UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Transkripsi

1 UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Bakso Sapi Yang Beredar Di Wilayah Ciputat Menggunakan Real- Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi SULAIMAN RASYID NIM : FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JUNI 2015

2

3

4

5 ABSTRAK Nama Program Studi Judul : Sulaiman Rasyid : Farmasi : Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real- Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe. Harga daging sapi semakin meningkat dari waktu ke waktu. Faktor tersebut mendorong produsen yang tidak bertanggungjawab untuk mencampur daging sapi dengan daging babi demi mendapat keuntungan yang besar. Padahal Islam melarang umatnya untuk mengkonsumsi babi walau hanya sedikit. Metode yang handal, efisien dan terpercaya diperlukan untuk dapat mendeteksi cemaran daging babi pada produk daging olahan. Penelitian ini menganalisis cemaran babi menggunakan Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe yang memiliki keunggulan dari segi spesifisitas DNA yang di amplifikasi. Isolat DNA dari 2 kontrol positif, 2 kontrol negatif dan 8 sampel didapatkan menggunakan kit komersial dengan hasil konsentrasi dan kemurnian yang baik. Amplifikasi dilakukan menggunakan primer spesifik sapi dan babi yang didisain pada daerah DNA mitokondria sitokrom b dengan amplikon 120 bp dan 131 bp. Suhu annealing yang ditetapkan pada sapi adalah 61 o C dan babi 60 o C. Kurva amplifikasi menggunakan primer spesifik babi menunjukkan bahwa kontrol positif teramplifikasi dengan nilai CP 16,74 dan 30,37 sedangkan kontrol negatif dan semua sampel tidak terdeteksi. Kata Kunci : Real-Time PCR, Bakso, Cemaran daging babi, Hydrolysis Probe v

6 ABSTRACT Name Major Title : Sulaiman Rasyid : Pharmacy : Analysis of Pork Contamination in Beef Meat Ball which are available throughout Ciputat area Using Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) with Hydrolysis Probe Method. The price of beef is increasing from time to time. Because of this factor, The producer who doesn t have responsibility is unfairly mixing beef with pork to get huge profit. Though in religion of Islam forbid muslims to consume pork even only slightly. The reliable, efficient and trusted method are required to detect pork contamination in processed meat products. This study was to analyzed the pork contamination using Real Time PCR with Hydrolysis Probe method. The advantage of this method is DNA amplification specificity. DNA was isolated from Two positive control, Two negative control and 8 sample. The isolate of DNA was obtained using a commercial kit with a good result of concentration and purity. Amplification was performed using cattle and pork specific primers. The primers was designed in the area of Cytochrome b mithocondrial DNA with amplicon of 120 bp and 131 bp. The annealing temperature specified in cattle and pork consecutively is 61 o C and 60 o C. The amplification curve using specific pork primers showed the positive control amplified with yield of CP is 16,74 and 30,37 while the negative control and all of the samples were not detected. Keywords : Real-Time PCR, Meatball, contamination of pork, Hydrolysis Probe vi

7 KATA PENGANTAR Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang senantiasa meberikan jalan keluar bagi hamba Nya yang meminta jalan keluar. Atas rahmat Nya skripsi yang berjudul Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan metode Hydrolysis Probe ini berhasil penulis selesaikan. Sholawat beriring salam semoga selalu tercurah limpah kepada baginda Rasulullah SAW, manusia terbaik sepanjang zaman, teladan umat manusia menjalani kehidupan. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam ujian akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Rampungnya penelitian dan penulisan skripsi ini pastilah atas bantuan berbagai pihak, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih yang sedalam-dalamnya kepada : 1. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK). 2. Ibu Zilhadia M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I juga pembimbing akademik penulis dan Ibu Ofa Suzanthi Betha, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing II yang penuh rasa sabar dan sayang dalam menasehati serta memberikan ilmu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan penulisan skripsi ini. 3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt. Dan Ibu Nelly Suryani, Ph.D, Apt. selaku Ketua Program Studi dan Sekretaris Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Kedua orang tua tercinta, ayahanda Muhamad Sodik dan ibunda Sumenah yang senantiasa ikhlas memberikan yang terbaik bagi putra nya. Serta Kakakku Anna Saidah dan Adikku Muhammad Fahruddin yang juga memberikan dorongan dan semangat. vii

8 5. Bapak dan Ibu pengajar serta segenap staf dan karyawan yang telah memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan dan atau bantuan selama penulis menempuh pendidikan farmasi di FKIK. 6. Teman-teman angkatan Betalaktam yang telah menjadi memori berkesan selama penulis menuntut ilmu. 7. Kak Rahmadi, Kak Rani, Kak Tiwi, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Lilis dan Kak Ai yang telah membantu penulis dalam melakukan penelitian di laboratorium. 8. Teman-teman seperjuangan tim PCR dari angkatan ke angkatan terutama Afifah dan Yanti juga Putri Rahmawati, Dienar Fitri dan adik-adikku Rian Hidayat dan Fathiya, Semoga bekal yang didapat bermanfaat untuk kehidupan kita di masa depan. 9. Tim Roche Indonesia: Pak Deka, Pak Yos, Ibu Helen yang membantu penulis dalam penyelesaian terkait RT-PCR. 10. Iyus, Rian, Suparman, Dendi dan Ali serta saudara-saudaraku dalam lingkaran surga, semoga kebersamaan kita tetap di eratkan hingga kaki kita benar-benar telah berada di surga Nya. 11. Sahabat-sahabat seperjuangan di jalan dakwah yang senantiasa saling mendoakan, siapapun dan dimanapun kalian berada, semoga kita istiqomah dan tetap dalam keyakinan menjadi umat terbaik di bumi ini. Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapat ganjaran terbaik di sisi Allah SWT. Sekali lagi mohon maaf jikalau penulis hanya bisa memberikan ucapan terimakasih yang sedalam-dalamnya. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan menjadi amal jariah bagi penulisnya. Aamiin. Jakarta, 24 Juni 2015 Penulis viii

