Lampiran 1. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengujian aktivitas enzim (Grossowicz et al., 1950) (a). Reagen A 1. 0,2 M bufer Tris-HCl ph 6,0 12,1 gr

Transkripsi

1 46

2 47 Lampiran 1. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengujian aktivitas enzim (Grossowicz et al., 1950) (a). Reagen A 1. 0,2 M bufer Tris-HCl ph 6,0 12,1 gr Tris base dilarutkan dalam 200 ml akuades, kemudian ditambah HCL sampai ph 6, ,1 M hydroxylamine 3,47 gr hydroxylamine dilarutkan dalam 100 ml akuades. 3. 0,01 M glutathione 1,54 gr glutathione dilarutkan dalam 100 ml akuades. 4. 0,2 N NaOH 100 ml 5. Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-glycine 100 mg CBZ-gln-gly dilarutkan dalam 0,2 N NaOH 2 ml, kemudian ditambahkan 1,0 N NaOH sampai benar-benar larut. Tambah 4 ml (1), 2 ml (2) dan 2 ml (3) dan diatur sampai ph-nya 6,0. (b). Reagen B 1. 3 N HCl 2. 12% TCA 3. 5% FeCl 3.6H 2 O (dilarutkan dalam 0,1 N HCl) Perbandingan antara HCL : 12% TCA : 5% FeCl 3.6H 2 O = 1:1:1.

3 48 Lampiran 2. Kurva standar untuk penentuan aktivitas enzim (Grossowicz et al., 1950) Konsentrasi L-glutamic acid γ-hydoximate (mg/ml) Volume L-glutamic acid γ-hydoximate (ml) , , , , , , , , , , Volume Miliq water (ml) Contoh perhitungan kadar protein enzim transglutaminase Diketahui : absorbansi sampel = 0,498 absorbansi blanko = 0,072 X = Y 0,024 0,374 Ditanyakan : kadar protein enzim transglutaminase Jawaban : x = sampel-blanko = 0,498-0,072 = 0,426 X = 0,426 0,024 0,374 X = 1, µmol/200 µl

4 49 Karena pada saat pengujian aktivitas enzim dilakukan inkubasi pada suhu 37 o C selama 10 menit, maka : 1, x 1 = 0, µmol/200 µl/menit 10 Agar mendapatkan satuan aktivitas enzim tanpa angka, maka : 0, µmol/200 µl/menit x 5 = 107, µmol/µl/menit Jadi, aktivitas enzim transglutaminase yang dihasilkan sebesar 107, µmol/µl/menit.

5 50 Lampiran 3. Prosedur untuk pengukuran konsentrasi protein (metode Lowry) Perekasi Sampel (µl) Blanko (µl) Enzim Miliq water Pereaksi Lowry Inkubasi pada suhu kamar selama 15 menit Pereaksi Folin Inkubasi pada suhu kamar selama 45 menit Ukur absorbansinya dengan panjang gelombang 540 nm (a). Pembuatan Pereaksi Lowry (Lowry A : Lowry B : Lowry C = 20:1:1) Total pereksi lowry yang dibutuhkan = 900 µl x 1 x 2 x 2 = µl = 3,6 ml (untuk 1 sampel yang dibuat duplo) Lowry A: 100 gr Na 2 CO 3 dalam 1 L NaOH 0,5 mmol/ml Volume Lowry A = 20 x 3,6 ml = 3,2727 ml (dilebihkan 4 ml) 22 Berat NaOH yang dibutuhkan = M NaOH x V lowry A x Mr NaOH = 0,5 M x 0,004 L x 40 = 0,08 gr NaOH Jadi, 0,08 gr NaOH dilarutkan dalam 4 ml miliqi water Berat Na 2 CO 3 yang dibutuhkan = 100 gr Na 2 CO 3 (I) x 4 ml NaOH (II) 1000 ml NaOH (I) = 0,4 gr Na 2 CO 3 Jadi, 0,4 gr Na 2 CO 3 dilarutkan dalam 4 ml NaOH 0,5 mmol/ml Lowry B : 0,5 gr NaK tartrat dalam 25 ml miliq water Volume Lowry B = 1 x 3,6 ml = 0,1636 ml (dilebihkan 2 ml) 22 Berat NaK tartrat yang dibutuhkan = 0,5 gr NaK tartrat (I) x 2 ml miliq water (II) 25 ml miliqi water (I) = 0,04 gr NaK tartrat Jadi, 0,04 gr NaK tartrat dilarutkan dalam 2 ml miliq water Lowry C : 0.25 gr CuSO 4.5H 2 O dalam 25 ml miliq water Volume Lowry B = 1 x 3,6 ml = 0,1636 ml (dilebihkan 2 ml) 22

