IDENTIFIKASI POSTLARVA FAMILI GOBIIDAE DARI MUARA SUNGAI KEDURANG, BENGKULU MELALUI DNA BARCODE

Transkripsi

1 i IDENTIFIKASI POSTLARVA FAMILI GOBIIDAE DARI MUARA SUNGAI KEDURANG, BENGKULU MELALUI DNA BARCODE LILIANI ISNA DEVI DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

2 ii ABSTRAK LILIANI ISNA DEVI. Identifikasi Postlarva Famili Gobiidae dari Muara Sungai Kedurang, Bengkulu melalui DNA Barcode. Dibimbing oleh Dr. Ir. ACHMAD FARAJALLAH, M.Si dan Dr. Ir. R. R. DYAH PERWITASARI, M.Sc. Postlarva ikan famili Gobiidae merupakan salah satu biota migran musiman dalam jumlah yang sangat besar. Kegiatan untuk mengidentifikasi spesies dari postlarva sulit dilakukan berdasarkan ciri morfologi karena sebagian besar panduan identifikasi ikan didasarkan pada karakter dewasa. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi komposisi spesies postlarva ikan gobi dalam kumpulan anakan ikan yang bermigrasi di muara Sungai Kedurang, Bengkulu menggunakan DNA Barcode. Sebanyak 22 ekor postlarva ikan dari famili Gobiidae yang diawetkan dalam alkohol dijadikan sebagai sampel. Ruas DNA yang dijadikan barcode yaitu ruas gen CO1. Amplifikasi gen CO1 berhasil dilakukan dengan ukuran yang berkisar pb. Sampel no 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 21, 22 dan 22 teridentifikasi sebagai Stiphodon atratus, sampel no 19 dan 20 teridentifikasi sebagai Amblyeleotris sungami sedangkan sampel no 3 teridentifikasi sebagai Novem Genus (genus baru) dari subfamili Sicydiinae. Berdasarkan hasil rekonstruksi pohon filogeni dengan menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) bootstrap 1000x didapatkan dua klad besar, yaitu klad pertama yang terdiri dari Stiphodon atratus dan Novem Genus, serta klad kedua yang terdiri dari Amblyeleotris sungami. ABSTRACT LILIANI ISNA DEVI. Postlarvae Identification of Gobiidae Family from Kedurang Estuary, Bengkulu through DNA Barcode. Supervised by Dr. Ir. ACHMAD FARAJALLAH, M.Si and Dr. Ir. R. R. DYAH PERWITASARI, M.Sc. Gobiidae family fish postlarvae is one of seasonal migrant biota in a very large number. It is difficult to identify fishes species according to morphological characteristics of postlarvae because most of the fish identification guide is based on adult characters. The aim of this study was to identify the species composition of Gobiidae postlarvae that migrated in Kedurang estuary, Bengkulu through DNA Barcode. A total of 22 tails Gobiidae family postlarvae which were preserved in alcohol used as sampels. Segment of CO1 gene was used for barcoding purpose. Amplified of CO1 gene were successfully yielded in bp fragment. Sample no 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 21, 22 and 22 were identified as Stiphodon atratus, sample no 19 and 20 were identified as Amblyeleotris sungami while the sample no 3 were identified as of Novem Genus of subfamily Sicydiinae. Phylogeny tree reconstruction using the Neighbor Joining (NJ) bootstrap 1000x showed two major clades. One clade contains Stiphodon atratus and Novem Genus, other clades include only Amblyeleotris sungami.

3 iii IDENTIFIKASI POSTLARVA FAMILI GOBIIDAE DARI MUARA SUNGAI KEDURANG, BENGKULU MELALUI DNA BARCODE LILIANI ISNA DEVI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

4 iv Judul Skripsi Nama NIM : Identifikasi Postlarva Famili Gobiidae dari Muara Sungai Kedurang, Bengkulu melalui DNA Barcode : Liliani Isna Devi : G Disetujui Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si Pembimbing I Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc Pembimbing II Diketahui Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si Ketua Departemen Biologi Tanggal lulus:

