BAB III METODE PENELITIAN. yaitu jenis isolat dan sumber fosfat yang digunakan. selama 3 bulan mulai tanggal 1 Februari 31 April 2017.

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen dengan dua variabel yaitu jenis isolat dan sumber fosfat yang digunakan. B. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA UNY selama 3 bulan mulai tanggal 1 Februari 31 April C. Populasi dan Sampel Penelitian a. Populasi Penelitian Populasi dari penelitian meliputi semua isolat bakteri termofilik yang diisolasi dari Sungai Gendol pasca erupsi Merapi 2010 yang ada di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA UNY. b. Sampel Penelitian Sampel penelitian yaitu 3 isolat bakteri pelarut fosfat termofilik terpilih yang terdiri atas isolat D75, D92 dan D110a yang diisolasi dari Sungai Gendol pasca erupsi Merapi. D. Variabel Penelitian Variabel dalam penelitian ini yaitu: 1. Bebas a. Jenis Isolat bakteri 1) D75 2) D92 29

2 3) D110a b. Sumber Fosfat 1) Organik : guano fosfat dan fosfat alam 2) Anorganik : trikalsium fosfat dan amonium hidrogenfosfat 2. Terikat a. Pertumbuhan bakteri b. Kadar fosfat terlarut E. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan antara lain: Autoclave (All American no.25x), botol kultur, erlenmeyer (Pyrex), beakerglass (Pyrex), hot plate, inkubator (EYELA SU-600N), jarum ose, kamera (Polytron), kulkas (Samsung), Laminar Air Flow (SHIMADZU), lampu spiritus, magnetic stirrer, mikropipet (SOCOREX), oven (UCHIDA IST-150D), tabung reaksi (Pyrex), pipet ukur, timbangan analitik (AND HF-300), sentrifus, spektrofotometer UV-Vis Genesys 10S, labu takar, vorteks, tabung cuvet, botol kultur, tabung ependorf, labu ukur, ph meter, termometer, kertas payung, tissue gulung, kapas, kain kassa, kertas label, rak tabung reaksi, korek api, aluminium foil, plastik, dan plastic wrap. 2. Bahan Bahan yang digunakan antara lain: 3 Isolat bakteri termofilik terpilih yaitu D75, D92, dan D110a (Gambar 20), fosfat organik berupa pupuk pupuk guano fosfat dan fosfat alam yang berasal dari Goa Lawa Ponjong 30

3 Gunungkidul, fosfat anorganik berupa trikalsium fosfat (Ca3(PO4)2) dan amonium hidrogenfosfat ((NH4)2HPO4)), alkohol 70%, NaCl, KCl, MgSO4.7H2O, MnSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, glukosa, yeast ekstrak, akuades, Media Nutrient Agar (NA), Media Nutrient Broth (NB), H2SO4, (K(SbO)C4H4O6.1/2H2O), amonium molibdat ((NH4)6Mo7O24.4H2O), asam askorbat, dan kalium hidrogenfosfat (KH2PO4). F. Cara Perlakuan 1. Pembuatan Media Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media untuk peremajaan yaitu Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), dan media dengan variasi sumber fosfat sebagai media pertumbuhan BPF untuk pengujian fosfat terlarut serta pengukuran pertumbuhan. a. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA) Media NA (Oxoid) sebanyak 28 gram dilarutkan ke dalam 1 liter akuades, kemudian diaduk dan dipanaskan menggunakan magnetic stirrer, setelah itu dimasukkan ke tabung reaksi ditutup menggunakan kapas kemudian disterilkan dengan autoclave dengan suhu 121 ºC selama 15 menit. b. Pembuatan Media Nutrient Broth (NB) Media NB (Oxoid) sebanyak 14 gram dilarutkan ke dalam 1 liter akuades kemudian diaduk dan dipanaskan menggunakan magnetic stirrer, kemudian media dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditutuo 31

4 menggunakan kapas, setelah itu disterilkan dengan autoclave dengan suhu 121 ºC selama 15 menit. c. Pembuatan Media Perlakuan Pembuatan media pikovskaya menggunakan guano fosfat, fosfat alam, trikalsium fosfat (Ca3(PO4)2) atau amonium hidrogenfosfat ((NH4)2HPO4) sebanyak 5 gram, NaCl sebanyak 0,2 gram, KCl sebanyak 0,2 gram, MgSO4.7H2O sebanyak 0,19 gram, MnSO4.7H2O sebanyak 2,5 mg, FeSO4.7H2O sebanyak 2.5 mg, (NH4)2SO4 sebanyak 0,5 gram, glukosa sebanyak 10 gram, dan yeast ekstrak sebanyak 0,5 gram dilarutkan ke dalam 1 liter air akuades. Kemudian diaduk dan dipanaskan menggunakan magnetic stirrer, setelah itu disterilkan dengan autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit. 2. Peremajaan Isolat Bakteri Pelarut Fosfat Peremajaan isolat bakteri termofilik dimaksudkan untuk memperoleh bakteri aktif tumbuh. Kultur murni bakteri termofilik sebanyak 3 isolat yang menjadi sampel penelitian, diremajakan kembali dengan ditumbuhkan pada media Nutrient Agar (NA) miring. Masingmasing isolat diambil sebanyak 1 ose secara aseptik, kemudian ditumbuhkan dalam media NA plate miring dengan metode gores (Gambar 19). Diinkubasi pada suhu 55 ºC selama 24 jam hingga bakteri tumbuh. Bakteri yang sudah tumbuh selanjutnya ditumbuhkan pada media Nutrient Broth (NB). 32