6 51 Berat CuSO 4.5H 2 O yang dibutuhkan = 0,25 gr CuSO 4.5H 2 O (I) x 2 ml miliqi (II) 25 ml miliq water (I) = 0,02 gr NaK tartrat Jadi, 0,02 gr NaK tartrat dilarutkan dalam 2 ml miliq water (b). Pembuatan Pereksi Folin (Folin : Miliq water = 1:10) Total perekasi folin yang dibutuhkan = µl x1 x 2 x 2 = 12 ml (untuk 1 sampel yang dibuat duplo) Folin pekat yang dibutuhkan = 1 x 12 ml = 1,0909 ml (dilebihkan 2 ml) 11 Miliq water yang dibutuhkan = 10 x 12 ml = 10,9090 ml (dilebihkan 20 ml) 11

7 52 Lampiran 4. Kurva standar untuk penentuan konsentrasi protein Konsentrasi BSA (mg/ml) Volume BSA (ml) Volume Miliq water (ml) , , , , , , , , Contoh perhitungan kadar protein enzim transglutaminase Diketahui : absorbansi sampel = 0,147 absorbansi blanko = 0,012 Y = 0,2177 X + 0,0865 Ditanyakan : kadar protein enzim transglutaminase Jawaban : x = sampel-blanko = 0,147-0,012 = 0,135 Y = 0,2177 x 0, ,0865 Y = 0,

8 53 Karena dilakukan pengenceran dengan perbandingan 1:9, maka : 0, x 10 = 1, mg/100 µl 1, mg x 1000 µl = 11,58895 mg/ml 100 ml 1 ml Jadi, kadar protein enzim transglutaminase yang dihasilkan sebesar 11,58895 mg/ml.

9 54 Lampiran 5. Hasil uji pengaruh konsentrasi limbah cair surimi terhadap aktivitas enzim dengan menggunakan SPSS Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:respon Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig. Model a perlakuan Error Total a. R Squared =,921 (Adjusted R Squared =,842) respon Tukey HSD a,,b Subset perlakuan N 1 2 kontrol lcs 50% lcs 25 % lcs 75 % lcs 100 % Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) =,083. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2,000. b. Alpha =,05.

10 55 Lampiran 6. Hasil pengujian aktivitas enzim transglutaminase a). Aktivitas dari enzim transglutaminase yang dihasilkan dari media substitusi dengan penambahan limbah cair surimi Hari ke- Aktivitas TGase (unit/ml) Kontrol LCS 25% LCS 50% LCS 75% LCS 100% , ,072 0,151 0,173 0,151 0, ,960 0,384 0,439 0,379 0, ,018 0,425 0,401 0,534 0, , ,482 0, ,379 0,361 0,571 0, ,611 0,483 0,772 0, ,550 0,499 0,597 0,861 b). Pengaruh ph terhadap aktivitas enzim transglutaminase Jenis Bufer ph Aktv. TGase (unit/ml) Aktivitas realtif (%) Asam asetat 4 0,390 65,43 5 0,400 67,23 6 0,447 75,08 Tris-HCl 6 0,476 79,91 7 0,471 79,12 8 0, Asam borat 8 0,515 86,42 9 0,550 92,37 c). Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim transglutaminase Suhu ( o C) Aktv. TGase (unit/ml) Aktivitas realtif (%) ,461 54, ,559 65, , ,377 44, ,340 39,98 d). Pengaruh ketahanan panas terhadap aktivitas enzim transglutaminase Aktivitas TGase (unit/ml) Waktu pemanasan (menit) 37 o C 50 o C 60 o C 0 1, , , , , , , , , , , , , , ,

11 56 e). Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim transglutaminase Ion logam (1 mm) Aktv. TGase (unit/ml) Aktivitas relatif (%) Kontrol 0, Na + 0, ,26 K + 0, ,31 Li + 0, ,84 Cu + 0, ,06 Ca 2+ 0, ,41 Zn Mg 2+ 0,688 80,22 Fe 3+ 0,750 87,46 f). Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim transglutaminase Inhibitor Konsentrasi (mm) Aktv. TGase (unit/ml) Aktivitas relatif (%) Kontrol 1, PMSF 1 1,063 97,43 5 0,895 81,99 EDTA 1 1,079 98,89 5 0,989 90,63

12 Lampiran 7. Kadar protein dan aktivitas spesifik enzim transglutmainase dengan penambahan konsentrasi limbah cair surimi berbeda 57