5 v PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah- Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari hingga April 2012 sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Karya ilmiah ini berjudul identifikasi postlarva famili Gobiidae dari muara sungai Kedurang, provinsi Bengkulu melalui DNA Barcode. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Achmad Farajallah dan Dr. Dyah Perwitasari selaku pembimbing yang telah memberikan banyak ilmu, dan bimbingannya kepada penulis. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta, terutama almarhum ayah (Drs. Abiyono, MM), ibu (Dra. Eny Mustafidah), kakak (Mohammad Awaluddin Annas) atas segala doa yang tiada henti, kasih sayang, dan dukungannya. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua keluarga besar zoologi (Mbak Kanthi, Pak Bambang, Ibu Taruni, Ibu Rika, Pak Tri Atmo, Pak Heru, Mas Wildan, Mba Dea, ka Iqbal, ka Bisri, ka Icha, ka Rindi, Mba Tetri, Mba Puji, Ka Sinyo, Kak Sars, Mba Tini, Mba Ani, Pak Adi yang telah berbagi ilmu serta segala dukungannya. Tak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Rahmat Hafid dan sahabat seperjuangan (Ai, Esa, Tyas, Yanti, Delvi, Anas, Dalfit, Adit, Agus) atas segala bantuan, nasehat, dan semangat yang selalu diberikan selama penelitian. Selain itu, terima kasih kepada temanteman Biologi angkatan 45 yang telah memberikan motivasi kepada penulis. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan menambah khasanah ilmu pengetahuan kita semua. Saran dan kritik yang membangun sangat penulis harapkan agar karya ilmiah ini menjadi lebih baik. Bogor, September 2012 Liliani Isna Devi

6 vi RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jepara pada tanggal 03 Februari 1990 dari Bapak Drs. Abiyono, MM (Alm) dan Ibu Dra. Eny Mustafidah. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah dasar di SD Negeri Harapan Baru 03 pada tahun 2002, dan lulus dari SMP Negeri 1 Bekasi pada tahun Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Bekasi dan pada tahun yang sama melanjutkan pendidikan di Institut Pertanian Bogor, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi melalui jalur penerimaan USMI. Selama mengikuti perkuliahan di IPB, penulis aktif sebagai asisten praktikum mata kuliah Vertebrata, Struktur Hewan, dan Botani Umum pada tahun ajaran 2011/2012. Selain aktif di perkuliahan, penulis juga aktif mengikuti organisasi yaitu sebagai bendahara BioWorld pada Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) dan sebagai bendahara Pengembangan dan Pendampingan di Bina Desa FMIPA. Selain itu, penulis juga mengikuti berbagai kepanitiaan acara seperti BOX, BIOS, BIONIC, Pesta Sains, Program Penghijauan Mahasiswa Biologi, Revolusi Sains, dan Lomba Cepat Tepat Biologi. Penulis telah melakukan praktik lapangan pada tahun 2011 di Batu Hiu Ciamis yang berjudul pengelolaan dalam penetasan telur penyu di kelompok pelestari biota laut (KPBL) pantai Batu Hiu, Ciamis.

7 vii DAFTAR ISI DAFTAR TABEL... viii DAFTAR GAMBAR... viii DAFTAR LAMPIRAN... viii PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 1 BAHAN DAN METODE... 2 Waktu dan Tempat... 2 Bahan... 2 Identifikasi sampel... 2 Ekstraksi DNA... 2 Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA... 2 Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing... 2 HASIL... 2 Amplifikasi dan Visualisasi DNA... 2 Analisis Filogeni... 3 PEMBAHASAN... 6 DNA Barcode... 6 Hubungan filogeni antar famili Gobiidae... 7 SIMPULAN... 8 DAFTAR PUSTAKA... 8 LAMPIRAN... 9

8 viii DAFTAR TABEL 1 Tahap, tanggal, dan waktu pengambilan sampel postlarva ikan Gobi Jumlah perbedaan nukleotida gen CO1 antar sampel postlarva ikan Gobi Jumlah perbedaan nukleotida dan jarak genetik gen CO1 beberapa spesies Famili Gobiidae... 5 DAFTAR GAMBAR 1 Amplikon gen CO1 ikan Gobi di atas PAGE 6% Pengelompokan sederhana dari sampel postlarva ikan Gobi Hasil rekonstruksi pohon filogeni beberapa spesies ikan Gobi berdasarkan ruas CO1 mtdna DAFTAR LAMPIRAN 1 Gambar postlarva famili Gobiidae yang digunakan dalam penelitian Tahapan ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid Tahapan visualisasi fragmen DNA produk PCR Hasil pensejajaran ruas gen CO1 dari beberapa spesies famili Gobiidae... 14

