BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Hewan coba Metode Penelitian 1 Isolasi dan Produksi Antigen E/S Fasciola gigantica

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2009 hingga Februari Penelitian dilakukan di kandang pemeliharaan hewan coba Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (FKH IPB) dan Laboratorium Terpadu Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner (IPHK) FKH IPB. Hewan coba Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah ayam petelur ras Hysex Brown umur 24 minggu sebanyak 10 ekor. Ayam-ayam tersebut dipelihara secara individual di dalam kandang batere. Setiap ayam diperlakukan dengan kondisi yang sama, baik dari segi makan, minum, maupun kondisi kandang. Sebelum diberi perlakuan, ayam tersebut dilakukan pemeriksaan status parasit pencernaan menggunakan metode Mc Master. Hal ini untuk memastikan hewan coba bebas dari penyakit pencernaan akibat parasit yang dapat mempengaruhi produksi telur. Metode Penelitian 1 Isolasi dan Produksi Antigen E/S Fasciola gigantica Antigen yang digunakan untuk imunisasi dalam penelitian ini adalah antigen E/S Fasciola gigantiaca asal domba dan kerbau dari hasil penelitian Satrija (2009). F. gigantica dewasa dikoleksi dari hati kerbau di Rumah Potong Hewan (RPH) Kota Bekasi serta hati domba dari Tempat Pemotongan Hewan (TPH) di Empang-Kota Bogor. Antigen berupa E/S F. gigantica diproduksi dan diisolasi dari cacing dewasa menurut metode Satrija et al. (2007) yang dimodifikasi. Protein E/S F. gigantica yang didapat selanjutnya disimpan dalam tabung mikro volume 1.5 ml pada suhu -20 ºC sampai digunakan sebagai antigen untuk imunisasi ayam. 11

2 2 Pengukuran Kosentrasi Protein E/S Fasciola gigantica Konsetrasi protein E/S dihitung dengan metode Bradford menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang 590 nm. Metode Bradford digunakan secara luas untuk menghitung titer protein secara kuantitatif. Metode ini menggunakan pereaksi commasie briliant blue. Larutan standar protein yang digunakan adalah bovine serum albumin (BSA). Larutan Bradford yang terdiri dari 100 mg commasie briliant blue yang dilarutkan dalam 59 ml etanol 95% dan ditambahkan sebanyak 100 ml asam fosfat 85% (w/v), serta diencerkan dengan dua kali pengenceran terlebih dahulu dengan aquabides hingga volume larutan mencapai 1 liter, kemudian disaring. Setelah itu, 10 ml larutan Bradford yang telah diencerkan ditambahkan 90 ml aquabides menjadi 100 ml larutan yang merupakan larutan Bradford dengan dua kali pengenceran. Sebanyak 10 mg BSA dilarutkan dalam 10 ml aquabides hingga homogen. Sebelas buah tabung reaksi yang telah disterilisasi diisi dengan larutan larutan BSA dan aquabides sesuai dengan Tabel 1. Tabel 1 Tata cara pengisian larutan BSA Tabung Larutan BSA (µl) Aquabides (µl) Konsentrasi protein standar (µg/ml) Sebanyak 100 µl dari masing-masing tabung tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam tabung steril lainnnya sesuai urutan tabungnya. Masingmasing tabung yang telah berisi 100 µl BSA berbagai konsentrasi tersebut 12

3 selanjutnya ditambahkan 5 ml larutan Bradford. Kurva standar konsentrasi protein dibuat berdasarkan absorbansi dari masing-masing konsentrasi standar menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 590 nm. Protein E/S selanjutnya diambil 100 µl dan dimasukkan kedalam tabung reaksi serta ditambahkan larutan Bradford 5 ml. Larutan E/S tersebut kemudian dibaca konsentrasinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 590 nm. E/S yang telah diketahui konsentrasi proteinnya selanjutnya di-aliquot dalam tabung mikrobervolume 1 ml dan disimpan pada suhu -20 C sampai digunakan. 3 Imunisasi Ayam Coba Imunisasi dengan antigen E/S F. gigantica dilakukan terhadap 10 ekor ayam betina berumur 24 minggu dengan interval vaksinasi dua minggu sesuai dengan protokol Table 2. Penyuntikan antigen (imunisasi) pada ayam dilakukan melalui rute intravena dan subkutan dengan dosis 150 µg/ekor. Tabel 2 Tata cara penyuntikan antigen Kelompok Antigen Penyuntikan (minggu ke-) E/S F. gigantica asal Tanpa adjuvant FAC FAI FAI FAI domba 2 E/S F. gigantica asal kerbau Tanpa adjuvant FAC FAI FAI FAI Keterangan: Tanpa adjuvant (rute intravena) FAC = Freund s complete adjuvant (rute subkutan) FAI = Freund s incomplete adjuvant (rute subkutan) 4 Teknik Pengambilan Darah dan Pengumpulan Kuning Telur Pengambilan darah ayam dilakukan satu minggu setelah imunisasi ketiga melalui vena brachialis sebanyak 1.5 ml menggunakan spuit 3 ml. Darah yang dikoleksi diletakkan dengan posisi miring dan diinkubasi selama 30 menit sampai 1 jam pada suhu ruang. Darah tersebut selanjutnya disimpan dalam suhu 4 ºC selama 24 jam. Serum yang telah terbentuk selanjutnya dipanen dengan meletakkannya dalam tabung mikro dan disimpan dalam suhu -20 ºC hingga akan 13

