METODE. Waktu dan Tempat Penelitian

Transkripsi

1 2 dalam menurunkan kadar glukosa dalam darah, selain itu daun anggrek merpati juga memiliki kandungan flavonoid yang tinggi, kandungan flavonoid yang tinggi ini selain bermanfaat sebagai antidiabetes juga berpotensi sebagai antioksidan, antiinflamasi dan antikanker (Kumar et al. 2011). Tujuan penelitian ini adalah mengetahui pengaruh ekstrak daun (Dendrobium crumenatum Sw.) terhadap aktivitas antioksidan, aktivitas inhibisi enzim α glukosidase dan toksisitasnya secara in vitro dengan menggunakan tiga jenis pelarut yaitu air, etanol dan heksan. Penelitian ini diharapkan mampu memberi informasi ekstrak daun anggrek merpati terhadap aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase, aktivitas antioksidan serta potensinya sebagai senyawa yang bersifat toksisitas pada larva udang Artemia salina Leach dengan pelarut yang terbaik, sehingga dapat dieksplorasi lebih lanjut sebagai suatu sumber tanaman obat. METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan selama 3 bulan dari bulan Februari sampai dengan April Tempat pelaksanaan program ini di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi, gelas piala, rotavapor, shaker, labu Erlemeyer, pipet tetes, pipet Mohr, pipet volumetrik, oven, cawan porselin, penjepit kayu, penjepit besi, neraca analitik, batang pengaduk, Elisa, Spektrofotometer Serapan Atom, eksikator, lampu UV, corong pisah, jarum suntik, gelas ukur, cawan penguap, dan mesin penghalus. Bahan-bahan yang digunakan, yaitu tanaman anggrek merpati, etanol 70%, akuades, HCl, ammonia, kloroform, pereaksi Dragendroff, pereaksi Mayer, NaOH, NaCH 3 COO, enzim α-glukosidase, p-nitrofenil α-d-glukopiranosida, KH 2 PO 4, metanol 30 %, H 2 SO 4, FeCl 3, telur udang Artemia salina, air, kertas saring, alkohol teknis, Prosedur Analisis Data Ekstraksi Daun Anggrek Merpati (Depkes 2002) Daun angrek merpati dibersihkan kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 50 C selama empat hari. Daun yang sudah dikeringkan, dipisahkan dari pengotornya, kemudian diserbukkan dengan cara diblender dan diayak dengan ukuran 100 Mesh sehingga diperoleh serbuk daun anggrek merpati kemudian disimpan. Pembuatan ekstrak daun anggrek merpati dilakukan dengan metode maserasi. Simplisia angrek merpati yang sudah ditimbang sebanyak 20 g, direndam selama 2 x 24 jam dalam 200 ml pelarut yaitu etanol 96%, dan Heksan

2 didalam gelas Erlemeyer 250 ml, sambil di goyang. Hasil maserasi diukur filtratnya lalu dilakukan evaporasi pada suhu 60 C selama 15 menit untuk menguapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstrak kental (pasta). Sedangkan dengan pelarut akuades serbuk anggrek merpati ditimbang sebanyak 25 g kemudian ditambahkan air sebanyak 250 ml lalu direbus selama 6 jam pada suhu 50 C. Setelah itu, larutan tersebut disaring untuk mendapatkan ekstrak air anggrek merpati. Penentuan kadar air (Depkes 2002) Cawan porselen dikeringkan selama 3 jam dalam oven pada suhu 105 C, lalu didinginkan dalam eksikator selama 1 jam kemudian bobot cawan ditimbang (a). Sebanyak 5 g sampel ditimbang (b), lalu dimasukkan ke dalam cawan porselen dan dikeringkan dalam oven selama 4-6 jam pada suhu 105 C. Setelah itu, didinginkan dalam eksikator dan ditimbang kembali (c). Pengukuran kadar air diulang sampai 3 kali, hingga dicapai bobot konstan, dan dihitung kadar airnya. Adapun rumus penentuan kadar air sebagai berikut: % Bobot kering (BK) = x100% % Kadar air = %BK Penapisan Fitokimia (Harborne 1987) Penapisan fitokimia terhadap daun anggrek merpati dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa bioaktif daun tersebut. Pengujian yang dilakukan diantaranya adalah uji flavonoid, uji alkaloid, uji tanin, uji triterpenoid dan steroid, serta uji saponin. Pengujian senyawa bioaktif yang terkandung dalam daun anggrek merpati ini mengacu pada metode Harborne Uji flavonoid. Tabung reaksi disiapkan dan diisi dengan 0.1 g ekstrak dan ditambahkan 2 ml etanol 90%. Campuran tersebut dikocok hingga homogen dan dipanaskan pada suhu 100ºC selama 5 menit. Larutan didinginkan dan ditabahkan larutan H 2 SO 4 pekat. Perubahan warna diamati. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya perubahan menjadi warna merah. Metode tersebut diulangi dengan menggunakan 1 ml ekstrak daun anggrek merpati yang telah diencerkan. Uji alkaloid. Ekstrak daun anggrek merpati sebanyak 0.5 g dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml HCl 1%. Larutan dikocok hingga homogen. Larutan disaring dengan kertas saring. Filtrat yang diperoleh ditambahkan dengan 1 ml H 2 SO 4. Larutan dibagi menjadi tiga bagian. Bagian pertama ditambahkan 1 ml pereaksi Dragendrof. Bagian kedua ditambahkan 1 ml pereaksi Meyer. Bagian ketiga ditambahkan 1 ml peraksi Wagner. Uji tanin. Sebanyak 1 g ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml akuades. Kocok larutan hingga homogen. Larutan dipanaskan pada suhu 100ºC selama 5 menit. Larutan didinginkan dan ditambahkan larutan FeCl 3 1% sebanyak 5 ml. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi biru tua. Uji saponin. Ekstrak daun anggrek merpati dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 0.5 g. Akuades ditambahkan ke dalamnya sebanyak 5 ml dan dikocok. Larutan dipanaskan selama 5 menit pada suhu 100ºC. Larutan didinginkan dan dikocok selama 10 menit. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya busa yang tidak hilang selama pengocokan. 3