9 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Muara sungai (estuaria) merupakan daerah pertemuan air tawar dan laut. Estuari dicirikan dengan kondisi lingkungan yang subur dan fluktuatif mengikuti pasang-surut laut. Secara umum estuaria mempunyai peran ekologis penting, yaitu sebagai tempat berlindung, mencari makanan, tumbuh dan bereproduksi bagi sejumlah spesies ikan dan udang (Subiyanto et al. 2008). Estuaria merupakan habitat dengan keanekaragaman biota yang sangat tinggi, baik biota residen maupun migran. Salah satu biota migran musiman dalam jumlah yang sangat besar yaitu postlarva ikan gobi dari famili Gobiidae. Famili Gobiidae memiliki siklus hidup unik yang bersifat amphidromi. Ikan gobi dewasa menetaskan telurnya di sungai, lalu larva akan terbawa arus ke estuaria dan selanjutnya menuju ke laut. Larva tersebut akan tinggal di laut sekitar enam bulan. Larva akan bermigrasi kembali ke estuaria dalam bentuk postlarva. Selanjutnya postlarva akan berubah menjadi juvenil dan akan kembali ke sungai untuk tumbuh menjadi dewasa dan bereproduksi (McDowall 2007). Fenomena kembalinya kumpulan postlarva ikan Gobi menuju estuaria akan membentuk gelombang hitam. Gelombang ini sering disebut sebagai ipun-ipun oleh masyarakat Bengkulu. Ipun-ipun menjadi sumber makanan penting bagi penduduk Bengkulu. Di lain tempat, ikan Gobi juga dimanfaatkan sebagai makanan yang lezat bagi orang Taiwan dan Jepang, walaupun dijual dengan harga yang tinggi. yaitu 20 dolar per kilo (Lin 2007). Fenomena ipun-ipun tersebut dapat menggerakkan rantai makanan sehingga dinamika ekosistem berlangsung dengan baik. Nutrient tinggi yang terdapat di estuaria mampu menyebabkan tingginya kelimpahan fitoplankton. Dengan melimpahnya keberadaan fitoplankton, maka dapat mempengaruhi kelimpahan zooplankton dan ikan kecil termasuk postlarva yang berperan sebagai konsumennya. Predator utama dari postlarva ikan Gobi yaitu udang dan kepiting. Famili Gobiidae dicirikan dengan adanya sirip ventral yang menyatu dan membentuk piringan penghisap. Hal ini memungkinkan ikan dari famili ini tetap pada posisinya di perairan dengan arus yang deras. Ikan Gobi yang hidup di batu karang, memiliki sirip ventral yang pendek, sedangkan ikan Gobi yang hidup di pasir halus dan bagian dasar yang tidak stabil akan memiliki sirip ventral yang besar (Victor et al. 2010). Ikan Gobi menyumbang angka keanekaragaman ikan terbesar di Indonesia, yaitu 18 spesies ditemukan di Sumatera, 17 spesies di Kalimantan, 19 spesies di Jawa dan 22 spesies di Sulawesi (Kottelat & Whitten 1993). Ikan merupakan kelas dari vertebrata yang memiliki keanekaragaman jenis luar biasa. Hal ini terjadi karena ikan mempunyai morfologi dan adaptasi biologi yang sangat beranekaragam. Dengan kata lain, variasi intraspesies dan interspesies pada setiap taksa ikan sangat tinggi (Zhang & Hanner 2011). Proses untuk mengidentifikasi ikan menjadi tantangan tersendiri bagi taksonomis. Selain itu, kegiatan untuk mengidentifikasi spesies dari postlarva atau anakan ikan sulit dilakukan berdasarkan ciri morfologi. Sebagian besar panduan identifikasi ikan didasarkan pada karakter dewasa. DNA Barcode dapat menyelesaikan permasalahan ini karena dapat mengidentifikasi larva ikan (Pegg et al. 2006). DNA Barcode telah menarik perhatian dunia sebagai sistem yang dapat mengidentifikasi spesies secara cepat dan tepat (Zhang & Hanner 2011). Ruas yang banyak digunakan pada hewan sebagai barcode sekitar 700 pb di bagian ujung 5 gen cytochrome oxidase 1 (COI) genom mitokondria (Ward et al. 2005). Teknik tersebut tidak hanya mempunyai kegunaan untuk mengidentifikasi spesies yang sudah dikenal, tetapi juga dapat memastikan suatu spesies baru (Hajibabaei et al. 2005). Selain itu, DNA Barcode dapat pula mengungkapkan fenomena spesies cryptic, species sibling, keragaman yang belum terungkap, hubungan filogeni di antara takson yang berdekatan dan dapat digunakan pula untuk memantau asal usul suatu komoditas laut (Syafrina 2011). Victor et al. (2007), melaporkan bahwa secara morfologi ikan Gobi Coryphopterus kuna sama dengan Coryphopterus spp, namun ketika diidentifikasi menggunakan DNA Barcode didapatkan perbedaan runutan nukleotida sebesar 25%. Taksonomi dan identifikasi merupakan salah satu dasar yang sangat penting bagi pelaksanaan konservasi. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi komposisi spesies postlarva ikan gobi dalam kumpulan postlarva ikan yang bermigrasi di muara Sungai Kedurang, Bengkulu menggunakan DNA Barcode.

