpangan baku relatif yang diperoleh dari penetapan kadar untuk guaifenesin dalam sediaan tablet yaitu sebesar 3,75 % untuk dextromethorphan HBr sebesar 37,03 % sedangkan untuk chlorpheniramine maleat sebesar 79,39 %. Nilai simpangan baku relatif tersebut tidak masuk dalam persyaratan yang ditentukan untuk kadar analit 100% yaitu 2% (Horwitz cit., Gonzales and Herrador, 2007), sehingga dapat dikatakan bahwa metode spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat pada penetapan kadar guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr dalam sediaan tablet ini memiliki ketelitian yang belum sesuai dengan yang dipersyaratkan. Kadar guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr kemudian dilihat kesesuaian kadar yang diperoleh dengan persyaratan Farmakope Indonesia edisi IV. Kadar guaifenesin yaitu sebesar 94,55 %. Hal ini sesuai dengan persyaratan yang ditetapkan oleh Farmakope Indonesia edisi IV yang menyatakan bahwa tablet guaifenesin yang mengandung guaifensin, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket, untuk kadar dextromethorphan HBr yaitu sebesar 149,6 %. Hal ini tidak sesuai dengan persyaratan yang ditetapkan oleh USP 30 yang menyatakan bahwa tablet dextromethorphan HBr yang mengandung dextromethorphan HBr, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket, sedangankan untuk kadar chlorpheniramine maleat yaitu sebesar 198 %, hal ini juga tidak sesuai

85 59 dengan persyaratan yang ditetapkan oleh Farmakope Indonesia edisi IV yang menyatakan bahwa tablet chlorpheniramine maleat yang mengandung chlorpheniramine maleat, tidak kurang dari 93,0% dan tidak lebih dari 107,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa penggunaan metode spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat belum berhasil di aplikasikan untuk menetapkan kadar campuran senyawa guaifenesin, chlorpheniramine maleat dan dextromethorphan HBr dalam sediaan tablet.

86 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan a. Metode analisis penetapan kadar guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat tidak dapat digunakan karena nilai akurasi dan presisi yang dihasilkan tidak memenuhi persyaratan yang seharusnya. b. Metode spektrofotometri ultraviolet yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat dengan metode PLS tidak berhasil digunakan untuk melakukan penetapan kadar guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat secara simultan dalam sedian tablet farmasi. B. Saran 1. Perlu dilakukan analisis penetapan kadar guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat dengan menggunakan metode spektrofotometri UV yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat selain PLS untuk mengetahui apakah ketidakberhasilan ini disebabkan oleh senyawanya yang memang tidak dapat dianalisis dengan metode kalibrasi multivariat atau ada faktor lain yang mempengaruhi. 60

87 61 2. Perlu dilakukan uji lebih lanjut untuk mengetahui apakah ada faktor-faktor yang dapat menyebabkan kegagalan dalam analisis dengan menggunakan metode kalibrasi multivariat. 3. Perlu dikembangkan lebih lanjut metode analisis selain spektrofotometri ultraviolet yang juga memanfaatkan kalibrasi multivariat sehingga dapat digunakan sebagai kontrol kualitas. 4. Perlu dibandingkan dengan metode analisis yang menggunakan pemisahan (kromatografi).

88 DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2004, Validation of Analytical Method Definition and Terminology Q2A, International Conference on Harmonisation of Technical Requirement for Registration of Pharmaceutical for Human Use, 69. Bano, T., Yadav G., and Dudhe R., 2013, Development and Validation of Oseltamivir Phosphate API by UV-Spectrophotometer, Global J.Pharm., 7 (3), Brereton, R.E., 2000, Introduction to multivariat calibration in analytical chemistry, Roy. Soc. Chem., 125: Che Man, Y.B., SyahAriza, Z.A., Mirghani, M.E.S., Jinap, S., and Bakar, J.2005, Analysis of potential lard adulteration in chocolate and chocolate products using, Food Chem., 90: Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, 6 th Ed., , John Willey and SonsInc., New York. Connors, K.A., 1982, A Textbook of Pharmaceutical Analysis, 3 rd Ed., , John Willey and Sons Inc., New York. Danzer, K., Otto, M., and Currie, L.A., 2004, Guideline for Calibration in Analytical Chemistry Part 2. Multispesies Calibration (IUPAC Technical Report), Pure Appl. Chem., 76(6): Day, R.A., Underwood, A.L., 1986, Quantitative Analysis, diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, 5 th Ed, 396, , Penerbit Erlangga, Jakarta. De Luca, M., Oliverio, F., Ioele, G.,2009, Multivariate calibration techniques applied to derivative spectroscopy data for the analysis of pharmaceutical mixtures, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 96, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.210,299,421. El-Gindy, A., S. Emara, and A. Mostafa, 2006, Application and validation of chemometrics-assisted spectrophotometry and liquid chromatography for the simultaneous determination of six-component pharmaeuticals, J.Pharm.Biomed. Anal., 41,

