Lampiran 1 Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984)

Transkripsi

1 LAMPIRAN

2 Lampiran 1 Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984) Pereaksi Blanko (µl) Standar (µl) Sampel (µl) Penyangga Tris HCl (0.2 M) ph 7.5 Substrat kasein for biochemistry (1 %) Ekstrak kasar enzim Akuades steril LTirosin standar (5 mm) diinkubasi pada suhu optimum selama 10 menit Asam trikloroasetat (10 %) Akuades steril Ekstrak kasar enzim 0 0 diinkubasi pada suhu 10 ºC selama 10 menit kemudian di sentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm selama 10 menit Filtrat Na2CO3 (0.5 M) Folin Ciocalteu (1:2) didiamkan selama 15 menit kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm A sampel A blanko Aktivitas protease dihitung dengan rumus UA = x P x 1/T A standar A blanko Keterangan: UA : jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 mikromol produk tirosin per menit (U/ml), 1U sama dengan nkat/ml. A sampel : nilai absorbansi sampel A standar : nilai absorbansi standar A blanko : nilai absorbansi blanko P : faktor pengenceran T : waktu inkubasi

3 Lampiran 2 Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976) Jenis Bahan CBB G250 Etanol 95 % Asam Fosfor (orto fosfor) Stok Pereaksi Bradford Jumlah 0.05 gram 25 ml 50 ml CBB G250, etanol 95 %, dan asam fosfor (orto fosfor) dilarutkan dengan akuades dalam labu takar ditepatkan sampai ml, kemudian dikocok kuat hingga larutan homogen. Larutan disaring menggunakan kertas saring dan disimpan pada suhu dingin dalam botol gelap. Pereaksi diencerkan lima kali sebelum digunakan. Pembuatan Kurva Standar Sebelum digunakan pereaksi diencerkan dengan akuades (Akuades : pereaksi = 4:1) dan larutan BSA 1 mg/ml diencerkan dengan akuades (perbandingan 1:9). Kurva standar dibuat dengan menambahkan sebanyak 4 ml pereaksi Bradford ke dalam 0.4 ml larutan BSA (bovine serum albumin ) dengan konsentrasi 0.00 mg/ml 0.10 mg/ml. Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Konsentrasi BSA pembuatan kurva standar mikroasai Konsentrasi BSA (mg/ml) BSA (ml) Akuades (ml) Pengukuran Sampel dan Blanko Sampel Blanko : 0.4 ml ekstrak kasar enzim dicampur dengan 4 ml pereaksi Bradford, dikocok kuat dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 595 nm. : 0.4 ml akuades dicampur dengan 4 ml pereaksi Bradford, dikocok kuat dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 595 nm. Aktivitas spesifik dihitung dengan rumus : Aktivitas spesifik = Aktivitas Protease (U/ml) Kadar Protein (mg/ml)