10 2 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari-April Analisis DNA dilakukan di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bahan Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 22 sampel postlarva ikan dari famili Gobiidae. Ikan ini diambil dari muara sungai Kedurang, Bengkulu dengan lima kali pengambilan (Tabel 1). Sampel-sampel tersebut merupakan koleksi Dr. Achmad Farajallah IPB. Semua sampel disimpan dalam alkohol 70% yang mengandung EDTA 1 mm. Identifikasi sampel Koleksi postlarva ikan dipilih berdasarkan ada tidaknya sirip cakram ventral sebagai pembeda utama anggota famili Gobiidae (Victor et al. 2010) (Lampiran 1). Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dari otot epaksial dilakukan menggunakan DNA Extraction Kit for animal tissue (Geneaid Biotech Ltd). Alkohol pengawet otot dibuang dengan cara merendam potongan otot yang berjumlah sekitar 50 mg dalam akuades steril. Otot disuspensikan dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, ph 8.0) dan dilisis menggunakan proteinase K 0,125 mg/ml dan sodium dodesil sulfat 1%. Pemisahan DNA dari bahan organik lainya dan pemurnian DNA selanjutnya mengikuti panduan yang dibuat oleh produsen (Lampiran 2). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi ruas gen CO1 dilakukan dengan menggunakan primer universal DNA Barcode ikan ( yaitu AF TCTACCAACCACAAAGACATCGG dan AF283 5 TACTTCTGGGTGTCCTAAGAAT CA. Reaksi PCR dilakukan dengan volume 25µL dengan komposisi sampel DNA, Taq Polimerase (Kappa Biosystems) beserta sistem buffernya, campuran dntp, MgCl 2, primer forward dan reverse, dan ddh 2 O steril. Kondisi PCR baku (predenaturasi, [denaturasipenempelan primer- pemanjangan] x30 sikluspemanjangan akhir) dengan suhu penempelan primer 55ºC selama 1,5 menit. Kualitas amplikon diuji dengan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% dalam bufer 1x TBE (10 Mm Tris HCl, IM asam borat, dan EDTA 0,1 Mm) yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak (Byun et al. 2009) (Lampiran 3). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing Amplikon dengan kualitas pita tunggal dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi awal. Runutan nukleotida yang diperoleh diedit berdasarkan grafik elektroferogram dari hasil pembacaan sequensing otomatis ABI (Macrogen Inc) dan dipastikan lebih lanjut berdasarkan asam amino yang disandikan. Runutan nukleotida yang sudah diedit selanjutnya dibuat pohon filogeni berdasarkan pengelompokan sederhana ke dalam lima kelompok (Gambar 2). Dipilih satu sampel dari setiap kelompok untuk dijadikan input dalam pencarian kesamaan runutan menggunakan BLAST ( Runutan nukleotida semua sampel dan yang homolog hasil BLAST saling disejajarkan menggunakan Clustal W versi 2.0 yang terdapat dalam MEGA versi 5.00 (Larkin 2007). Analisis keragaman nukleotida berikutnya, yaitu memastikan spesies yang didasarkan pada model No. of differences dan membangun pohon filogeni didasarkan pada jarak genetik Kimura-2-parameter. Rekonstruksi filogeni selanjutnya menggunakan metode Neighbour Joining berdasarkan model subtitusi Kimura-2- parameter. HASIL Amplifikasi dan Visualisasi DNA Gen CO1 berhasil diamplifikasi menggunakan primer AF282-AF283 dengan ukuran berkisar pb pada 22 sampel, 7 sampel diantaranya terlihat tipis (Gambar 1), sehingga diperoleh 15 sampel yang dapat dianalisis lebih lanjut. Dari hasil pensejajaran antar sampel, diperoleh ruas DNA yang saling sejajar sepanjang 623 nt (nukleotida) (Lampiran 4). Dari 623 nt tersebut, terdapat 186 nt yang berbeda dan 437 nt yang sama antar sampel. Sampel no 4 dibandingkan dengan no 11 memiliki jumlah perbedaan nukleotida yang paling kecil yaitu satu nt. Sampel no 3 dibandingkan dengan no 19 memiliki jumlah perbedaan paling besar yaitu 140 nt (Tabel 2). Berdasarkan pengelompokan sederhana ke dalam lima kelompok, didapatkan 159 runutan