5 3. Persiapan Inokulum Tiga isolat bakteri pelarut fosfat yang sebelumnya ditumbuhkan pada media NA, diambil masing-masing 1 ose kemudian diinokulasikan ke dalam media NB. Bakteri pada media NB dishaking 100rpm dan suhu 55 ºC dan diinkubasi selama 14 jam. Setelah tumbuh, diukur nilai optical density sampai menunjukkan nilai absorbansi 1 (Gambar 21). Bakteri pelarut fosfat yang telah memiliki OD bernilai 1 kemudian ditumbuhkan pada media pikovskaya dengan variasi media dengan masing-masing isolat diambil sebanyak 10 ml dari media NB secara aseptik, kemudian ditumbuhkan dalam botol kultur yang berisi media perlakuan 60 ml (Gambar 22) lalu diinkubasi pada suhu 55 o C selama 48 jam hingga bakteri tumbuh. Bakteri yang sudah tumbuh selanjutnya diukur pertumbuhan dan kadar fosfat terlarutnya. 4. Pengukuran Pertumbuhan Bakteri Pelarut Fosfat (Optical Density (OD)) Pertumbuhan bakteri pelarut fosfat diukur kekeruhannya dengan mengambil sampel sebanyak 1 ml diencerkan dengan 2 ml air destilasi lalu dispektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm (Gambar 23). 5. Pembuatan Larutan Standar Fosfat Dipipet 0 ml; 0.5 ml; 1 ml; 2 ml; 2.5 ml larutan baku fosfat yang mengandung 10 ppm dan masukan masing-masing kedalam labu ukur 25 ml. Selanjutnya ditambahkan air suling sampai tepat pada tanda 33

6 tera kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh kadar fosfat 0,0 ppm; 0,2 ppm; 0,4 ppm; 0,8 ppm dan 1,0 ppm. 6. Uji Pelarutan PO4 pada Media Cair Bakteri yang sudah tumbuh pada media perlakuan (Gambar 25) kemudian diuji pelarutan fosfat dengan pembuatan reagen meliputi (Sianturi, 2010: 10): a. Pembuatan Larutan A: Asam sulfat (H2SO4) 5N sebanyak 14 ml diencerkan dalam dengan aquades, sehingga volumenya menjadi 100 ml b. Pembuatan Larutan B: (K(SbO)C4H4O6.1/2H2O) sebanyak 0,324 gram dilarutkan dalam akuades, sehingga volumenya menjadi 100 ml c. Pembuatan Larutan C: (NH4)2Mo7O24 sebanyak 4 gram dilarutkan dalam akuades, sehingga volumenya menjadi 100 ml d. Pembuatan Larutan D: Dilarutkan 1,76 g Asam askorbat dalam akuades, sehingga volumenya menjadi 100 ml Kemudian dicampurkan reagen tersebut dengan mengambil 10 ml larutan A + 1 ml larutan B + 3 ml larutan C + 6 ml larutan D, lalu dikocok hingga homogen. Selanjutnya sebanyak 20 ml sampel disentrifus pada rpm selama 15 menit, lalu sebanyak 5 ml supernatan diambil dan dituang ke dalam tabung reaksi, setelah itu ditambahkan 0,5 ml pereaksi P (A+B+C+D) lalu dikocok beberapa menit dan didiamkan 30 menit. Fosfat bebas diukur menggunakan 34

7 spektrofotometer pada panjang gelombang 880 nm (Gambar 26). Untuk standarisasi digunakan KH2PO4 yang dibuat berdasarkan ppm yang diinginkan. Penentuan kadar fosfat diketahui berdasarkan kurva baku yaitu dengan cara memplot nilai absorbans sampel terhadap konsentrasi kerja atau dengan menggunakan persamaan garis lurus yaitu: Y= a + Bx Di mana: Y = Absorbans a = Konstanta b = Koefisien regresi X = Konsentrasi (Sudjana, 1992:56). 7. Pengukuran ph Media Pengukuran ph menggunakan ph meter. Media kultur bakteri diukur phnya pada jam ke 0, 24, dan 48 jam untuk mengetahui perubahan ph media yang disebabkan aktivitas bakteri (Gambar 24). G. Teknik Analisis Data Data kuantitatif dianalisis menggunakan One Way Anova ANOVA (Analysis of Variances) untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh antar perlakuan pada p jika hasilnya berbeda nyata atau sangat nyata dilanjutkan uji wilayah berganda Duncan atau DMRT (Duncan s Multiple Range Test) pada taraf signifikansi 5% (taraf nyata atau taraf kesalahan 5%) untuk melihat perbedaan antar kelompok perlakuan. Analisis dilakukan dengan bantuan Microsoft Excel dan software SPSS 19.0 for Windows. 35