89 63 Ermer, J. and Miller, J.H., 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis, Wiley VCH Verlag GmBH & Co.KgaA, Weinheim, pp. 3, 21, 52, 63, 246. Escandar, G.M., Damiani, P.C., Goicoechea, H.C., and Olivieri, A.C., 2006, A Review of Multivariate Calibration Methods Applied to Biomedical Analysis, Microchem, J., 82, Faber, N.M., and Rajko, R., 2007, How to avoid over-fitting ini multivariat calibration-the conventional validation approach and an alternative, Anal. Chim. Acta, 595, Gandjar, I.G., Rohman, A.,2007, Kimia Analisis Farmasi, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp 46-48, , , 456, , Ghasemi, J., and Vosough, M., 2002, Simultaneous Spectrophotometric Determination of Folic Acid, Thiamin, Riboflavin, and Pyridoxal Using Partial Least-Squares Regression Method, Spectrosc, Lett., 35(2), Givianrad, M.H., and Mohagheghian, M., 2011, Net Analyte Signal Standard Additions Method for Simultaneous Determination of Sulfamethoxazole and Trimethorprim in Pharmaceutical Formulations and Biological Fluids, Eng.J.Chem., 9(2), Gonzales, A.G., Herrador, M.A., 2007, A Practical Guide to Analytical Method Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles, Trends Anal, Chem.,26 (3), p.234. Gonzales, A.G., Herrador, M.A., Asureo, A.G., 2010, Intra laboratory assessment of method accuracy (trueness and precision) by using validation standards, Talanta, 82, pp Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), p.117. Haven, M.C., Tetrault, G.A., and Schenken, J.R., 1994, Laboratory Instrumentation, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp Hubber, L., 2007, Validation and qualification in analytical chemistry laboratory, Oxford University Press, New York. International Conference of Harmonization, 2005, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.

90 64 Islam, T., Ferdous, S., Jain, P., and Reza, H.M., 2013, Method Development and Validation of Baclofen Mouth Dissolving Tablets by UV Spectroscopy, Eur.J. Pharm. Biopharm., 5(1), Massart, D.L. and Buydens, L Chemometrics in pharmaceutical analysis. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis 6: Miller J.N, Miller J.C, 2010, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 6 th edition, Prentice Hall, England, p ; Minitab Inc, 2010, Minitab Statistical Glossary in Minitab Moffat, A.C., 2011, Clarke s Analysis of Drug and Poisons, 4 th edition, Pharmaceutical Press. Electronic version, London, pp. 1218, 1856, Mulja M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga, Surabaya, pp. 6-11, Munson, J.W., 1991, Analisis Farmasi Metode Modern, Penerjemah: Harjana, Parwa B, Airlangga University Press, Surabay, p.334. Ni, Y., Qi, Z., and Kokot, S Simultaneous ultraviolet spectrophotometric determination of sulfonamides by multivariate calibration approaches. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 82: Osborne, S.D., Jordan, R.B., and Kunnemeyer, R., 1997, Method of wavelength selection for partial least square. Analyst 122: Pindyck, R.S. and Rubinfield, D.L., 1998, Econometric Models & Economic Forecasts, Fourth Edition, McGraw-Hill, Singapore. Ragno, G., Ioele, G., and Risoli, A., 2004, Multivariate calibration techniques applied to the spectrophotometric analysis of one-to-four component systems, Anal. Chim. Acta, 512, Rimbaud, D.J., Bouveresse, E., Massart, D.L., de Noord, O.E. 1999, Detection of Prediction outliers and inliers in multivariate calibration, Anal. Chim. Acta, 388:

91 65 Rohman, A., and Che Man, Y.B., 2011, Analysis of lard in cream cosmetics formulation using FT-IR spectroscopy and chemometrics, Middle-East J.Sci. Res., 7(5), Rohman, A Application of FTIR spectroscopy for quality control in pharmaceutical products: a review. Indonesian Journal of Pharmacy 23(1): 1-8. Rohman, A., Musfiroh, A., and Wijaya, E.G., 2013, Quantitative Determination of Simethicone in Antacid Suspension and Chewable Tablet Using FTIR Spectroscopy, Global J.Pharm. 23(1), 1-8. Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Edisi 2, 22-41, Penerbit Liberty, Yogyakarta. Sohrabi,M.R., Fathabadi, M., and Nouri, A.H, 2009, Simultaneous spectrophotometric determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in pharmaceutical preparations by using multivariate calibration methods, J. App. Chem. Res.,3 (12), Swarbrick, J., Boylan, J.C., 1997, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Volume 15, , Marcel Dekker Inc., New York. Syahariza, Z.A, Che Man, Y.B, Selamat, J, Bakar,J., 2005, Detection of lard adulteration in cake formulation by fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Food Chemistry 92: Synder, L.R., Kirkland, J. J., Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2 nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 688, 691, 722. Watson, D.G., 2003, Pharmaeutical Analysis: A Textbook for Pharmacy Students and Pharmaceutical Chemists, Churchill Livingstone, USA, p.79.

92 LAMPIRAN 66

93 67 Lampiran 1. Keseragaman Bobot Berat 20 tablet = 5,9957 gram Berat rata rata = 0, / 20 = 299,785 gram Tablet 1 = 0,2933 gram 11 = 0,3084 gram 2 = 0,3121gram 12 = 0,3096 gram 3 = 0,2841 gram 13 = 0,2957 gram 4 = 0,2938 gram 14 = 0,2901 gram 5 = 0,2963 gram 15 = 0,3017 gram 6 = 0,3128 gram 16 = 0,2962 gram 7 = 0,2910 gram 17 = 0,3114 gram 8 = 0,2914 gram 18 = 0,3023 gram 9 = 0,2888 gram 19 = 0,3182 gram 10=0,2867 gram 20 = 0,3158 gram Kolom A = 7,5 % = 7,5 % x 299,785 = 22,484 Batas bobot = 299,785 22,484 = 277,301 = 299, ,484 = 322,269 Batas = 277, ,269 Kolom B = 15 % = 15 % x 299,785 = 44,968 Batas bobot = 299,785 44,968 = 254,817 = 299, ,968 = 344,753 Batas = 254, ,753

94 68 Lampiran 2. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) Guaifenesin dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi silang leave one out. PLS Regression: gg versus 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244,... Method Cross-validation None Components to calculate Set Number of components calculated 10 Analysis of Variance for gg Source DF SS MS F P Regression Residual Error Total Model Selection and Validation for gg Components X Variance Error R-Sq Coefficients gg gg standardized Constant

95 69 Lanjutan Lampiran PLS Coefficient Plot for gg PLS Response Plot for gg

96 70 Lampiran 3. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) Dextromethorphan HBr dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi silang leave one out. PLS Regression: dextro versus 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244,... Method Cross-validation None Components to calculate Set Number of components calculated 10 Analysis of Variance for dextro Source DF SS MS F P Regression Residual Error Total Model Selection and Validation for dextro Components X Variance Error R-Sq Coefficients dextro dextro standardized Constant

97 71 Lanjutan Lampiran PLS Coefficient Plot for dextro PLS Response Plot for dextro

98 72 Lampiran 4. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) Chlorpheniramine maleate dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik tanpa validasi silang leave one out. PLS Regression: ctm versus 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270,... Method Cross-validation None Components to calculate Set Number of components calculated 10 Analysis of Variance for ctm Source DF SS MS F P Regression Residual Error Total Model Selection and Validation for ctm Components X Variance Error R-Sq Coefficients ctm ctm standardized Constant

99 73 Lanjutan Lampiran PLS Coefficient Plot for ctm PLS Response Plot for ctm

100 74 Lampiran 5. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) Guaifenesin dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one out. PLS Regression: gg versus 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244,... Method Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set Number of components evaluated 10 Number of components selected 3 Analysis of Variance for gg Source DF SS MS F P Regression Residual Error Total Model Selection and Validation for gg Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) Coefficients gg gg standardized Constant

101 75 Lanjutan Lampiran PLS Coefficient Plot for gg PLS Response Plot for gg

102 76 Lampiran 6. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) Dextromethorphan HBr dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one out. PLS Regression: dextro versus 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244,... Method Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set Number of components evaluated 10 Number of components selected 8 Analysis of Variance for dextro Source DF SS MS F P Regression Residual Error Total Model Selection and Validation for dextro Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) Coefficients dextro dextro standardized Constant