11 3 nukleotida yang homolog dan ruas DNA yang saling sejajar sepanjang 572 nt. Jumlah perbedaan nukleotida yang paling kecil dapat mengidentifikasikan suatu spesies. Berdasarkan hasil analisis, ke-15 sampel mempunyai perbedaan nukleotida terkecil dengan Stiphodon atratus (HQ639080), Amblyeleotris sungami (FJ582714) dan Novem Genus (HQ639060). Selanjutnya, keseluruhan sampel dibandingkan dengan dua spesies dan satu genus baru tersebut. Berdasarkan hasil analisis melalui metode No. of differences pada basa pertama dan kedua, didapatkan hasil yaitu sampel no 4, 11, 12, 16, 18, 21, 22 dan 23 tidak mempunyai perbedaan nukleotida dengan Stiphodon atratus, sedangkan sampel no 5, 6, 10, dan 14 dibandingkan dengan Stiphodon atratus mempunyai jumlah perbedaan nukleotida masing-masing 7, 1, 7, dan 1 nt. Sampel no 19 dan 20 yang dibandingkan dengan Amblyeleotris sungami memiliki perbedaan nukleotida masing-masing sebanyak 9 dan 6 nt. Sampel no 3 yang dibandingkan dengan Novem Genus memberikan jumlah perbedaan nukleotida sebanyak 1 nt (Tabel 3). Analisis Filogeni Hasil rekonstruksi pohon filogeni menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x didapatkan dua klad besar (Gambar 3). Kekerabatan dari sampel no 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 21, 22 dan 23 menunjukkan bahwa sampel-sampel tersebut mengelompok dalam satu klad, sedangkan sampel no 19 dan 20 berada di luar percabangan klad. Sampel no 19 dan 20 mempunyai cabang nodus yang paling panjang dibandingkan dengan sampel lainnya, sedangkan sampel no 4 dan 11 tidak mempunyai cabang nodus. Berdasarkan hasil pengujian, didapatkan probabilitas dengan nilai yang tinggi yaitu sebesar 100% pada nodus nenek moyang di dalam percabangan klad. Tabel 1 Tahap, tanggal, dan waktu pengambilan sampel postlarva ikan Gobi Tahap Pengambilan Tanggal Pengambilan Waktu Pengambilan Pertama 10 Juni WIB Kedua 07 Juli WIB Ketiga 08 Juli WIB Keempat 10 Juli WIB Kelima 11 Juli WIB Gambar 1 Amplikon gen CO1 ikan Gobi di atas PAGE 6%. Keterangan: M=Marker atau penanda, 3-23=Nomor Sampel.

12 4 Tabel 2 Jumlah perbedaan nukleotida gen CO1 antar sampel postlarva ikan Gobi No. Sampel Keterangan: Angka di bawah diagonal merupakan jumlah perbedaan nukleotida pada triplet basa, angka di atas diagonal merupakan jumlah perbedaan nukleotida pada basa pertama dan kedua Gambar 2 Pengelompokan sederhana dari sampel postlarva ikan Gobi. Keterangan : nomor 1-5 merupakan nomor kelompok.

13 5 Tabel 3 Jumlah perbedaan nukleotida dan jarak genetik gen CO1 beberapa spesies Famili Gobiidae No. Sampel A. sungami Novem Genus S. atratus 3 0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,04 0,03 0,01 0,01 0,01 0,02 0,00 0, ,02 0,00 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0, ,02 0,03 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,05 0,05 0,02 0,02 0,02 0,03 0,02 0, ,02 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,04 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01 0, ,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,05 0,05 0,02 0,02 0,02 0,03 0,02 0, ,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0, ,00 0,00 0,00 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0, ,00 0,00 0,04 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01 0, ,00 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0, ,03 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0, ,01 0,03 0,03 0,03 0,02 0,03 0, ,03 0,03 0,03 0,02 0,03 0, ,00 0,00 0,01 0,00 0, ,00 0,01 0,00 0, ,01 0,00 0,00 A. sungami 1) ,01 0,01 Novem Genus 2) ,00 S.atratus 3) Keterangan : Angka di bawah diagonal merupakan jumlah perbedaan nukleotida pada basa pertama dan kedua yang didasarkan pada metode No. of differences, sedangkan angka di atas diagonal merupakan perbedaan jarak genetik pada basa pertama dan kedua yang didasarkan pada metode Kimura-2-parameter 1) GenBank Accession Number FJ ) GenBank Accession Number HQ ) GenBank Accession Number HQ639080

