METODE PENELITIAN. Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Januari-Mei 2015 di Laboratorium

Transkripsi

1 15 III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Januari-Mei 2015 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung. B. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu erlenmeyer sebagai tempat media produksi enzim, gelas beker untuk tempat pembuatan media, gelas ukur untuk mengukur volume akuades atau larutan yang dipakai, pipet mikrodan tabung mikro untuk mengambil sampel enzim dalam ukuran mililiter, tabung reaksi sebagai tempat meremajakan bakteri Bacillus sp., jarum ose untuk mengambil biakan Bacillus sp. pada saat meremajakan bakteri dalam tabung miring, inkubator untuk menginkubasi bakteri yang diremajakan, inkubator shaker untuk menginkubasi enzim pada media produksi enzim selulase, sentrifuge untuk memisahkan bakteri dengan ekstrak kasar enzim selulase, ph meter untuk mengukur ph buffer, baskom untuk tempat menampung air es pada saat uji aktivitas enzim.

2 16 Bahan yang digunakan yaitu: Akuades, es batu, isolat Bacillus sp., media modifikasi Mandels (Tabel 2), agar bakteria, larutan buffer sitrat, larutan buffer posfat, media CMC, dan reagen DNS. Tabel 2. Perbandingan komposisi media Mandels tanpa modifikasi dengan media Mandels modifikasi dalam 100 ml akuades No Bahan Konsentrasi (g) Mandels tanpa Mandels modifikasi modifikasi 1 Pretreated 1 - Lignocellulosic Substrate (GS) 2 CMC - 0,5 3 Yeast Extract - 0,35 4 Proteose peptone 0,1-5 CaCl 0,03-6 Triptone Water - 0,35 7 NaCl - 0,2 5 KH 2 PO 4 0,2 0,245 6 MgSO 4.7H 2 O 0,03 0,035 7 (NH 4 ) 2 SO 4 0,14 0,175-8 NH 2 CONH 2 0,03-9 FeSO 4.7H 2 O 0, MnSO 4.H 2 O 0, C. Metode Penelitian Karakterisasi enzim selulase dalam penelitian ini dilakukan secara deskriptif, yaitu dengan melihat perbedaan aktivitas enzim yang dihasilkan oleh Bacillus sp. Perbedaan aktivitas enzim dapat dilihat melalui jumlah gula reduksi yang dihasilkan oleh reaksi enzimatik/selulolitik. Besarnya jumlah gula reduksi, diuji dengan metode DNS (Miller,1959), dan diukur menggunakan spektrofotometer berdasarkan absorbansi pada panjang gelombang 575 nm. Karakteristik enzim yang diamati meliputilama produksi optimum enzim, suhu optimum enzim, ph optimum buffer enzim, dan kestabilan enzim terhadap lama penyimpanan.

3 17 Prosedur kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Pembuatan Media Media yang digunakan pada penelitian ini adalah media modifikasi Mandels. Cara membuat media ini adalah sebagai berikut: a. Bahan ditimbang dengan komposisi sebagai berikut: CMC 0,5 g; Yeast Extract 0,35 g; Triptone water 0,35 g; NaCl 0,2 g; KH 2 PO 4 0,245 g; MgSO 4.7H 2 O 0,035 g; (NH 4 ) 2 SO 4 0,175 g. b. Semua bahan dimasukkan ke dalam gelas beker kemudian ditambahkan 100 ml akuades dan dihomogenkan dengan menggunakan hotplate magnetic stirer. Larutan ini disebut dengan medium. c. Medium dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit. 2. Peremajaan Bacillussp. Peremajaan bakteri Bacillus sp. dilakukan dengan mengambil 1 ose persediaan isolat secara aseptis dan ditanam pada media steril yaitu media Mandels dengan tambahan agar bakteria sebanyak 1,5% kemudian diinkubasi pada inkubator dengan suhu 40 o C selama 24 jam. 3. Uji Kualitatif Enzim Selulase Uji ini dilakukan dengan metode congo red. Isolat Bacillus yang terdapat di Laboratorium Mikrobiologi diinokulasikan pada media modifikasi Mandels yang ditambahkan dengan agar bakteria sebanyak 1,5% kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator pada suhu 40 o C. Setelah 24 jam, koloni yang tumbuh disiram dengan congo red 1%

4 18 kemudian dicuci dengan larutan NaCl 0,1%. Pada koloni bakteri diamati, zona jernih disekitar koloni bakteri yang tumbuh. Terbentuknya zona jernih menunjukkan adanya enzim selulase. 4. Persiapan Inokulum Persiapan inokulum Bacillus dilakukan dengan menambahkan 1 ose bakteri umur 24 jam ke dalam erlenmeyer 100 mlyang berisi 20 ml media Mandels. Diinkubasi pada waterbath shaker selama satu malam dengan kecepatan 120 rpm. 5. Penentuan Lama ProduksiOptimum Enzim Penentuan lama produksi optimum enzim dilakukan dengan menggunakan inokulum Bacillus yang sudah diinkubasi selama satu malam. Sebanyak 5 ml inokulum Bacillus sp. umur 24 jam, diinokulasikan ke dalam media Mandels 45 ml. Kemudian kultur diinkubasi pada suhu 40 o C selama : 6 jam, 12 jam, 18 jam, 24 jam, dan 30 jam. Setelah inkubasi, kultur disentrigusasi selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan extrak kasar enzim selulase dari Bacillus sp. Ekstrak kasar enzim selulase ini kemudian diuji aktivitasnya dengan mengikuti prosedur uji aktivitas enzim seperti pada tabel berikut:

5 19 Tabel 3. Pengujian aktivitas enzim selulase Bahan Kontrol Uji Enzim - 0,5 ml 0,5% CMC dalam buffer 0,05 M 0,5 ml 0,5 ml... Enzim+Buffer diinkubasi pada suhu tertentu selama 30 menit dalam waterbath shaker Larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam air es (untuk menghentikan aktivitas enzim)... Larutan DNS 1 ml 1 ml Enzim 0,5 ml -... Sampel dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit Sampel didinginkan di air dingin selama 20 menit, kemudian dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 575 nm 6. Produksi Ekstrak Kasar Enzim Produksi ekstrak kasar enzim dilakukan dengan menginokulasikan inokulum sebanyak 5 ml ke dalam media Mandels 45 ml lalu diinkubasi di dalam waterbath shaker dengan suhu 40 o C selama 12 jam dengan kecepatan 120 rpm. Ekstrak kasar enzim selulase yang terdapat dalam media dipisahkan dari sel bakterinya dengan menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 7500 rpm selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim yang digunakan untuk uji aktivitas enzim dalam proses karakterisasi enzim selulase ini.

6 20 7. Karakterisasi Enzim a. PengaruhSuhu Terhadap Aktivitas Enzim Selulase Suhu optimum enzim diketahui melalui proses inkubasi enzim yang dilakukan pada suhu yang berbeda yaitu suhu 30 o C, 40 o C, 50 o C, 60 o C, dan 70 o C dalam waterbath shaker selama 30 menit. Setelah inkubasi, aktivitas enzim dihentikan dengan cara merendamnya kedalam air es. Langkah selanjutnya mengikuti Tabel 3. b. PengaruhpH Terhadap Aktivitas Enzim Selulase PH buffer optimum diperoleh melalui proses uji aktivitas enzim dengan penambahan beberapa jenis buffer, dengan ph yang berbeda. Buffer yang digunakan pada uji ini antara lain buffer sitrat ph 4, ph 5, ph 6, buffer posfat ph 7, buffer tris ph 8 dan ph 9. Ekstrak kasar enzim ditambah buffer sesuai ph yang ditentukan kemudian diinkubasi pada suhu lingkungan asalnya yaitu 40 o C, dan juga pada suhu 50 o C. Setelah inkubasi, aktivitas enzim dihentikan dengan cara direndam dalam air es. Langkah selanjutnya mengikuti Tabel 3. c. Penentuan Kestabilan Enzim Terhadap Waktu Penyimpanan Untuk mengetahui kestabilan enzim terhadap waktu penyimpanan, dilakukan proses penyimpanan ekstrak kasar enzim terlebih dahulu sebelum diuji aktivitasnya. Enzim disimpan pada suhu 40 o C dengan variasi lama penyimpanan yaitu 0 jam, 1 jam, 2 jam, 3 jam, 4 jam, dan 5 jam. Setelah disimpan dengan waktu yang telah ditentukan kemudian

7 21 dilakukan uji aktivitas enzim seperti Tabel 3 dengan menggunakan buffer sesuai ph optimum dan diinkubasi pada suhu 40 o C. 8. Penentuan Gula Standar Glukosa Sebagai larutan standar digunakan deret glukosa pada konsentrasi 0 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml, 300 µg/ml, 400 µg/ml, dan 500 µg/ml. Pengujian gula standar dapat dilihat pada tabel berikut: Tabel 4. Penentuan larutan standar Bahan Glu Glu Glu Glu Glu Glu ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) ( g/ml) Gula Standar 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 (ml) 0,5% CMC 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 dalam buffer (ml) DNS (ml) Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit Larutan didinginkan di air dingin selama 20 menit, kemudian diukur nilai absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 575 nm Nilai absorbansi yang diperoleh dari pengukuran spektrofotometer digunakan untuk menentukan kadar glukosa yang dihasilkan dengan rumus persamaan regresi linier Y = a + bx. Nilai a dan b diperoleh dari perhitungan gula standar dengan rumus sebagai berikut:

8 22 Sedangkan Y merupakan nilai absorbansi yang dihasilkan dari pengukuran pada panjang gelombang 575 nm dan x adalah kadar glukosa yang dihasilkan. 9. Penentuan Aktivitas Enzim Selulase Setelah kadar glukosa diketahui maka aktivitas enzim sudah dapat ditentukan. Penentuan aktivitas enzim selulase per unit dapat ditentukan dengan rumus, sebagai berikut : Keterangan : BM glukosa = 180,18 g/mol Waktu inkubasi = 30 menit Data yang disajikan adalah aktivitas relatif enzim (%) yang ditentukan berdasarkan aktivitas enzim melalui rumus berikut:

9 23 D. Diagram Alir Bacillus sp. Peremajaan Bacillus sp. menggunakan media Mandels dan Reese Inkubasi selama 12 jam Uji Kualitatif Selulolitik Bacillus sp. Inkubasi selama 12 jam Ada Tidak ada Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Uji Aktivitas Enzim dengan Metode DNS Karakterisasi Enzim Selulase Uji aktivitas enzim dengan metode DNS Suhu Optimum ph Optimum Lama Waktu Penyimpanan