9 HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama : Sulaiman Rasyid NIM : Program Studi : Strata-1 Farmasi Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Jenis Karya : Skripsi Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya dengan judul : Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di : Jakarta Pada tanggal : 24 Juni 2015 Yang Menyatakan, (Sulaiman Rasyid) ix

10 DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL... i HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS... ii LEMBAR PERESETUJUAN PEMBIMBING... iii HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI... iv ABSTRAK... v ABSTRACT... vi KATA PENGANTAR... vii HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI... ix DAFTAR ISI... x DAFTAR GAMBAR... xiii DAFTAR TABEL... xiv DAFTAR LAMPIRAN... xv DAFTAR SINGKATAN... xvi DAFTAR ISTILAH... xvii BAB 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Rumusan Masalah Hipotesis Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian... 4 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA Bakso Babi dan Keharamannya Sel Asam Nukleat dan Protein DNA Pengertian DNA DNA Mitokondria Isolasi DNA x

11 2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR) Komponen PCR Tahapan PCR Real-Time PCR Prinsip Analisis Analisis menggunakan metode Hydrolysis Probe BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Tempat Waktu Alat dan Bahan Alat Bahan Tahapan Penelitian Prosedur Kerja Pengumpulan Sampel Isolasi DNA Preparasi Sampel Proses Melisiskan Sampel dan Mengikat DNA Proses Pemurnian dan Elusi DNA Analisis Hasil Isolasi DNA dengan Spektrofotometri UV untuk DNA Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan metode BLAST menggunakan database NCBI Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis probe BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer UV Hasil Analisis Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI xi

12 4.3 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR Penetapan Metode Amplifikasi yang Optimal Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe menggunakan Primer Sapi Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Second Derivative Maximum Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Fit Point Perbandingan antara Analisis Second Derivative Maximum dan Fit Point pada Primer Sapi Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe menggunakan Primer Babi Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Second Derivative Maximum Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Fit Point Perbandingan antara Analisis Second Derivative Maximum dan Fit Point pada primer sapi Perbandingan antara metode analisis baik Second Derivative Maximum maupun Fit Point pada sampel dengan primer sapi dan primer babi BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xii

13 DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Sel Prokariotik dan Eukariotik... 6 Gambar 2.2 Asam Nukleat: DNA dan RNA... 8 Gambar 2.3 Struktur Nukleotida... 9 Gambar 2.4 Struktur Basa Nitrogen Purin dan Pirimidin Gambar 2.5 Struktur double helix DNA Gambar 2.6 Susunan dan Replikasi DNA Gambar 2.7 Struktur mtdna pada Manusia Gambar 2.8 Simulasi Proses PCR Gambar 2.9 Siklus PCR Gambar 2.10 Bentuk Kurva pada Real-Time PCR Gambar 4.1 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe sapi dengan program BLAST pada laman NCBI Gambar 4.2 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe babi dengan program BLAST pada laman NCBI Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi RT-PCR menggunakan Primer Sapi Gambar 4.4 Kurva Amplifikasi RT-PCR menggunakan Primer Babi xiii

14 DAFTAR TABEL Tabel 1. Perbandingan sel eukariotik dan prokariotik... 7 Tabel 2. Tahapan Proses Fluoresensi Hydrolysis Probe Tabel 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi (Tanabe et a.l, 2007) Tabel 4. Program amplifikasi Real-Time PCR (Roche c, 2008) Tabel 5. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi Tabel 6. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative Maximum pada sampel dengan primer sapi Tabel 7. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan variasi nilai treshold pada sampel dengan primer sapi Tabel 8. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative Maximum dan Fit Point pada treshold 0,75 dengan primer sapi Tabel 9. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative Maximum pada sampel dengan primer babi Tabel 10. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan variasi nilai treshold pada sampel dengan primer sapi Tabel 11a. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative Maximum dan Fit Point pada treshold 0,914 dengan primer babi Tabel 11b. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative Maximum dan Fit Point pada treshold 1,733 dengan primer babi Tabel 12. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative Maximum pada primer Sapi dan Babi Tabel 13a. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan treshold 0,9 pada primer Sapi dan Babi Tabel 13b. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan treshold 1,33 pada primer Sapi dan Babi xiv

15 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Alur Penelitian Lampiran 2. Spesifikasi Kit isolasi DNA High Pure PCR Template Preparation Lampiran 3. Alur kerja Isolasi DNA menggunakan kit High Pure PCR Template Preparation Lampiran 4a. Membuat larutan induk primer dan probe Lampiran 4b. Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA Lampiran 5. Perhitungan Tm (Melting Temperature) primer Lampiran 6. Hasil Optimasi Suhu Annealing Primer Tanabe et al. dengan Metode Gradien PCR (Rahmawati, 2012) dengan modifikasi Lampiran 7. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0, Lampiran 8. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0, Lampiran 9. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0, Lampiran 10. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 1, Lampiran 11. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0, Lampiran 12. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0, Lampiran 13. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 1, Lampiran 14. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 1, Lampiran 15. Gambar alat-alat yang digunakan dalam penelitian xv