14 6 Gambar 3 Hasil rekonstruksi pohon filogeni beberapa spesies ikan Gobi berdasarkan ruas CO1 mtdna. PEMBAHASAN DNA Barcode Amplikon gen CO1 ikan Gobi mempunyai ukuran pita yang berbeda-beda dengan kisaran pb. Perbedaan ukuran pita yang terlihat pada gel poliakrilamid memperlihatkan bahwa sampel-sampel tersebut mempunyai panjang runutan nukleotida yang berbedabeda. Perbedaan panjang runutan nukleotida sebagai identifikasi awal perbedaan spesies. Pada gambar 1, sampel no 3 (Novem Genus) memiliki ukuran pita yang paling pendek. Elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamid mampu memisahkan DNA lebih akurat dibandingkan dengan gel agarosa, terutama untuk ruas DNA yang berukuran kurang dari 3000 pb. Pewarnaan sensitif perak lebih sensitif karena mampu mendeteksi DNA dengan kandungan yang lebih kecil dari 10 pg DNA/ mm 2 (Allen et al. 1984). Berdasarkan penelitian ini, pada spesies yang sama memperlihatkan bahwa jumlah perbedaan nukleotida antar sampel mencapai 9 nukleotida. Jumlah perbedaan nukleotida tersebut dianalisis dengan menggunakan metode No. of differences pada basa pertama dan kedua. Jika metode yang digunakan adalah metode Kimura-2-parameter pada basa pertama dan kedua, maka jumlah perbedaan jarak genetik antar sampel mencapai 0,02 atau 2% (Tabel 3). Avise (1998) mengemukakan bahwa jarak genetik pada spesies ikan yang sama kurang dari 2% dan kurang dari 0.1% dari taksa lain. Stiphodon atratus masuk ke dalam subfamili Sicydiinae. Subfamili ini memiliki delapan genus yang terdiri dari 80 hingga 90 spesies. Kedelapan genus tersebut yaitu Stiphodon, Sicyopus, Lentipes, Cotylopus, Sicyopterus, Sicydium, Akihito, dan Parasicydium. Setiap genus mempunyai daerah distribusi yang spesifik. Stiphodon atratus dapat ditemukan di Samudera Hindia bagian Timur hingga Samudera Pasifik bagian timur (Keith et al. 2010). Proses adaptasi dengan keadaan sekitar merupakan faktor yang sangat penting bagi siklus hidup ikan Gobi. Habitat ikan Gobi selalu berganti-ganti yaitu diantara air tawar, estuaria dan laut. Menurut Iida et al. (2010), tingkat salinitas dan suhu sangat berperan penting bagi pertumbuhan dan perpindahan (migrasi) Sicyopterus japonicus (Gobiidae). Keith et al. (2010) menemukan spesies Gobi yang belum terdeskripsikan dan hanya terdapat di samudera Hindia. Spesies Gobi ini merupakan genus baru (Novem Genus) dari subfamili Sicydiinae yang juga ditemukan dalam penelitian ini. Ikan genus Amblyeleotis merupakan jenis ikan dari famili Gobiidae yang bersimbiosis mutualisme dengan udang genus Alpheus. Dengan adanya hubungan mutualisme tersebut, ikan Gobi ini sering

