Fakultas Biologi Unsoed

Transkripsi

1 TEKMK PCR oleh Drs. Agus Hery Susanto, M.S. staf pengajar Pendahuluan Teknik PCR (polymerase chain reaction) digunakan untuk menggandakan fragmen DNA (urutan basa nukleotida) tertentu secara invitro melalui reaksi polimerisasi DNA secara berulang-ulang selama beberapa siklus reaksi. Teknik yang ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1987 ini telah mengalami berbagai macam modifikasi dan penggunaannya meliputi ruang lingkup yang begitu luas. Komponen PCR Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3'-OH bebas yang berfungsi sebagai prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dntp (datp, dgtp, dctp, dttp), dan enzim DNA polimerase. DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer. Primer adalatr molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dntp ypng dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 9C). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Zaq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.

2 Tahapan PCR Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat, penempelan primer, dan polimerisasi primer, yong masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95oC, 50oC, dan 70"C. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forword primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung ke 3' etau berqrti dori ujung 3' ke untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA. Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2-2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya s:rma dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifftasi). Bisa dibayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saj4 maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak : : ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataanny4 hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atzs 20 untai ganda saj4 maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi , suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.

3 , DNA templat awal berupa DNA untai ganda J l***^i (-ss"c) $rn"*o"tan primer ft s oil primer maju -' 3' +# primer mundur at J. I pou.rrir^i primer (!70"C) ti. - at -'t. 5 Gambar 1. Putaran pertama PCR Perancangan Primer Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak- { tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertenfu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan. Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahuildipublikasikan. Sebagai contoh,

4 untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina, dan sebagainya, ymg sebelumnya telah diketahui. Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan basa primer. Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan- Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakan primer degenerate. selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna ( 1 00%). Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primerdimer akibat homologi sendiri (setf-homalog,,) atau homologi silang (cross-homotogt). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (7L) qrasing-masing primer dan kandungan GC-nya, sepasang primer yang baik harus mempunyai TnIangrelatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi.

5 , 3' -t 3, 3',., Fgmen pendek yang diinginkan 3' 3'. 5o Bg*"n pendek # y'angdiinginkan a) J a) J,- 3' Gambar 2. Hasil PCR putaran kedua dan ketiga Penutup Melalui teknik PCR dapat diperoleh sejumlah besar fragmen DNA tertentu dalam < waktu yang relatif singkat. Namun, keberhasilan amplifftasi dengan teknik PCR ditentukan oleh berbagai faktor terutama kompatibilitas primer oligonukleotida yang digunakan. Daftar Pustaks Alberts, 8., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Walter, P Molecular Biology of Fakultas the Cell 5tr Ed. Garland Biologi Science, New York. Unsoed Elliott, W.H. and Elliott, D.C Biochemistry and Molecular Biology 2d Ed. Oxford University Press, Oxford.

6 Lodish, H., Berk, A., Kaiser, c.a., Krieger, M., Scott, M,p., Bretscher, A., ploegh, H., and Matsudain.20a7. Molecular cell Biology 6th Ed. w.h. Freeman, New york. watson, J.D., Baker, T.A., Bell, s.p., Gann, A.A.F., Levine, M., and Losick, R.M Molecular Biology ofthe Gene 6ft Ed. Benjamin cummings, New york.