16 DAFTAR SINGKATAN BHQ-1 BLAST bp CP cyt b datp dctp dgtp dntp dttp DNA FAM mtdna NCBI NTC PCR qpcr RE RNA Tm Ta : Black Hole Quencher-1 : Basic Logical Aligment Search Tool : Base pair : Crossing Point : Cytochrome b : Deoxyadenosine Triphosphate : Deoxycytidine Triphosphate : Deoxyguanosine Triphosphate : Deoxyribonuleaside Triphosphate : Deoxythymidine Triphosphate : Deoxyribonucleic Acid : Fluorescein Amidite : mitochondrial DNA : National Center for Biotechnology Information : No Template Control : Polymerase Chain Reaction : Quantitative Polymerase Chain Reaction : Retikulum Endoplasma : Ribonucleic Acid : Temperature Melting : Temperature Annealing xvi

17 DAFTAR ISTILAH BLAST : Basic Logical Aligment Search Tool merupakan program untuk menganalisis kesejajaran urutan basa query (DNA atau protein) dengan urutan basa DNA atau protein dari database NCBI Blastn : Nucleotide Blast atau biasa disebut blastn merupakan salah satu fasilitas dari program BLAST untuk menganalisis kesejajaran nukleotida yang dimasukkan pada query dengan nukleotida pada database NCBI CP : Crossing Point merupakan angka siklus yang menunjukkan awal permulaan akumulasi amplikon telah memasuki peningkatan log-linear Fit Point : Metode penentuan CP melalui pertemuan antara garis treshold dengan kurva amplifikasi Garis Treshold : Garis horizontal penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat sinyal fluorescent berada pada titik terendah NCBI : National Center for Biotechnology Information merupakan suatu institusi yang dimiliki United States National Library of Medicine yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekuler. Dari situs NCBI dapat diakses database bioteknologi meliputi genebank, urutan basa DNA atau protein juga publikasi-publikasi ilmiah. Second Derivative : Metode penentuan CP dalam instrumen LightCycler 480 Maximum dimana CP diperoleh berdasarkan saat kurva amplifikasi mengalami kenaikan yang tajam Query : Urutan basa yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk diketahui kesejajarannya dengan data yang tersedia Tm : Temperature Melting atau suhu lebur adalah suhu saat dimana 50% bagian DNA seolah terbuka menjadi untai tunggal xvii

18 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Kehalalan suatu makanan yang akan dikonsumsi adalah suatu syarat ketetapan Agama Islam yang wajib dijalankan oleh umatnya. Suatu makanan dapat dikatakan halal apabila tidak dilarang oleh nash-nash agama. Makanan yang halal bisa menjadi haram apabila makanan tersebut tidak baik untuk dikonsumsi. Babi merupakan hewan yang secara keseluruhan diharamkan untuk dikonsumsi oleh umat Islam (Q.S Al-Baqarah : 173, Al-Ma idah : 3, Al-An am : 145 dan An-Nahl : 115). Babi diketahui sebagai inang dari banyak macam parasit dan penyakit berbahaya. Sistem biokimia babi mengeluarkan hanya 2% dari seluruh kandungan asam uratnya, sedangkan 98% sisanya tersimpan dalam tubuhnya (Wijaya, 2009). Wajib bagi pemerintah Indonesia yang mayoritas masyarakatnya beragama Islam untuk memperhatikan kehalalan makanannya dari campuran daging babi. Dalam era perdagangan global, dimungkinkan terjadinya impor bahan makanan dalam bentuk olahan atau mentah dari negara lain ke Indonesia tanpa melalui pengujian yang mendalam. MUI (Majelis Ulama Indonesia) selaku perkumpulan ahli ilmu agama Islam tertinggi di negeri ini melalui LPPOM (Lembaga Pusat Pengkajian Obat dan Makanan) telah melakukan sertifikasi halal terhadap produk-produk yang ber edar termasuk produk pangan daging. Namun masih ditemukan beberapa kasus pencampuran daging babi pada produk daging sapi olahan. Tujuan pencampuran tersebut untuk menghasilkan produk akhir dengan harga yang relatif lebih murah dibandingkan jika menggunakan bahan aslinya, mengingat harga daging sapi terus meningkat (Margawati dan Ridwan, 2010). Bakso merupakan bahan makanan yang digemari oleh penduduk Indonesia, selain harganya dapat dijangkau bakso juga memiliki rasa yang relatif disukai. Hampir di seluruh provinsi di Indonesia bisa kita dapatkan produk bakso ini. Bahan utama bakso adalah daging yang dicampur dengan beberapa tambahan lain. 1