13 58 Lamapiran 8. Komposisi bahan yang digunakan untuk melakukan SDS-PAGE A. Stock solutions 1). 2 M Tris-HCl (ph 8,8), 100 ml a. timbang 24,2 gram Tris b. tambahkan 50 ml H 2 O c. tambahkan HCl sedikit-sedikit sampai ph 8,8 (sekitar 4 ml) d. tambahkan H 2 O sampai volume total 100 ml 2). 1 M Tris-HCl (ph 6,8), 100 ml a. timbang 12,1 gram Tris b. tambahkan 50 ml H 2 O c. tambahkan HCl sedikit-sedikit sampai ph 6,8 (sekitar 8 ml) d. tambahkan H 2 O sampai volume total 100 ml 3). 10% (w/v) SDS, 100 ml a. timbang 10 gram SDS b. tambahkan H 2 O sampai volume total 100 ml 4). 50% (w/v) gliserol, 100 ml a. ambil 50 ml 100% gliserol b. tambahkan 50 ml H 2 O 5). 1% (w/v) bromofenol blue, 10 ml a. timbang 100mg bromofenol blue b. tambahkan 10 ml H 2 O dan stirrer sampai larut 6). Coomassie gel stain, 200 ml a. 0,2 gram coomassie blue R-250 b. 450 ml methanol c. 90 ml H 2 O d. 100 ml asam asetat glasial 7). Coomassie gel destain, 500 ml a. 50 ml methanol b. 50 ml asam asetat glasial c. 400 ml H 2 O B. Working solutions 1). Larutan A (Acrylamide stock solution), 100 ml a. 29,2 gram akrilamid b. 0,8 gram bis-akrilamid c. tambahkan 100 ml H 2 O dan stirrer sampai benar-benar larut 2). Larutan B (4x Separating gel bufer), 100 ml a. 75 ml 2 M Tris-HCl (ph 8,8) b. 4 ml 10% SDS c. 21 ml H 2 O 3). Larutan C (4x Stacking gel bufer), 100 ml a. 50 ml 1 M Tris-HCl (ph 6,8) b. 4 ml 10% SDS c. 46 ml H 2 O

14 4). 10% ammonium persulfat, 5 ml a. 0,5 gram ammonium persulfat b. 5 ml H 2 O 5). Bufer elektroforesis, 1 liter (ph kira-kira 8,3) a. 3 gram Tris b. 14,4 gram glisin c. 1 gram SDS d. tambah H 2 O sampai total volume 1 liter 6). 5x Bufer sampel a. 0,6 ml 1 M Tris-HCl (ph 6,8) b. 5 ml 50% gliserol c. 2 ml 10% SDS d. 0,5 ml 2-merkaptoetanol e. 1 ml 1% bromofenol blue f. 0,9 ml H 2 O 59

15 60 Lampiran 9. Kurva standar SDS-PAGE Marker BM Log BM A (cm) B (cm) Rf (A/B) (Dalton) Phosphorylase B ,9867 1,3 7,1 0,1830 Albumin ,8195 2,2 7,1 0,3098 Ovalbumin ,6532 3,7 7,1 0,5211 Carbonic anhydrase ,4771 4,8 7,1 0,6760 Trypsin inhibitor ,3031 5,9 7,1 0,8309 α-lactabumin ,1583 6,4 7,1 0,9014 Keterangan : A = Jarak band dari sumuran B = Panjang gel sesudah di running Misal : X = Nilai dari Rf Y = Log BM Sehingga diperoleh persamaan linear : Y= -1,0908X + 5,1885 Dari persamaan tersebut, dapat dihitung berat molekul sampel sebagai berikut: 1). A = 1,4 cm, B = 7,1 cm, Rf = 0,1971 cm BM = 94,0 kda 2). A = 3,8 cm, B = 7,1 cm, Rf = 0,5352 cm BM = 40,2 kda 3). A = 6,4 cm, B = 7,1 cm, Rf = 0,9014 cm BM = 16,0 kda Contoh perhitungan : Diketahui : Jarak band ke-2 dari sumur (A) = 3,8 cm Panjang gel sesudah di running (B) = 7,1 cm Ditanyakan : Berat molekul pada band ke-2 Jawab : Rf = 3,8 = 0,5352 cm dimisalkan X 7,1 Sehingga dapat didapatkan nilai berat molekul pada band ke-2 dengan cara memasukan ke dalam persamaan linear Y= -1,0908X + 5,1885 adalah sebagai berikut : Y= -1,0908 (0,5352) + 5,1885 Y = 40243,11125 Dalton dibulatkan menjadi 40,2 kda