4 Lampiran 3 Pereaksipereaksi yang digunakan 1. Substrat Kasein (Hidrolisat) 1% (w/v) 1 g kasein hidrolisat dilarutkan dalam ml bufer TrisHCl 0.2 M. 2. Substrat Bulu Ayam 1% (w/v) 1 g tepung bulu ayam dilarutkan dalam ml bufer TrisHCl 0.2 M. 3. Standar Tirosin 5mM (5mmol/l) g tirosin dilarutkan dalam 20 ml akuades, menggunakan pengaduk magnetik dengan kecepatan rendah. 4. Larutan Asam Trikloroasetat (TCA) 10% (w/v) 10 g asam trikloroasetat dilarutkan dalam ml akuades. 5. Larutan Natrium Karbonat (Na 2 CO 3 ) 0.5 M 5.3 g Na 2 CO 3 dilarutkan dalam ml akuades. 6. Pereaksi Folin Ciocaletau (1:2) 50 ml larutan Folin Ciocalteau dilarutkan dalam ml akuades. 7. Bufer TrisHCl 0.2 M Larutan A : Tris (Hidroksimetil aminometan) 0.2 M (Larutkan 24.2 g dalam 0 ml) Larutan B : HCl 0.2 M Pembuatan : 50 ml A + Æ ml B, dilarutkan dengan akuades hingga total 200 ml Æ ph Bufer Sitrat 0.2M Larutan A : Asam Sitrat 0.2 M (42.02 g dalam 0ml) Larutan B : Sodium Sitrat 0. 2 M (58.82 g C6H12O 6 Na. 2H2O dalam 0 ml) Pembuatan : ë ml A + â ml B dilarutkan hingga total ml ë â ph Bufer GlisinNaOH 0.2 M Larutan A : Glisin 0.2 M (15.01 g dalam 0ml) Larutan B : NaOH 0.2 M Pembuatan : 50 ml A + x ml B dilarutkan hingga total 200 ml x ph x ph Bufer FosfatNaOH 0.2 M Larutan A. : Na 2 HPO 4 2H 2 O 0.2 M (35.6 g dalam 0 ml akuades) Larutan B Pembuatan : NaOH 0.2 M : ph 11 : Larutkan 50 ml A + titrasi dengan NaOH 0.2 M ph 12 : Larutkan 50 ml A + titrasi dengan NaOH 0.2 M

5 Lampiran 4 Kurva produksi protease Streptomyces spp. galur SLW 81, C 13, dan 45I3 Hari ke Aktivitas Protease (nkat/ml) SLW 81 C 13 45I Lampiran 5 Aktivitas protease isolat SLW 81 pada berbagai ph ph Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) Ratarata Kadar Protein: mg/ml, aktivitas diukur pada suhu 37 ºC. Lampiran 6 Aktivitas protease isolat C 13 pada berbagai ph ph Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) Ratarata Kadar Protein : mg/ml, aktivitas diukur pada suhu 37 ºC. Lampiran 7 Aktivitas protease isolat 45I 3 pada berbagai ph ph Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) Ratarata Lampiran Kadar Protein 8 Aktivitas : protease mg/ml, isolat aktivitas SLW diukur 81 pada pada berbagai suhu 37 suhu ºC. ( C)

6 Lampiran 8 Aktivitas protease isolat SLW 81 pada berbagai suhu Suhu (ºC) Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) Ratarata Kadar Protein : mg/ml, aktivitas diukur pada ph 9 (ph optimum). Lampiran 9 Aktivitas protease isolat C 13 pada berbagai suhu Suhu (ºC) Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) Ratarata Kadar Protein : mg/ml, aktivitas diukur pada ph 9 (ph optimum). Lampiran 10 Aktivitas protease isolat 45I3 pada berbagai suhu Suhu (ºC) Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) Ratarata Kadar Protein : mg/ml, aktivitas diukur pada ph 7.5 (ph optimum).

7 Lampiran 11 Uji kemampuan keratinolitik isolat SLW 81 Aktivitas Protease Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) 2 (nkat/mg) Ratarata % Aktv. Relatif Substrat Kasein Substrat Bulu Ayam Kadar Protein : mg/ml, aktivitas diukur pada ph 9 dan suhu 80 ºC. Lampiran 12 Uji kemampuan keratinolitik isolat C 13 Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) Aktivitas Protease 2 (nkat/mg) Ratarata % Aktv. Relatif Substrat Kasein Substrat Bulu Ayam Kadar Protein : mg/ml, aktivitas diukur pada ph 9 dan suhu 40 ºC. Lampiran 13 Uji kemampuan keratinolitik isolat 45I3 Aktivitas Protease Aktivitas Protease 1 (nkat/mg) 2 (nkat/mg) Ratarata % Aktv. Relatif Substrat Kasein Substrat Bulu Ayam Kadar Protein : mg/ml, aktivitas diukur pada ph 9 dan suhu 50 ºC.