19 2 Pada akhir tahun 2007 di kota Jambi ditemukan kandungan daging babi dalam bakso sapi, pada Mei 2010 kasus yang sama juga kembali terulang (jambi-independent.co.id). Selain beredar di Kota Jambi, produk bakso berlabelkan bakso sapi yang mengandung babi juga membuat gegar kota Palembang pada bulan maret di tahun yang sama (okezone.com). Akibat adanya kasus bakso babi di tahun 2007 menyebabkan 80% pedagang bakso eceran bangkrut. Kejadian tersebut belum membuat pelanggar hukum jera. Semakin dekat, kasus kembali terjadi pada bulan Desember 2012 di Pasar Cipete, Jakarta Selatan. Ditemukan sebuah kios penggilingan yang menjual bakso yang di campur daging babi (detik.com). Bulan April tahun lalu masyarakat Jakarta kembali dikejutkan dengan terbongkarnya bakso oplosan babi di Tambora, Jakarta Barat (sindonews.com). Yang cukup hangat pada 12 Februari kasus yang sama terjadi di buah batu, Bandung (Jpnn.com) dan paling terbaru akhir Maret lalu kota Sukabumi mengalami kejadian serupa (antaranews.com). Hal tersebut tentunya sangat meresahkan penduduk daerah tersebut dan juga penduduk Indonesia yang sebagian besar adalah muslim. Hingga hari ini teknologi biologi molekuler terus mengalami perkembangan dan kemajuan yang pesat. Teknologi tersebut telah dapat diaplikasikan dan mempermudah pengujian akan adanya kontaminasi bahan lain diluar bahan aslinya. Pengujian cemaran daging babi dalam berbagai produk daging olahan seperti daging bakso dapat dideteksi melalui amplifikasi PCR. Margawati dan Ridwan (2010) telah melakukan pengujian pencemaran campuran daging babi pada produk bakso. Sebelumnya Calvo et al, (2001) melakukan identifikasi daging babi pada produk makanan olahan dan mentah melalui amplifikasi PCR. Pada tahun 2008 Alaraidh juga berhasil melakukan isolasi DNA dan amplifikasi PCR dari sampel daging yang terkontaminasi daging babi di pasar Arab Saudi. Sistem TaqMan Real-Time PCR dengan probe Minor Groove Binding (MGB) juga telah digunakan pada pendeteksian kuantifikasi DNA sapi, babi, domba, ayam, kalkun dan burung onta pada sampel yang kompleks (Lopez-Andreo et al, 2005). Keuntungan metode analisis dengan menggunakan DNA yaitu DNA dapat ditemukan di semua tipe sel pada suatu individu dengan informasi genetik

20 3 yang identik. DNA merupakan molekul yang stabil dalam proses ekstraksi, dan analisis DNA sangat mungkin dikerjakan dari beberapa tipe sampel yang berbeda (Jain, 2004). Dengan demikian upaya mendeteksi adanya campuran daging babi dalam produk daging sapi olahan dapat dilakukan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis ada atau tidaknya kandungan daging babi pada produk daging sapi olahan. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah bakso sapi. Pengujian dilakukan melalui amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR. Real-Time PCR merupakan metode terkini untuk amplifikasi PCR. Pada Real-Time PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara real-time sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real-Time PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisisnya yang sensitif dan spesifik sehingga mengurangi kesalahan pada hasil (Burns et al, 2005). 1.2 Rumusan Masalah 1. Bagaimana kondisi optimal amplifikasi DNA pada bakso menggunakan primer spesifik babi dan sapi dengan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe? 2. Apakah bakso sapi yang beredar di wilayah Ciputat tercemar daging babi? 1.3 Hipotesis 1. Real-Time PCR dapat mengamplifikasi DNA menggunakan primer spesifik babi dan sapi dengan metode Hydrolysis Probe. 2. Bakso sapi yang beredar di wilayah Ciputat ada yang tercemar daging babi.

21 4 1.4 Tujuan Penelitian Mendeteksi keberadaan kandungan babi dalam bakso sapi yang dijual di wilayah Ciputat melalui amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR. 1.5 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi kepada masyarakat tentang keamanan dan kehalalan produk bakso sapi yang beredar di wilayah Ciputat. Hal ini dilakukan sebagai dharma UIN terhadap masyarakat sekitar, sehingga masyarakat lebih berhati-hati dan bijaksana dalam mengkonsumsi produk olahan daging seperti bakso sapi.

22 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Bakso Bakso adalah makanan terbuat dari daging, udang, ikan yang dicincang dan dilumatkan bersama tepung kanji, biasanya bulat-bulat (KBBI, 2008) Bakso daging menurut SNI No: adalah produk makanan berbentuk bulatan atau lain yang diperoleh dari campuran daging ternak (kadar daging tidak kurang dari 50 persen) dan pati atau serealia dengan atau tanpa bumbu BTP (bahan tambahan pangan) yang diizinkan. Pembuatan bakso biasanya menggunakan daging yang segar. Daging segar (pre-rigor) adalah daging yang diperoleh setelah pemotongan hewan tanpa mengalami proses pendinginan terlebih dahulu. Fase pre-rigor berlangsung selama 5 sampai 8 jam setelah postmortem. Bakso dapat dikelompokkan menurut jenis daging yang digunakan dan berdasarkan perbandingan jumlah tepung pati yang digunakan. Berdasarkan jenis daging sebagai bahan baku untuk membuat bakso, maka dikenal bakso sapi, bakso ayam, bakso ikan, bakso kerbau, dan bakso kelinci (Gaffar, 1998 dalam Saddam 2013). 2.2 Babi dan Keharamannya Babi adalah sejenis hewan ungulata yang bermancung panjang dan berhidung leper dan merupakan hewan yang aslinya berasal dari Eurasia. Daniel S Shapiro, MD., seorang Pengarah Clinical Microbiology Laboratories, Boston Medical Center, Massachusetts, dan juga merupakan Asisten Profesor di Pathology and Laboratory Medicine, Boston University School of Medicine, Massachusetts, Amerika menyatakan terdapat lebih dari 25 penyakit yang bisa dijangkiti dari babi. Di antaranya Anthrax, Ascaris suum, Botulism, Brucella Euis, Cryptosporidiosis, Entamoeba polecki, Erysipelothrix shusiopathiae, Flavobacterium group IIb-like bacteria, Influenza, Leptospirosis, Pasteurella aerogenes, Pasteurella multocida, Pigbel, Rabies, Salmonella cholerae-suis, Salmonellosis, Sarcosporidiosis, Scabies, Streptococcus dysgalactiae (group L), Streptococcus Miller, Streptococcus

