LAMPIRAN. Lampiran 1. Komposisi Media Bushnell-Haas, Larutan Standar Mc. Farland, Larutan Orsinol

Transkripsi

1 LAMPIRAN Lampiran 1. Komposisi Media Bushnell-Haas, Larutan Standar Mc. Farland, Larutan Orsinol a. Komposisi Media Bushnell-Haas per liter (Atlas, 1946) 1) KH 2 PO 4 = 1,0 g 5) FeCl 3 = 0,05 g 2) K2HPO 4 = 1,0 g 6) CaCl 2. 2H 2 O = 0,02 g 3) NH4NO 3 = 1,0 g 7) Agar = 20 g 4) MgSO4.7H 2 O = 0,2 g Kemudian semua komposisi ini dilarutkan dengan air laut steril sebanyak 1 liter dan disterilkan dengan autoclave. b. Komposisi Larutan Mc. Farland Sebanyak 0,5 ml BaCl 2 0,048 M ditambahkan ke dalam 99,5 ml H 2 SO 4 0,35 N. Kemudian divorteks hingga homogen. c. Komposisi Larutan Orsinol (Koch et al., 1991) Sebanyak 100 mg orsinol dilarutkan dalam 100 ml H 2 SO 4 53%, kemudian didiamkan selama 12 jam hingga warna kuning sempurna. d. Insektisida Marshal 200 EC Komposisi: Karbosulfan = 200,11 g/l Surfaktan sintetik

2 Lampiran 2. Alur Kerja Isolasi Bakteri Tanah dimasukkan ke dalam plastik steril diencerkan hingga konsentrasi 10-2 Hasil Pengenceran diinokulasikan sebanyak 0,1 ml ke media Bushnell- Hass Agar (BHA) yang mengandung 12 ppm karbosulfan dengan merek dagang Marshal diinkubasi pada suhu 33 0 C selama hari Hasil dimurnikan koloni yang berbeda pada media Tripton Soya Agar

3 Lampiran 3. Alur Kerja Karakterisasi Morfologi dan Sifat Biokimia Bakteri (Cappuccino and Sherman, 1983; Lay, 1994) Isolat Bakteri Karakterisasi Morfologi Pewarnaan Gram Uji Biokimia Bentuk koloni Warna koloni Elevasi koloni Tepi koloni Bentuk sel Penataan sel Uji motilitas Uji sitrat Uji hidrolisa pati Uji katalase Uji sulfida Uji gelatin Hasil

4 Lampiran 4. Alur Kerja Estimasi Jumlah Isolat Bakteri dengan Metode Standard Plate Count (SPC) Isolat Bakteri 1 ml Biakan Bakteri Hasil Dibuat dalam bentuk suspensi yang setara dengan kekeruhan larutan Mc-Farland ( 10 8 sel/ml) Diinokulasikan sebanyak 2 ml ke 100 ml media BHB mengandung 12 ppm karbosulfan dengan merek dagang Marshal Diinkubasi pada waterbath shaker dengan kondisi gelap, kecepatan 150 rpm pada suhu 30 0 C selama 21 hari diencerkan hingga konsentrasi 10 diinokulasikan ke media Plate Count Agar dengan metode cawan sebar diinkubasi selama 24 jam dihitung jumlah koloni yang tumbuh -7

5 Lampiran 5. Alur Kerja Screening Aktivitas Biosurfaktan Metode Drop Collapsing Test (Jain, et al., 1991) yang Dimodifikasi Isolat Bakteri dibuat dalam bentuk suspensi yang setara dengan kekeruhan larutan Mc-Farland ( 10 8 sel/ml) diinokulasikan sebanyak 2 ml ke 100 ml media Bushnell-Haas Broth (BHB) yang mengandung 2% dekstros diinkubasi pada shaker dengan kondisi gelap, kecepatan 150 rpm pada suhu 30 o C selama 15 hari Biakan Bakteri disaring dengan kertas saring Filtrat Residu diambil sebanyak 4 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambah 4 ml N-heksan ditambah 2 ml akuades divorteks selama 10 detik diukur ketebalan emulsi yang terbentuk dengan jangka sorong Hasil

6 Lampiran 6. Alur Kerja Pembuatan Kurva Standar Biosurfaktan Rhamnosa Absorbansi Dilarutkan dengan larutan sodium bikarbonat (NaHCO 3 ) 0,05 M dengan konsentrasi 0 (blanko), 10 ppm, 50 ppm, 100 ppm dan 200 ppm Dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml Dihomogenkan dengan vorteks Ditambahkan 3,6 ml orsinol Dipanaskan hingga mendidih Didinginkan selama 15 menit pada temperatur kamar Diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 421 nm Ditentukan persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa dengan memplot absorbansi dan konsentrasi rhamnosa dengan metode Least Square Kurva Standar Biosurfaktan