3 4 Uji terpenoid dan steroid. Sebanyak 0.1 g ekstrak daun anggrek merpati dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml etanol 30%. Larutan dikocok dan dipanaskan pada 100ºC selama 5 menit. Larutan didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh diuapkan. Filtrat diencerkan dengan 1 ml eter. Larutan dibagi menjadi dua. Larutan ditambahkan dengan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat. Hasil positif ditunjukkan dengan warna merah untuk terpenoid dan biru atau hijau untuk steroid. Uji antioksidan (Bintang M 2009) Persiapan standar. Standar yang dipakai pada penelitian ini ialah asam askorbat. Serbuk asam askorbat ditimbang sebanyak gram. Serbuk ini dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades dimasukkan pula ke dalam labu ukur tersebut hingga tanda tera 100 ml. Labu tersebut ditutup dengan alumunium foil dan dikocok vertikal hingga homogen. Larutan standar asam askorbat sediaan dengan konsentrasi 50 ml siap diencerkan. Larutan asam askorbat yang digunakan sebagai standar konsentrasinya yaitu 10 μg/ml, 7.5 μg/ml, 5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1 μg/ml, dan 0.5 μg/ml. Persiapan reagen DPPH. Serbuk reagen DPPH sebanyak gram ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Akuades dimasukkan pula ke dalam labu ukur 50 ml. Labu tersebut ditutup dengan alumunium foil dan diultrasonikasi selama 30 menit hingga homogen. Larutan reagen DPPH 100 μg/ml siap digunakan. Uji antioksidan metode DPPH. Sebanyak 100 μl ekstrak sampel/standar diletakkan ke dalam plat mikro. Kemudian reagen DPPH 100 μg/ml sebanyak 100 μl ditambahkan kedalam plat mikro tersebut. Campuran dikocok hingga homogen inkubasi larutan uji di ruang yang gelap selama 90 menit. Absorbansi dibaca dengan microplat reader pada panjang gelomabang 517 nm (Bintang M 2009) Aktivitas Inhibisi α-glukosidase (Saraswaty 2010) Pengujian inhibisi α-glukosidase dilakukan dengan modifikasi metode Saraswaty (2010). Pengujian terhadap inhibisi aktivitas enzim α-glukosidase menggunakan substrat p-nitrofenil-α-d-glukopiranosida (p-npg) dan enzim α- glukosidase. Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1.0 mg enzim α- glukosidase dalam larutan bufer fosfat (ph 7) yang mengandung 200 mg serum bovin albumin. Sebelum digunakan enzim diencerkan 25 kali dengan bufer fosfat ph 7. Sampel ekstrak daun anggrek merpati masing-masing dilarutkan dalam DMSO dengan konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62.5, μg/ml. Pengujian aktivitas inhibisi enzim α glukosidase dengan mereaksikan sampel ekstrak daun anggrek merpati, enzim α-glukosidase dan substrat p-npg. Penghentian reaksi enzim substrat dilakukan dengan penambahan Na 2 CO mm. Sistem reaksi seperti pada Tabel 1 disiapkan pada microplate. Larutan kemudian diukur absorbansinya menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 400 nm. Percobaan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Tablet akarbosa (Glukobay) digunakan sebagai kontrol positif. Akarbosa dilarutkan dalam buffer posfat dan HCl 2 N (1:1) dengan konsentrasi 1% (b/v) kemudian disentrifus. Supernatan diambil sebanyak 1 μl dan dimasukkan ke