23 6 suis type 2 (group R), Swine vesicular disease, Taenia solum, Trichinella spiralis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis (Wijaya, 2009). Sebagai muslim yang taat dan menjadikan kitab suci Al-Qur an sebagai pedoman hidup, dilarang menganiaya diri sendiri termasuk mengkonsumsi sesuatu yang membahayakan bagi kita. Apalagi terkait pengharaman daging babi secara jelas difirmankan oleh Allah kepada Rasulullah Katakanlah: "Tidak kudapati di dalam apa yang diwahyukan kepadaku, sesuatu yang diharamkan memakannya bagi yang ingin memakannya, kecuali daging hewan yang mati (bangkai), darah yang mengalir, daging babi - karena semua itu kotor - atau hewan yang disembelih bukan atas (nama) Allah. Tetapi barangsiapa terpaksa bukan karena menginginkan dan tidak melebihi (batas darurat) maka sungguh, Tuhan-mu Maha Pengampun, Maha Penyayang." (QS.Al-An am:145) 2.3 Sel Sel adalah komponen dasar dan unit terkecil dari kehidupan. Organisme pertama yang ada semenjak 1 milyar tahun yang lalu terdiri dari sel tunggal. Organisme sederhana yang ada terdiri dari hanya 1 sel. Satu karakteristik kunci organisme yang hidup adalah dapat mereplikasi atau mereproduksi dirinya. Banyak organisme sel tunggal yang bereproduksi dengan membelah diri menjadi 2 salinan baru yang identik dari dirinya. Sebaliknya, organisme multiseluler bereproduksi dengan cara yang bervariasi. (Cain, 2002) Sel Prokariot Sel Eukariot Gambar 2.1. Sel Prokariotik dan Eukariotik (Sumber: Brooks, 2003)

24 7 Ketika organisme menghasilkan benih, bertelur, atau membelah diri sekalipun, semua bereproduksi menggunakan molekul yang dikenal dengan sebutan DNA (deoxyribonucleic Acid). (Cain, 2002) Organisme yang hidup saat ini dibagi dalam dua kelompok besar, yaitu prokariot dan eukariot. Berikut adalah perbandingan antara prokariot dan eukariot menurut Koolman et al, (2005) dalam bukunya yang berjudul Atlas Berwarna dan Teks Biokimia Tabel 1. Perbandingan sel eukariotik dan prokariotik (Koolman et al, 2005) Prokariotik Eukariotik Contoh Organisme dan Ukuran sel Eubacteria Jamur, Tumbuhan dan Hewan Archaebacteria ( µm) (1-10 µm) Bentuk Organisasi Bersel satu Bersel satu atau banyak Organel, sitoskelet, alat pembelahan sel : Tidak Ada Ada, rumit dan terspesialisasi DNA Kecil, sirkular, tidak ada intron, Besar, dalam inti sel, banyak intron terdiri dari plasmid-plasmid RNA: Sintesis dan Pematangan Sederhana, didalam sitoplasma Rumit, didalam inti sel Protein: Sintesis dan Pematangan Sederhana, terangkai dengan Rumit, dalam sitoplasma dan sintesis RNA retikulum endoplasma berbintil Metabolisme Anaerobik atau aerobik, sangat Kebanyakan aerobik mampu menyesuaikan diri Endositosis dan Eksositosis Tidak Ya

25 8 2.4 Asam Nukleat dan Protein Asam nukleat dan protein merupakan senyawa polimer utama yang terdapat pada sel. Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi genetik dalam sel (Gaffar, 2007). Protein seperti asam nukleat, juga berupa rantai dari unit kecil polimer. Protein terdiri dari rantai asam amino, terdapat 20 jenis asam amino yang berbeda pada protein. Asam amino tergabung bersama di dalam protein lewat ikatan peptida sehingga disebut polipeptida. Protein terdiri dari satu atau lebih polipeptida. Kebanyakan protein berfungsi untuk menjaga dan memberikan bentuk pada sel. Selain itu protein juga berperan sebagai hormon yang mengirimkan sinyal antar sel. Protein bertindak sebagai enzim yang menjadi katalis ratusan reaksi yang diperlukan dalam kehidupan (Weaver, 2001) Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) yang berfungsi sebagai penyimpan informasi. Dan asam ribonukleat (RNA) berperan sebagai ekspresi gen dan bio-sintesis protein. Semua asam nukleat dibentuk dari komponen-komponen nukleotida yang terdiri atas satu basa, satu gula dan satu residu fosfat. DNA dan RNA dapat dibedakan dari jenis gulanya dan pada salah satu dari basanya (Koolman et al, 2005). Gambar 2.2 Asam Nukleat: DNA dan RNA (Sumber: National Human Genome Research Institute)

26 9 2.5 DNA Pengertian DNA DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Pada awal 1930-an, Levene, W. Jacobs mengemukakan bahwa RNA terdiri dari gula ribosa dan empat basa nitrogen sedangkan DNA terdiri gula yang berbeda yaitu deoksiribosa dan empat buah basa (Weaver, 2001). Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat (Gambar 2.3). Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil = U) (Gambar 2.4). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3, gugus fosfat pada posisi karbon 5 dan basa pada posisi karbon 1 molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5 fosfat dengan gugus 3 hidroksil. (Gaffar, 2007). Gambar 2.3 Struktur Nukleotida (Sumber: Gaffar, 2007)

