Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian Isolasi bakteri kitinolitik dari Sumber Air Panas Pengukuran Indeks kitinolitik Penentuan Isolat Terpilih Penentuan Waktu Produksi Enzim Kitinase Sampai hari ke-8 Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase dan Perhitungan Kadar Protein pada Produksi Enzim Kitinase Hari ke-4 Presipitasi Enzim Kitinase pada Beberapa Konsentrasi Amonium Sulfat Presipitasi Enzim Kitinase pada Konsentrasi 50% Amonium Sulfat (Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase dan Perhitungan Kadar Protein) Dialisis Penentuan suhu dan ph optimum Penentuan nilai K m dan V maks Identifikasi Isolat Terpilih berdasarkan Gen Penyandi 16S rrna
Absorbansi Lampiran 2. Kurva Standard N-Acetyl-D-Glukosamin (GlcNAc) GLcNAc Absorbansi (µgram) 0 0,6615 10 0,5685 20 0,5130 30 0,4590 40 0,3650 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = -0,007x + 0,6539 R² = 0,988 0 10 20 30 40 50 konsentrasi GlCNAc
Absorbansi Lampiran 3. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA) BSA (µgram) Abs terkoreksi 0 0 20 0.1355 40 0.2065 60 0.302 0 0.376 100 0.4465 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 y = 0,0044x + 0,0266 R² = 0,9877 0 20 40 60 80 100 Konsentrasi BSA
Lampiran 4. Pembuatan Larutan Schales Potasium Ferisianida 0,25 g Na 2 CO 3 26,4975 g Dilarutkan dalam 500 ml akuades Distirer Dituang ke dalam botol kaca Disimpan dalam kulkas
Lampiran 5. Uji Aktivitas Kitinase Modifikasi Spindler (1997) Substrat Sampel Kontrol Koloidal Kitin 0,3 % 300 μl 300 μl Penyangga fosfat 50 200 μl 200 μl mm Enzim 100 μl 0 μl Diinkubasi pada suhu 37 ᴼC selama 30 menit Keterangan Enzim yang setelah dipanaskan selama 10 menit Kontrol 100 μl Dididihkan 10 menit Disentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit Substrat Sampel Kontrol Blanko Campuran enzim diambil 300 μl 300 μl - Akuades 700 μl 700 μl 1000 μl Schales 1000 μl 1000 μl 1000 μl Vortex Dididihkan pada suhu 100 ᴼC selama 10 menit Didinginkan Diukur λ = 420 nm Hasil
Rumus : Aktivitas enzim = ((konsentrasi sampel konsentrasi blanko) (Konsentrasi kontrol konsentrasi blanko)) X 600 : Enzim Akhir X 1000 : Enzim awal X 1 : menit X 1 : BM kitinase. Total aktivitas enzim : aktivitas enzim (Unit/mL) x volume enzim (ml) Total protein : protein (mg/ml) x volume enzim (ml) Aktivitas spesifik Unit/mg = Total aktivitas enzim (Unit/mL) Total protein (mg/ml) Hasil % = Total aktivitas n X 100 Total aktivitas 0 Tingkat kemurnian (kali) = Aktivitas spesifik n Aktivitas spesifik 0
Lampiran 6. Metode Penentuan Kadar Protein (Bradford, 1976). Pereaksi Blanko (ml) Sampel (ml) Akuades 0,5 0 Enzim 0 0,5 Reagen Bradford 0,75 0,75 Divorteks Campuran diukur pada λ 595 nm
Lampiran 7. Komposisi Reagen Bradfrod & Pembuatan Ragen Bradford A. Larutan Stock Bradford Comassie Blue G-250 Etanol 95% H 3 Po 4 88% 70 mg 20 ml 40 ml Distirer Disaring dengan kertas saring B. Pembuatan Reagen Bradford 425 ml akuades 15 ml 95% Etanol 35 ml 88% fosfat 30 ml larutan Stock Distirer Disaring dengan kertas saring Dimasukkan dalam Botol Kaca Disimpan dalam kulkas
1/ V Lampiran 8. Perhitungan Parameter K m dan V maks 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 y = 0,0045x + 0,014 R² = 0,9769 0 5 10 15 1/s PERSAMAAN LINEAWER-BURK= 0.0045X + 0.014 1/V maks = 0.014 V maks = 71.4286 K m /V maks = 0.0045 K m = 0.3214 kemiringan= 0.0045 1/<s>= 0, 1/v 0, 0.0045 1/K m = 3.1 (-)1/K m, 1/v=0 (-)0.321,0
Lampiran 9. Data Hasil Sequencing Identifikasi Isolat JP2 dengan Menggunakan Gen Penyandi 16S rrna GGGGGCAAGGGGCTGCTCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG TAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATG CTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTTCA AGATGGACCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCG ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTC TGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTT GTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAA GCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGA TGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAG TGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGC GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG ATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTA AGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACC TTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGG GCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCA CTCTAAGGTGACTGCCCGGTGACAAACCCGAAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAA ATCATCATGGCCCCTTATGACCTGGGGCTACCCACCGGGTACAATGGGCAGAAC AAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTC GGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAT CAGCATGCGGGGGGGGGT