7 Lampiran 7. Alur Kerja Produksi Biosurfaktan Metode Orsinol yang Dimodifikasi Isolat Bakteri Biakan Bakteri Dibuat dalam bentuk suspensi yang setara dengan kekeruhan larutan Mc-Farland ( 10 8 sel/ml) Diinokulasikan sebanyak 2 ml ke 100 ml media BHB mengandung 12 ppm karbosulfan dengan merek dagang Marshal Diinkubasi pada waterbath shaker dengan kondisi gelap, kecepatan 150 rpm pada suhu 30 0 C selama 21 hari Disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit Supernatan Pellet Diambil sebanyak 4 ml Diekstrak dengan 2 ml dietileter selama 5 menit Diulangi sampai 3 kali Lapisan Ether Hasil Lapisan Bawah Dikeringkan Dilarutkan kembali dalam 2 ml NaOHCO 3 0,05 M Dihomogenkan dengan vorteks Ditambahkan 3,6 ml larutan orsinol Dipanaskan hingga mendidih Didinginkan selama 15 menit pada temperatur kamar Diukur absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 421 nm

8 Lampiran 8. Penentuan Kurva Standar Biosurfaktan No Konsentrasi Rhamnosa (ppm) Absorbansi , , , ,134 Absorbansi 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Kurva Standar Biosurfaktan Y= 0, ,005x Konsentrasi Biosurfaktan (ppm) Untuk menentukan persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa digunakan metode Least Square, nilai konsentrasi rhamnosa dimasukkan sebagai nilai X dan absorbansi sebagai nilai Y. Tabel persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa metode Least Square, 2 No X Y X Y XY , ,0238 1, , , , , , , , , ,8 n= 4 X= 360 Y= 2,157 X 2= Y = 1,7040 XY= 296,70 X= 90 Y= 0,539 2 Untuk mencari nilai R (regresi), masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut:

9 XY ( X)( Y) n R = R= 0,9812 X 2 ( X) 2 n Y2 ( Y) 2 n Sedangkan untuk mencari persamaan garis dari data dan kurva di atas, masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut: Y = a + bx b = n(xy) ( X)( Y) n (X 2 ) ( X) 2 Y = a+ bx a = Y- bx b = 0,005 = 0,089 Dari nilai a dan b yang diperolehdari data di atas, maka persamaan kurva standar rhamnosa adalah: Y = 0, ,005 X Dimana, Y = Absorbansi X = Konsentrasi biosurfaktan (ppm) Untuk mencari konsentrasi biosurfaktan dari masing-masing sampel, substitusikan nilai absorbansi yang diperoleh dari sampel ke persamaan di atas. Isolat Absorbansi Konsentrasi Biosurfaktan (ppm) bakteri Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21 Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21 CBM 1 0, ,1310 0, ,20 8,40 23,64 CBM 3 0, ,0462 0, ,24 0,00 0,06 CBM 4 0, ,0515 0, ,38 0,00 13,52 JBM 1 1, ,0716 0, ,38 0,00 76,84 JBM 2 0, ,0985 0, ,96 1,90 4,78 JBM 3 0, ,1831 0, ,00 18,82 13,92 KBM 1 1, ,1085 0, ,58 3,90 7,18 KBM 2 0, ,3937 0, ,70 60,94 5,48 KBM 3 0, ,1106 0, ,38 4,32 6,26 TBM 2 0, ,1866 0, ,12 19,52 0,00

10 Lampiran 9. Alur Kerja Penentuan Kurva Standar Karbosulfan Karbosulfan Dibuat dengan konsentrasi 0,3067, 1,0223, 2,0446, 4,0892, dan 8,1784 ppm Luas Area Diinjeksikan masing-masing konsentrasi sebanyak 1 μl ke dalam GC Kurva Standar Karbosulfan Ditentukan persamaan garis regresi kurva standar karbosulfan dengan memplot luas area dan konsentrasi karbosulfan dengan metode Least Square