27 10 Gambar 2.4 Struktur basa nitrogen purin dan pirimidin (Gaffar, 2007). Pada tahun 1953, Watson dan Crick mengemukakan bahwa struktur molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang memutar kekanan (Gaffar, 2007). Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkaian nukleotida yang tersusun secara linier. Kedua rangkaian yang saling berikatan itu terbentuk seperti tali berpilin, sehingga molekul DNA dikatakan sebagai double helix (heliks ganda). Untuk membentuk rangkaian molekul DNA heliks ganda, basa nitrogen dari setiap nukleotida dalam satu rangkaian akan berpasangan dengan basa nitrogen dari setiap nukleotida pada rangkaian lainnya melalui ikatan hidrogen. Pengikatan basa nitrogen dari masing-masing nukleotida tersebut sangat spesifik. Basa A dari satu nukleotida selalu berikatan dengan basa T dari nukleotida lainnya, sedangkan basa G selalu berikatan dengan basa C. Pasangan A dan T terbentuk dengan dua ikatan hidrogen, sedangkan

28 11 pasangan G dan C terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh karena itu, pasangan G dan C lebih stabil daripada pasanagan A dan T (Muladno, 2010). Gambar 2.5. Struktur double helix DNA (Sumber: Brooks, 2003) DNA (Deoxyribonucleic Acid) merupakan polimer linear yang tersusun dari unit unit nukleotida yang mengkode materi genetik yang dapat diwariskan. Pengaturan urutan dan banyaknya basa-basa nukleotida inilah yang membawa informasi genetik dalam sel. Setiap jenis mikroorganisme mempunyai urutan dan jumlah basa nukleotida yang dapat sangat berbeda, tetapi setiap jenis mikroorganisme akan menurunkan generasinya dengan urutan dan banyaknya basa-basa nukleotida yang sama. Sintesis DNA akan diteruskan ke sel keturunan menyediakan mekanisme untuk pembuatan salinan yang tepat melalui penggunaan basa komplementer (Purnomo, 2004).

29 12 Gambar 2.6 Susunan dan Replikasi DNA (Sumber: Purnomo, 2004) Apabila benang I (b1) direplikasi, maka dihasilkan benang tunggal (b2a) yang identik dengan benang II (b2), dan sebaliknya apabila benang II (b2) direplikasi maka akan dihasilkan benang tunggal (b1a) yang identik benang I (b1). Hasil akhir merupakan dua benang heliks yang masing-masing mengandung satu benang pencetak asli dan satu benang baru. Arah replikasi DNA hanya paada C5 ke C3 sehingga hanya satu benang yang dapat direplikasi secara utuh dan benang antiparalelnya direplikasi sepotongsepotong kemudian disambung oleh ensim DNA-ligase. (Purnomo, 2004) Sifat Fisika DNA adalah DNA akan terpisah dari rantai komplemennya (denaturasi) pada suhu mendekati titik didih dan ph ekstrim (ph < 3 atau ph > 10) dan bisa bergabung kembali (renaturasi) pada suhu ± 60 0 C (Watson et al,1988). DNA menyerap sinar UV dengan panjang gelombang 260 nm (Sambrook et al, 1989) DNA Mitokondria Mitokondria merupakan organel sel yang berfungsi sebagai penghasil energi. Fungsi penting mitokondria adalah menerima substrat untuk metabolisme energi (asam lemak, piruvat, kerangka karbon dan asam amino) dari sitoplasma dan menghancurkan secara oksidatif bahan-bahan tersebut menjadi CO 2 dan H 2 O dan menghasilkan adenosin trifosfat (ATP). Dengan

30 13 demikian mitokondria disebut pembangkit tenaga bagi sel (Koolman et al, 2005). Keseluruhan mitokondria dalam satu sel mencapai hingga 25% volume sel. Mitokondria dikelilingi oleh dua membran yaitu membran dalam dan membran luar. Ruang antara membran dalam dan luar disebut ruang antar membran. Membran bagian dalam membentuk lipatan-lipatan yang disebut kristae dimana terdapat enzim-enzim oksidase Membran dalam juga memiliki permukaan yang besar yang mengelilingi ruang matriks. Matriks ini mengandung DNA, RNA, ribosom dan berbagai enzim yang berperan dalam oksidasi zat-zat makanan. (Koolman et al, 1994). Mitokondria memiliki perangkat genetik sendiri yaitu DNA mitokondria atau sering disingkat mtdna. Dengan bantuan DNAnya, mitokondria mempunyai kemampuan untuk mensintesis sendiri beberapa proteinnya. Namun bagian terbesar protein mitokondria disandi di dalam inti sel, kemudian disintesis pada ribosom yang bebas dalam sitoplasma dan diimpor ke dalam mitokondria (Koolman et al, 1994). Ukuran genom mitokondria minimum untuk berfungsinya mitokondria hewan multiseluler adalah pasang basa dari total ukuran yang berkisar hingga pasang basa. DNA mitokondria merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler. Ukuran DNA mitokondria relatif sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom intinya. (Solihin, 1994). DNA mitokondria hewan secara umum memiliki jumlah dan jenis gen yang sama yaitu 13 daerah yang mengkode protein (URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrome Oxidase unit I, Cytochrome Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase unit III, Cytochrome b dan ATPase 6); 2 gen pengkode rrna yaitu 12S rrna dan 16S rrna; 22 gen pengkode trna (Solihin, 1994).