4 digunakan. Seiring dengan pengambilan darah juga dilakukan pengumpulan telur ayam bila ada yang bertelur. Setiap butir telur diberi label nomor ayam dan tanggal pengeluaran telur. Kuning telur dari masing-masing telur yang dipanen dipisahkan dari putih telur lalu disimpan di freezer (refrigator -20 ºC) dan diberi tanda. 5 Pembuatan Antigen Telarut Antigen dan antibodi harus harus dapat berdifusi dengan baik dalam uji presipitasi menggunakan media agar. Difusi dalam media agar dapat terjadi bila komponen antigen tersebut dalam ukuran kecil sehingga mudah terlarut. Antigen E/S Fasciola gigantica agar dapat terlarut harus dipecah molekulnya agar menjadi ukuran molekulnya lebih kecil. Pemecahan molekul dilakukan menggunakan alat sonikator Bioruptor. E/S Fasciola gigantica sebanyak 2.5 ml dimasukkan ke dalam tabung sonifikasi lalu dimasukkan dalam sonikator Bioruptor yang berisi air bersuhu 4 ºC. Hal ini bertujuan untuk mendinginkan tabung dan mencegah kerusakan antigen karena panas yang ditimbulkan selama proses berlangsung. Proses sonikasi dilakukan selama 5 menit dengan frekuensi Hz. 6 Uji Agar Gel Presipitation Test (AGPT) Sebagai Uji Spesifitas Antigen Pengujian spesifitas Ig Y anti-e/s Fasciola gigantica dilakukan dengan uji presipitasi agar (AGPT) untuk melihat adanya presipitasi yang terjadi antara Ig Y anti-e/s F. gigantica dengan E/S F. gigantica yang diuji. Medium agar AGPT dibuat dari campuran 1 gram agarose, 50 ml PBS, ph 7.2 dan 50 ml aquadest. Campuran dipanaskan hingga mendidih, kemudian didinginkan sampai suhunya turun menjadi 60 C. Larutan agar lalu dituang ke gelas objek sebanyak 4 ml pada setiap slide-nya dan dibiarkan pada suhu ruang hingga agar memadat. Agar yang telah memadat dibuat lubang dengan menggunakan perforator agar. Antigen dan antibodi yang diuji diteteskan ke dalam masing-masing lubang yang telah ditentukan sebelumnya. Selanjutnya agar disimpan pada suhu kamar selama 24 jam. Garis presipitasi akan terbentuk bila dalam kuning telur atau serum terdapat antibodi yang homolog dengan antigen yang diujikan. 14

5 7 Pemurnian Ig Y dari Kuning Telur Kuning telur yang menunjukkan hasil positif pada uji AGPT, selanjutnya dimurnikan Ig Y-nya dari kuning telur menggunakan kit eggstract Ig Y (PROMEGA). Kuning telur dilarutkan dalam larutan Presipitat A sebanyak tiga kali volume kuning telur. Larutan tersebut diaduk dengan stire selama lima menit. Selanjutnya larutan tersebut disentrifuse pada kecepatan g pada suhu 4 ºC selama 15 menit. Lalu supernatan disaring dengan kasa steril 4 lapis. Filtrat hasil penyaringan ditambahkan larutan presipitat B dan diaduk. Selanjutnya disentrifuse pada kecepatan g pada suhu 4 ºC selama lima belas menit. Filtrate hasil sentrifugasi dibuang dan pellet hasil sentrifuse resuspensi dengan PBS sampai volume awal. Hasil dari proses ini merupakan Ig Y dengan kemurnian ± 60 %. Ig Y dengan kemurnian 90 % didapat apabila dilakukan dengan melakukan langkah yang sama sebanyak 2 kali. Hasil pemurnian tersebut merupakan Ig Y anti-e/s F. gigantica. Konsentrasi Ig Y dihitung dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan metode Bradford. 15