103 77 Lanjutan Lampiran PLS Coefficient Plot for dextro PLS Response Plot for dextro

104 78 Lampiran 7. Output Minitab hasil kalibrasi multivariat partial least square (PLS) Chlorpheniramine maleate dari sampel kalibrasi 20 campuran sintetik dengan validasi silang leave one out. PLS Regression: ctm versus 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270,... Method Cross-validation Leave-one-out Components to evaluate Set Number of components evaluated 10 Number of components selected 10 Analysis of Variance for ctm Source DF SS MS F P Regression Residual Error Total Model Selection and Validation for ctm Components X Variance Error R-Sq PRESS R-Sq (pred) Coefficients ctm ctm standardized Constant

105 79 Lanjutan Lampiran PLS Coefficient Plot for ctm PLS Response Plot for ctm

106 80 Lampiran 8. Data pengukuran spektrofotometri uv 20 campuran sintetik untuk model kalibrasi partial least square (PLS) Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi pada λ (nm) No. Guaifenesin Dextromethorpan HBr CTM Camp Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung Sebenarnya Terhitung

107 81 Lanjutan Lampiran 8. No. Camp

108 82 Lanjutan Lampiran 8. No. Camp

109 83 Lanjutan Lampiran 8. No. Camp

110 84 Lanjutan Lampiran 8. No. Camp

111 85 Lanjutan Lampiran 8. No. Camp

112 86 Lanjutan Lampiran 8. No. Camp

113 87 Lampiran 9. Data pengukuran spektrofotometri uv 10 campuran sintetik untuk validasi model kalibrasi PLS Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi pada λ (nm) No Guaifenesin Dextromethorpan HBr CTM Camp aktual Terhitung aktual Terhitung aktual Terhitung No Camp

114 88 No Camp No Camp

115 89 No Camp Lanjutan Lampiran 9. No Camp

116 90 No Camp

117 91 Lampiran 10. Perhitungan kadar guaifenesin terprediksi dari sampel validasi eksternal 10 campuran sintetik menggunakan koefisien hasil validasi silang λ koef GG Abs V1 Abs V1 * koef Abs V2 Abs V2 * koef Abs V3 Abs V3 * koef Abs V4 Abs V4 * koef Abs V5 Abs V5 * koef konstanta

118 92 Lanjutan Lampiran 10. λ koef GG Abs V1 Abs V1 * koef Abs V2 Abs V2 * koef Abs V3 Abs V3 * koef Abs V4 Abs V4 * koef Abs V5 Abs V5 * koef calculated actual

119 93 Lanjutan Lampiran 10. Abs Abs Abs Abs Abs λ koef GG Abs V6 Abs V6*koef Abs V7 Abs V8 Abs V9 V7*koef V8*koef V9*koef V10 V10*koef konstanta

120 94 Lanjutan Lampiran 10. λ koef GG Abs V6 Abs V6 * koef Abs V7 Abs V7 * koef Abs V8 Abs V8 * koef Abs V9 Abs V9* koef Abs V10 Abs V10* koef calculated actual

121 95 Lampiran 11. Perhitungan kadar CTM terprediksi dari sampel validasi eksternal menggunakan koefisien hasil validasi silang λ koef CTM Abs V1 Abs V1 * Abs V2 * Abs V3 * Abs V4 * Abs V5 * Abs V2 Abs V3 Abs V4 Abs V5 koef koef koef koef koef konstanta calculated actual

122 96 Abs Abs Abs Abs Abs Abs λ koef CTM Abs V6 Abs V7 Abs V8 Abs V9 V6*koef V7*koef V8*koef V9*koef V10 V10*koef konstanta calculated actual

123 97 Lampiran 12. Perhitungan kadar Dextromethorphan HBr terprediksi dari sampel validasi eksternal menggunakan koefisien hasil validasi silang koef Abs V1 * Abs V2 * Abs V3 * Abs V4 * Abs V5 * λ Abs V1 Abs V2 Abs V3 Abs V4 Abs V5 dextro koef koef koef koef koef konstanta

124 98 λ Lanjutan lampiran 12. koef dextro Abs V1 Abs V1 * koef Abs V2 Abs V2 * koef Abs V3 Abs V3 * koef Abs V4 Abs V4 * koef Abs V5 Abs V5 * koef calculated actual

125 99 Lanjutan Lampiran 12. koef Abs Abs Abs Abs λ Abs V6 Abs V7 Abs V7*koef Abs V8 Abs V9 Abs V10 dextro V6*koef V8*koef V9*koef V10*koef konstanta