31 14 Gambar 2.7. Struktur mtdna pada manusia (Sumber: Passarge, 2007) DNA mitokondria bersifat khusus yang diturunkan melalui induk betina tanpa mengalami rekombinasi. Adanya sifat tersebut dapat digunakan untuk suatu rekonstitusi historik dari genealogi matrilinier suatu spesies maupun antar populasi yang ada. Beberapa hal yang mendukung penggunaan mtdna sebagai penanda dalam studi keragaman genetik dan studi biologi populasi pada hewan yaitu (Solihin, 1994): 1. DNA mitokondria terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi. Jumlah kopi yang tinggi ini menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk berbagai keperluan analisis genom. 2. Ukuran DNA mitokondria relatif kecil (14-39 kb) sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh. 3. Bagian-bagian dari genom mitokondria berevolusi dengan kecepatan yang berbeda.

32 15 4. DNA mitokondria hewan tidak memiliki intron ataupun spacer yang berukuran besar antar gennya. 5. DNA mitokondria bersifat khusus karena diturunkan melalui induk betinanya tanpa mengalami rekombinasi (strict matertralinheritance). 6. DNA mitokondria sangat polimorf, baik untuk intrapopulasi maupun untuk interspesies Isolasi DNA Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik yang sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom eukariot berbentuk linier sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Gaffar, 2007). Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lain. Isolasi DNA dari organisme eukariot dilakukan melalui proses penghancuran membran sel (lisis), pemusnahan protein dan RNA, dan pemanenan DNA (Muladno, 2010). Membran sel dilisis dengan menambahkan buffer yang mengandung satu atau lebih deterjen, contohnya SDS (B), NP-40, atau Triton X-100 untuk membebaskan isinya. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat pengrusakan oleh detergen tersebut dibersihkan dengan cara sentrifugasi Kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protenase yang berfungsi untuk mendegragasi protein dan RNAse yang berfungsi untuk mendegragasi RNA, sehingga tertinggal hanyalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 0 C untuk menginaktivasi enzim yang mendegradasi DNA (DNAse). Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Gaffar, 2007). Namun, isolasi DNA kini lebih mudah dengan bantuan teknologi canggih yang menghasilkan isolat DNA dengan kemurnian tinggi, hasil yang cepat, dan penggunaan yang mudah (Saiyed, 2007). Saat ini banyak sekali produsen yang menyediakan berbagai kit isolasi DNA. Kit yang disediakan dapat dengan cepat dan mudah mengisolasi DNA genom dari beragam jenis sampel

33 16 termasuk darah, daging, kultur sel, sampel klinis (sputum, feses), jaringan hewan, ekor tikus, ragi dan banyak lagi (Roche d,2012) 2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR) Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. (Yusuf, 2010). DNA polymerase ini biasanya disintesis dari mikroorganisme yang hidup pada suhu panas, seperti Thermophilus aquaticus, sehingga enzim yang berasal dari mikroorganisme tersebut disebut Taq polymerase (Passarge, 2007). Dengan teknik ini sejumlah fragmen kecil DNA yang diinginkan akan diamplifikasi secara eksponensial sampai jutaan kali dalam beberapa jam (Sulistyaningsih, 2007). PCR digunakan untuk menggadakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycle (Muladno, 2010). Amplifikas DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA adalah suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA (Yusuf, 2010). PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA Primer yang berada sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dntps yang mencakup datp (nukleotida berbasa Adenin), dctp (sitosin), dgtp (guanin), dan dttp (Timin) (Muladno, 2010).

34 17 Gambar 2.8 Simulasi Proses PCR (Sumber: Yusuf, 2010) Komponen PCR Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah template DNA, sepasang primer oligonukleotida, DNA polymerase, deoksinukleosida trifosfat (dntp), dan larutan buffer (Yusuf, 2010; Muladno, 2010; Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007): 1. Template DNA Template DNA adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung sequen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan merupakan faktor utama keberhasilan PCR, berapapun panjangnya jika tidak mengandung sequen yang diinginkan maka tidak akan berhasil proses suatu PCR, namun sebaliknya jika ukuran DNA tidak terlalu panjang tapi mengandung sequen yang diinginkan maka PCR akan berhasil (Sulistyaningsih, 2007). DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara molekul. Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan

35 18 kuantitas atau konsentrasi (Yusuf, 2010). Jika konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan target dan jika konsentrasi terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian template karena akan mempengaruhi hasil reaksi (Sulistyaningsih, 2007). 2. Primer Susunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan PCR. Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung nukleotida dan mempunyai 45-60% GC content yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA (Yusuf, 2010). Sequen primer yang lebih pendek akan memicu amplifikasi produk PCR non spesifik. Ujung 3 primer penting dalam menentukan spesifisitas dan sensitivitas PCR. Ujung ini tidak boleh mempunyai 3 atau lebih basa G atau C, karena dapat menstabilisasi annealing primer non spesifik. Disamping itu ujung 3 kedua primer tidak boleh komplementer satu dengan yang lain, karena hal ini akan mengakibatkan pembentukan primer-dimer yang akan menurunkan hasil produk yang diinginkan. Ujung 5 primer tidak terlalu penting untuk annealing primer, sehingga memungkinkan untuk menambahkan sequen tertentu misalnya sisi restriksi enzim, start codon ATG atau sequen promoter (Sulistyaningsih, 2007). Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer (Gaffar, 2007) Spesifisitas PCR sangat tergantung pada suhu melting (Tm) primer, yaitu suhu dimana separuh jumlah primer annealing pada template. Tm kedua primer serupa (dalam C) dan diatas 60 0 C. Konsentrasi primer biasanya optimal pada 0,1-0,5 µm. Konsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan mispriming (penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk non spesifik serta meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya bila konsentrasi primer terlalu sedikit maka PCR menjadi tidak efisien sehingga hasilnya rendah (Sulistyaningsih, 2007).