11 Lampiran 10. Uji Potensi Bakteri Penghasil Biosurfaktan Dalam Mendegradasi Karbosulfan Dan Analisa Karbosulfan Sisa Dengan Metode GC (Gas Chromatography) (Balai Pengujian Mutu Produk Tanaman) Isolat Bakteri Dibuat dalam bentuk suspensi yang setara dengan kekeruhan Mc-Farland ( 10 8 sel/ml) Diinokulasikan sebanyak 20 ml ke 980 ml media BHB yang mengandung 12 ppm karbosulfan dengan merek dagang Marshal Diinkubasi pada shaker dengan kondisi gelap, kecepatan 150 rpm pada suhu 30 0 C selama 21 hari Media Dimasukkan 300 ml ke dalam corong pisah Ditambahkan diklorometan sebanyak 100 ml Diekstrak hingga terbentuk 2 fasa Fasa Air Fasa Organik Ditambahkan kembali diklorometan 50 ml Dilakukan siklus ini sebanyak dua kali Dilakukan evaporasi hingga hampir kering Ditambahkan isooktan : toulen (9 : 1) sampai volume mencapai 3 ml Diinjeksikan ke dalam GC Hasil

12 Lampiran 11. Kurva Standar Karbosulfan No Konsentrasi Karbosulfan (mg/kg) Luas Area 1 0, ,96 2 1, ,07 3 2, ,73 4 4, ,48 5 8, , Kurva Standar Karbosulfan Luas area Y= 28189,76X , ,3067 1,0223 2,0446 4,0892 8,1784 Konsentrasi karbosulfan (mg/kg) Untuk menentukan persamaan garis regresi kurva standar karbosulfan digunakan metode Least Squere, nilai konsentrasi karbosulfan dimasukkan sebagai nilai X dan luas area sebagai Y. 2 No X Y X Y XY 1 0, ,96 0, , , , ,07 1, , ,36 3 2, ,73 4, ,3 4 4, ,48 16, ,1 5 8, ,19 66, n=5 ΣX=15,6412 ΣY=414062,4 ΣX 2 =88, ΣY = ΣXY= X= 3,12824 Y=82812,49 2 Untuk mencari nilai R (regresi) masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut:

13 XY ( X)( Y) n R = R=0,9986 X 2 ( X) 2 n Y2 ( Y) 2 n Sedangkan untuk mencari persamaan garis dari data dan kurva di atas, masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut: Y = a + bx b = n(xy) ( X)( Y) n (X 2 ) ( X) 2 Y = a+ bx a = Y- bx b = 28189,7681 = -5371,8742 Dari nilai a dan b yang diperoleh dari data di atas, maka persamaan kurva standar rhamnosa adalah: Y = 28189,7681 X ,8742 Dimana: Y = Luas area X = Konsentrasi karbosulfan (mg/kg)

14 Lampiran 12. Perhitungan Mencari % degradasi Karbosulfan Isolat bakteri Konsentrasi karbosulfan (ppm) Hari ke-0 Hari ke-21 Kontrol 0,050 0,042 JBM 3 0,050 0,028 KBM 1 0,050 0,025 Pengurangan karbosulfan pada hari ke-21. konsentrasi karbosulfan hari ke 21 = 100% konsentrasi karbosulfan hari ke 0 100% Contoh: Pengurangan karbosulfan pada hari ke-21 perlakuan kontrol = 100% 0,042 0, % = 100% 84% = 16% Pengurangan karbosulfan pada perlakuan isolat terhadap kontrol pada hari ke-21. konsentrasi karbosulfan perlakuan isolat hari ke 21 = 100% konsentrasi karbosulfan perlakuan kontrol hari ke % Contoh: Pengurangan karbosulfan pada perlakuan isolate JBM 3 terhadap control hari ke-21 = 100% 0,028 0, % = 100% [66,666%] = 33,33%

15 Lampiran 13. Hasil Pengujian Karbosulfan Sisa dari Balai Pengujian Mutu Produk Tanaman, Jakarta a. Kontrol Hari ke-0

16 b. Isolat JBM 3 Hari ke-21

17 c. Isolat KBM 1 Hari ke-21

18 Lampiran 14. Gambar Hasil Penelitian a. Isolasi bakteri pada Media Bushnell-Hass Agar b. Isolat bakteri a b c (a) Isolat bakteri JBM 3, (b) Pewarnaan Gram isolat bakteri JBM 3, (c) Isolat bakteri KBM 1, (d) Pewarnaan Gram isolat bakteri KBM 1 d

19 c. Uji Biokimia a b c (a) Uji hidrogen sulfida dan fermentasi gula, (b) Uji sitrat, (c) Uji motilitas, (d) Uji hidrolisa gelatin d

20 d. Kultur cair isolat bakteri pada media Bushnell-Hass Broth a (a) Kultur bakteri JBM 3, (b) Kultur bakteri KBM 1 b e. Screening aktivitas biosurfaktan metode emulsifikasi a b (a) lapisan N-heksan, (b) emulsi, (c) lapisan kultur isolat c f. Perhitungan pertumbuhan isolat bakteri pada media PCA (a) JBM 3, (b) KBM 1