15 7 disebut sebagai Gobi udang. Dalam simbiosis ini, satu atau dua ikan Gobi akan bekerja sama dengan satu atau dua udang. Dengan adanya interaksi yang stabil di antara kedua spesies tersebut, maka memberikan kemampuan untuk hidup yang lebih tinggi bagi keduanya. Selain itu, terdapat interaksi yang membutuhkan morfologi dan tingkah laku yang kompleks sehingga pada akhirnya akan menyebabkan ikan Gobi berevolusi dua kali dibandingkan dengan jenis Gobi yang tidak mempunyai hubungan mutualisme (Thacker et al. 2011). Hubungan filogeni antar famili Gobiidae Sekuen DNA mitokondria banyak digunakan dalam analisis pohon filogeni karena memiliki laju evolusi yang cepat (Bargelloni et al. 1994). Topologi pohon filogeni Neighbour Joining (NJ) digunakan untuk melihat kekerabatan antar spesies berdasarkan jarak genetik pada dua atau lebih nodus (Page & Holmes 1998). Suatu klad disebut pula sebagai suatu kelompok monofiletik. Menurut Zein & Sulandari (2009), suatu kelompok dikatakan bersifat monofiletik apabila keseluruh nodus yang dikelompokkan lebih dekat satu sama lain secara genealogis jika dibandingkan dengan kelompok lain yang berbeda garis keturunan. Berdasarkan hasil rekonstruksi pohon filogeni, didapatkan hasil yaitu terbentuk dua klad besar. Sampel no 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 21, 22 dan 23 mengelompok menjadi satu klad yang terdapat di dalam percabangan klad. Sekelompok taksa ini diduga berasal dari nenek moyang yang sama. Sampel no 19 dan 20 berada di luar percabangan klad. Taksa ini diduga berasal dari nenek moyang yang berbeda namun saling berkerabat dekat. Pohon filogeni terdiri dari sejumlah nodus (nodes) yang dihubungkan dengan cabang (branches). Nodus-nodus tersebut mewakili unit-unit taksonomi sedangkan cabang-cabang mewakili hubungan antar unit yang menggambarkan hubungan keturunan dengan leluhur (Zein & Sulandari 2009). Terdapat tiga macam nodus yaitu nodus terminal, nodus internal dan nodus nenek moyang. Nodus terminal disebut dengan OTU (Operational Taxonomic Units) merupakan organisme yang datanya akan digunakan untuk analisis filogeni. Nodus internal merupakan nenek moyang yang diperkirakan, sedangkan nodus nenek moyang merupakan nenek moyang dari semua organisme dan berada di pangkal percabangan atau akar (Page & Holmes 1998). Berdasarkan hasil rekonstruksi pohon filogeni, terlihat bahwa sampel no 19 dan 20 mempunyai cabang yang paling panjang dibandingkan dengan sampel lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa kedua sampel tersebut mengalami proses evolusi yang lama. Menurut Whelan et al. (2001) panjang cabang menggambarkan jumlah perubahan evolusioner yang terjadi. Keadaan yang berbeda terjadi pada sampel no 4 dan 11. Kedua sampel tersebut tidak mempunyai cabang. Hal ini dapat terjadi karena sampel no 4 dan 11 masuk ke dalam spesies yang sama dan hanya mempunyai perbedaan satu nukleotida. Berdasarkan pembahasan sebelumnya, dikatakan bahwa sampel no 3 dibandingkan dengan sampel no 19 memiliki jumlah perbedaan nukleotida yang paling besar. Hal ini dapat dilihat dari rekonstruksi pohon filogeni. Sampel no 19 memiliki cabang yang paling panjang, begitu pula dengan sampel no 3 yang memiliki cabang nodus yang relatif panjang. Perbedaan nukleotida yang besar ini menyebabkan sampel no 3 berada di dalam percabangan klad sedangkan sampel no 19 berada di luar percabangan klad. Panjang cabang dapat menunjukkan jarak genetik. Semakin panjang cabang maka semakin jauh jarak genetiknya dan mengartikan semakin jauh pula hubungan kekerabatannya (Zein & Sulandari 2009). Pohon filogeni yang telah direkonstruksi dengan metode Neighbor Joining dapat diuji tingkat kepercayaannya dengan menggunakan bootstrap. Dalam penelitian ini, dilakukan pengujian dengan bootstrap 1000X. Berdasarkan hasil pengujian, didapatkan probabilitas dengan nilai yang tinggi yaitu sebesar 100% pada nodus nenek moyang di dalam percabangan klad. Semakin tinggi nilai pengujian dengan bootstrap, maka data akan semakin valid (Zein & Sulandari 2009). Ipun-ipun menjadi sumber makanan yang penting bagi masyarakat Bengkulu. Dalam ipun-ipun, selain ditemukan kedua spesies dan satu genus baru tersebut, sering pula ditemukan spesies yang mempunyai nilai ekonomi tinggi yaitu sidat (Anguilla sp). Karena minimnya pengetahuan tentang ikan, banyak masyarakat menduga larva ikan sidat sebagai cacing yang tidak dapat dimakan, sehingga mereka membuang larva-larva tersebut ke tanah (Sipri 28 Juni 2012, komunikasi pribadi). Perlu dilakukan sosialisasi agar masyarakat tidak mengambil ipun-ipun secara berlebihan, agar ikan dewasa dari spesies-spesies tersebut dapat dipanen dan dimanfaatkan oleh masyarakat sekitar.