36 19 3. DNA polymerase DNA polymerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerisasi DNA. Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Dalam perkembangannya, kini banyak digunakan enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi sehingga penambahan enzim tidak perlu dilakukan disetiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin (Gaffar, 2007). Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun Enzim polimerase Taq tahan terhadap pemanasan berulang-ulang karena akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder (Yusuf, 2010) Enzim Taq DNA polymerase terdiri atas dua macam yaitu enzim alami yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim rekombinan yang disintesis didalam sel bakteri Escherichia coli (Muladno, 2010). Enzim ini masih mempunyai aktivitas eksonuklease dari 5 ke 3 tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease dari 3 ke 5. Konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk PCR biasanya 0,5-2,5 unit. Kelebihan jumlah enzim mengakibatkan akumulasi produk non spesifik, sedangkan jika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produk yang diinginkan (Sulistyaningsih, 2007). 4. Deoxynucleotide Triphosphate (dntp) Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk sintesis DNA dalam proses PCR yang terdiri dari datp, dgtp, dctp, dan dttp. dntp mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi polimerasi (Yusuf, 2010). Konsentrasi dntp masing-masing sebesar µm dapat menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifisitas dan

37 20 ketepatan PCR. Konsentrasi masing-masing dntp harus seimbang untuk meminimalkan kesalahan penggabungan. Deoxynucleotide Triphosphate akan menurunkan Mg 2+ bebas sehingga mempengaruhi aktivitas polymerase dan menurunkan annealing primer. Konsentrasi dntp yang rendah akan meminimalkan mispriming pada daerah non target dan menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah. Oleh karena itu spesifisitas dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi dntp yang lebih rendah (Sulistyaningsih, 2007). 5. Larutan buffer Larutan buffer yang biasa digunakan untuk reaksi PCR umumnya mengandung 10 50mM Tris-HCl ph 8,3-8,8 (suhu 20 o C); 50 mm KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20 sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%; disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mm MgCl 2 (Yusuf, 2010). Optimalisasi konsentrasi ion Mg 2+ merupakan hal yang penting. Konsentrasi ion ini mempengaruhi beberapa hal yaitu annealing primer, suhu pemisahan untai template dan produk PCR, spesifisitas produk, pembentukan primer-dimer serta aktivitas dan ketepatan enzim Taq Polymerase. PCR harus mengandung 0,5-2,5 µm Mg 2+ dari total konsentrasi dntp. Konsentrasi yang lebih tinggi akan meningkatkan produk PCR tetapi menurunkan spesifisitasnya. Konsentrasi ion ini tergantung pada konsentrasi bahan-bahan yang mengikatnya seperti dntp, EDTA dan fosfat (Sulistyaningsih, 2007) Tahapan PCR Gambar 2.9 Siklus RT-PCR (Gaffar, 2007)

38 21 Berikut ini merupakan tahapan yang terjadi pada proses PCR (Yusuf, 2010: Muladno, 2010; Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007): 1. Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan (Gaffar, 2007). Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu C selama 3 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA yang ditargetkan ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. (Muladno, 2010). Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. (Yusuf, 2010). Untuk denaturasi berikutnya, waktu yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 95 0 C atau 15 detik pada suhu 97 0 C (Muladno, 2010). Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sequen target. Jika sequen target kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq polymerase. (Muladno, 2010; Sulistyaningsih, 2007). 2. Penempelan primer Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran basa, mengandung % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR (Yusuf, 2010). Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu C. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan

39 22 menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya (Gaffar, 2007). Suhu dan lamaya waktu yang dibutuhkan untuk annealing primer tergantung pada komposisi basa, panjang, dan konsentrasi primer (Sulistyaningsih, 2007). Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36 o C sampai dengan 72 o C, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara o C. (Yusuf, 2010) 3. Reaksi polimerisasi Umumnya reaksi polimerisasi (extension) atau perpanjangan rantai, terjadi pada suhu 72 0 C karena merupakan suhu optimum Taq polymerase. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3 nya dengan penambahan dntp yang komplemen dengan template oleh DNA polymerase (Gaffar 2007). Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72 0 C diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik, bergantung pada buffer, ph, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Dengan demikian, untuk produk PCR sepanjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap pemanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR, waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit, sehingga seluruh produk PCR diharapkan berbentuk DNA untai ganda (Muladno, 2010). 2.7 Real-time PCR Prinsip Analisis Real-Time PCR merupakan teknologi terkini untuk amplifikasi DNA. Pada Real-Time PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara seketika sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real-Time PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisisnya yang sensitif, spesifik dan reproducibility sehingga mengurangi kesalahan pada hasil (Burns et al, 2005).

40 23 Instrumen Real-Time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan double-stranded DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan. Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Vaerman, 2004). Gambar 2.10 Bentuk Kurva pada Real-Time PCR (Sumber: BioRad, 2006) Instrument Real-Time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan software sebagai analisis data. Real-Time PCR juga dapat menganalisis banyak sampel dalam waktu bersamaan menggunakan multiwell plates (Roche a, 2008).