126 100 λ Lanjutan lampiran 12. koef dextro Abs V6 Abs V6*koef Abs V7 Abs V7*koef Abs V8 Abs V8*koef Abs V9 Abs V9*koef Abs V10 Abs V10*koef calculated actual

127 101 λ Lampiran 13. Perhitungan kadar guaifenesin terprediksi dari sampel tablet menggunakan koefisien hasil validasi silang koef GG Abs sampel 1 abs sampel 1*coef Abs sampel 2 abs sampel 2*coef Abs sampel 3 abs sampel 3*coef Abs sampel 4 abs sampel 4*coef Abs sampel 5 abs sampel 5*coef Abs sampel 6 abs sampel 6*coef konst

128 102 λ Lanjutan Lampiran 13. koef GG Abs sampel 1 abs sampel 1*coef Abs sampel 2 abs sampel 2*coef Abs sampel 3 abs sampel 3*coef Abs sampel 4 abs sampel 4*coef Abs sampel calculated Penimb. Sampel Pengenceran Bobot rata-rata Etiket Kadar abs sampel 5*coef Abs sampel 6 abs sampel 6*coef

129 103 λ Lampiran 14. Perhitungan kadar dextromethorphan HBr terprediksi dari sampel tablet menggunakan koefisien hasil validasi silang koef dex Abs sampel 1 abs sampel 1*coef Abs sampel 2 abs sampel 2*coef Abs sampel 3 konst abs sampel 3*coef Abs sampel 4 abs sampel 4*coef Abs sampel 5 abs sampel 5*coef Abs sampel 6 abs sampel 6*coef

130 104 Lanjutan Lampiran 14. λ koef dex Abs sampel 1 abs sampel 1*coef Abs sampel 2 abs sampel 2*coef Abs sampel 3 abs sampel 3*coef Abs sampel 4 abs sampel 4*coef Abs sampel 5 abs sampel 5*coef Abs sampel 6 abs sampel 6*coef calculated penimb. Sampel Pengenceran Bobot rata-rata Etiket Kadar

131 105 λ Lampiran 15. Perhitungan kadar chlorpheniramine maleat terprediksi dari sampel tablet menggunakan koefisien hasil validasi silang. koef CTM Abs sampel 1 abs sampel 1*coef Abs sampel 2 abs sampel 2*coef Abs sampel 3 abs sampel 3*coef Abs sampel 4 abs sampel 4*coef konst Abs sampel 5 abs sampel 5*coef Abs sampel 6 abs sampel 6*coef

132 106 Lanjutan Lampiran 15. λ koef CTM Abs sampel 1 abs sampel 1*coef Abs sampel 2 abs sampel 2*coef Abs sampel 3 abs sampel 3*coef Abs sampel 4 abs sampel 4*coef Abs sampel 5 abs sampel 5*coef Abs sampel 6 abs sampel 6*coef calculated penimb. Sampel Pengenceran Bobot rata-rata Etiket Kadar

133 107 Lampiran 16. Certificate of Analysis (CoA) Guaifenesin

134 108 Lampiran 17. Certificate of Analysis (CoA) Dextromethorphan HBr r

135 109 Lampiran 18. Certificate of Analysis (CoA) Chlorpheniramine maleat

136 BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul Kombinasi Spektrofotometri Ultraviolet dan Kalibrasi Multivariat untuk Analisis Guaifenesin Chlorpheniramine maleat dan Dextromethorphan HBr dalam Sediaan Tablet memiliki nama lengkap Sophia Sari Asdini lahir di Cilacap, 24 Juni Anak kedua dari pasangan Bapak Boy M.Gerungan dan Ibu Endang Probowati. Pendidikan formal yang sudah ditempuh penulis adalah di TK Maria Immaculata Cilacap, SD Maria Immaculata Cilacap ( ), SMP N 1 Cilacap ( ), SMA N 3 Cilacap ( ). Setelah lulus SMA, penulis melanjutkan studi ke Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun Selama perkuliahan penulis pernah mengikuti beberapa kegiatan fakultas yaitu, panitia KPU dan panitia pelepasan wisuda Fakultas Farmasi dan penulis juga pernah mengikuti kegiatan luar kampus yaitu Program Kreativitas Mahasiswa dengan judul program BERMANJA (Bermain sambil Belajar): Kenalkan Swamedikasi terhadap Diare kepada Anak anak SD Sambiroto I Kalasan. 110