4 dalam campuran reaksi seperti dalam sampel ekstrak. Daya inhibisi enzim α- glukosidase dapat dinyatakan dalam % daya inhibisi, dengan rumus sebagai berikut : Daya inhibisi (%) = [ ] [ ) [ ] ] [ ] Keterangan : C : kontrol negatif S0 : campuran tanpa enzim S1 : campuran enzim-substrat dengan ekstrak Tabel 1 Sistem reaksi inhibisi α-glukosidase x 100 % Blanko C S0 S1 Ekstrak (μl) DMSO (μl) Bufer (μl) Substrat Inkubasi 37 0 C, 5 menit Bufer (μl) Enzim (μl) Inkubasi 37 0 C, 30 menit Na 2 CO Keterangan : Blanko : Sistem reaksi tanpa adanya ekstrak dan enzim C : campuran tanpa ekstrak 20 S0 : campuran dengan enzim, namun tanpa ekstrak S1 : campuran dengan enzim dan ekstrak Uji Toksisitas dengan Metode BSLT(Meyer et al.1982) Pengujian sitoksisitas pada sampel dilakukan dengan menggunakan metode Meyer (1982). Telur larva udang A. salina L dimasukkan ke dalam sebuah wadah yang bersekat dua dengan salah satu sisi tertutup aluminium foil berisi air laut secukupnya. Wadah tersebut diletakkan dibawah UV, setelah 48 jam telur akan menetas menjadi larva. Larutan uji ekstrak kasar daun anggrek merpati etanol, air dan n-heksan, dilarutkan dalam air laut dengan konsentrasi setelah pengenceran masing-masing menjadi 20, 10, dan 2 μg/ml. Sampel nonpolar yang kurang larut dilarutkan dengan ditambahkan DMSO. Setelah 48 jm inkubasi, sebanyak 100 μl air laut (berisi ekor larva udang) dimasukkan ke dalam botol uji begitu pula dengan larutan uji dengan konsentrasi dalam tiap botol menjadi 10, 5, dan 1 2 μg/ml. Sebagai kontrol digunakan air laut yang berisi ekor larva udang tanpa penambahan sampel atau larutan uji dengan konsentrasi yang sama. Setelah didiamkan selama 24 jam, larva udang yang masih hidup dan sudah mati dihitung jumlahnya. Data pengujian BSLT dianalisis berdasarkan perhitungan jumlah larva yang mati dan yang masih hidup. Tingkat kematian atau % mortalitas diperoleh dengan cara membandingkan antara jumlah larva yang mati dengan jumlah total larva. Nilai LC50 diperoleh dengan cara menghitung dengan menggunakan rumus y = a + bx. Nilai y menyatakan larva udang yang mengalami kematian sejumlah 50% setelah diinkubasi selama 24 jam. Nilai a dan b diperoleh dengan perhitungan menggunakan regresi linier berdasarkan data dari ketiga titik 5

5 6 konsentrasi yang digunakan. Nilai x yang diperoleh merupakan konsentrasi larutan yang menyebabkan kematian terhadap 50% larva udang. Ekstrak dinyatakan aktif apabila nilai LC50 lebih kecil dai 1000 μg/ml. HASIL Kadar Air Daun Anggrek Merpati Hasil pengukuran kadar air simplisia daun Anggrek merpati asal Bogor dari tiga kali ulangan yaitu ulangan 1, 2 dan 3 mendapatkan hasil berturut-turut sebesar 3.42%, 3.32% dan 3.22% dan mendapatkan rata-rata sebesar 3.32% (data dan perhitungan pada Lampiran 2). Rendemen Ekstrak daun Anggrek Merpati Hasil pengukuran rendemen ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut etanol, heksan dan air (Gambar 2) mendapatkan rendemen berkisar antara 1.98% hingga 15.77%. Rendemen tertinggi terdapat pada ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut etanol (15.77%), sedangkan rendemen terendah terdapat pada ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut heksan (1.98%) (data dan perhitungan pada Lampiran 3). Rendemen (%) Etanol Heksan Air Ekstrak Daun Anggrek Merpati Gambar 2. Rendemen ekstrak daun anggrek merpati Hasil uji Fitokimia Ekstrak Daun Anggrek Merpati Hasil uji fitokimia ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut etanol, heksan dan air pada (Gambar 3) menunjukkan bahwa pelarut yang paling banyak melarutkan senyawa senyawa fitokimia adalah pelarut etanol yaitu senyawa flavonoid, saponin, tanin, dan steroid, sedangkan pelarut yang paling sedikit melarutkan senyawa fitokimia adalah pelarut heksan yaitu hanya senyawa steroid. Gambar hasil fitokimia dapat dilihat pada Lampiran 7.