16 8 SIMPULAN Pada kumpulan postlarva ikan Gobi ditemukan dua spesies dan satu genus baru ikan gobi. Sampel no 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 21, 22 dan 22 teridentifikasi sebagai Stiphodon atratus, sampel no 19 dan 20 teridentifikasi sebagai Amblyeleotris sungami sedangkan sampel no 3 teridentifikasi sebagai Novem Genus (genus baru) dari subfamili Sicydiinae. DAFTAR PUSTAKA Allen RC, Saravis CA, Murer HR Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing of Protein. New York: Walter de Gruyter. Avise JC, Walker D, Johns GC Speciation durations and pleistocene effects on vertebrate phylogeography. The Royal Society 265: Bargelloni et al Molecular evolution at subzero temperatures: mitochondrial and nuclear phylogenies of fishes from Antarctica (suborder Notothenioidei), and the evolution of antifreeze glycopeptides. Molecular Biology and Evolution 11: Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH An effective method for silverstaining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry 385: Hajibabaei et al DNA barcode distinguish species of tropical Lepidoptera. PNAS 103: Iida et al Survival and behavioral characteristics of amphidromous goby larvae of Sicyopterus japonicus during their downstream migration. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 383: Larkin et al Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23: Lin CC A Field Guide to Freshwater Fish and Shrimps in Taiwan. Taiwan: Commonwealth publishing. Keith et al Phylogeny and biogeography of Sicydiinae (Teleostei: Gobiidae) inferred from mitochondrial and nuclear genes. Marine Biology 158: Kottelat M, Whitten AJ Freshwater Fishes of Western Indonesia and Sulawesi. Germany: Zoologische Staatssammlung. McDowall RM On amphidromy, a distinct form of diadromy in aquatic organism. Fish and Fisheries 8: Page RDM, Holmes EC Molecular Evolution: A phylogenetic Approach. United Kingdom: Blackwell Science. Pegg GG, Sinclair B, Briskey L, Aspden W MtDNA barcode identification of fish larvae in the southern Great Barrier Reef Australia. Scientia Marina 70: Subiyanto, Ruswahyuni, Cahyono DG Komposisi dan distribusi ikan pelagis di estuaria Pelawangan Timur, Segera Anakan, Cilacap. Saintek Perikanan 4: Syafrina RA Penggunaan DNA barcode sebagai alternatif identifikasi spesies udang mantis [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Thacker CE, Thompson AR, Roje DM Phylogeny and evolution of Indo-pacific shrimps-associated gobies (Gobiiformes: Gobiidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 59: Victor BC Coryphopterus kuna, a new goby (Perciformes: Gobiidae: Gobiinae) from the western Caribbean, with the identification of the late larval stage and an estimate of the pelagic larval duration. Zootaxa 1526: Victor et al The larval, juvenil and adult stages of the Caribbean goby, Coryphopterus kuna (Teleostei: Gobiidae): a reef fish with a pelagic larval duration longer than the post-settlement lifespan. Zootaxa 2346: Ward RD, Zemlak TS, Innes B, Last P DNA barcoding Australia s fish species. Philosophical Transactions of The Royal Society 360: Whelan S, Lio P, Goldman N Molecular phylogenetics: state-of-the-art methods for looking into the past. Trends in Genetics 17: Zhang JB, Hanner R DNA barcoding is a useful tool for the identification of marine fishes from Japan. Biochemical Systematics And Ecology 39: Zein MS, Sulandari S Investigasi asal usul ayam Indonesia menggunakan sekuens hypervariable-1 d-loop DNA mitokondria. Veteriner Maret 10:

17 LAMPIRAN 9

18 10 Lampiran 1 Gambar postlarva famili Gobiidae yang digunakan dalam penelitian. Keterangan : No 1-23 = No sampel. Gambar sampel 28

19 11 Lampiran 2 Tahapan Ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode GeneAid Ambil otot epaksial ±50 gram, masukkan ke tube 1,5 ml Homogenasi dengan grinder, tambahkan 200 µl buffer STE Cuci dengan air destilata, 2 kali pengulangan Sentrifugasi rpm selama 2 menit Homogenasi dengan grinder, tambahkan 200 µl buffer STE Pindahkan kolom GD ke tabung koleksi baru, buang supernatan Tambahkan 20 µl proteinase K ke dalam tabung Tambahkan 400 µl buffer W1 ke dalam tabung Inkubasi pada suhu 60 0 C selama 30 menit (bolak balik tiap 5 menit) Sentrifugasi rpm selama 30 detik Tambahkan 200 µl buffer GB dan vortex selama 5 detik Buang supernatan, letakkan kolom GD kembali ke dalam tabung Inkubasi pada suhu 70 0 C selama 20 menit (bolak balik tiap 5 menit) Tambahkan 600 µl wash buffer ke dalam kolom GD Di saat yang bersamaan, inkubasi buffer elusi pada suhu 70 0 C Sentrifugasi rpm selama 30 detik Tambahkan 200 µl etanol dan vortex selama 10 detik Buang supernatant, letakkan kembali kolom GD ke tabung Pindahkan sampel ke kolom GD pada tube 2 ml Sentrifugasi rpm selama 3 menit

20 12 Pindahkan kolom GD ke tube 1,5 ml yang baru Tambahkan 100 µl buffer elusi ke dalam kolom GD Diamkan selama 5 menit Sentrifugasi rpm selama 30 detik Buang kolom GD dan didapatkan DNA yang telah berhasil diekstraksi

21 13 Lampiran 3 Tahapan visualisasi fragmen DNA produk PCR Gel yang telah dielektroforesis dikeluarkan dari kaca gel Buang larutan A ke dalam botol khusus Ag Bilas dengan air destilata ±200 ml Bilas dengan air destilata ±200 ml Buang air destilata dengan alat vakum penyedot Rendam gel dalam larutan B yang telah ditambahkan formaldehid Rendam gel dalam larutan A (DW 200 ml, AgNO 3 0,2 gram, NaOH 10N 80 µl, amonia 0,8 ml) selama 8 menit Buang air destilata dengan alat vakum penyedot Di saat yang bersamaan, panaskan larutan B (DW 200 ml, NaOH 6 gram, pada suhu 55 0 C) Rendam gel direndam dalam larutan C (DW 100 ml, Asetat 100 µl) selama 2 menit

22 14 Lampiran 4 Hasil pensejajaran ruas gen CO1 dari beberapa spesies famili Gobiidae 1 3-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAATTAAGTCAACCTGGAGCCCTTCTAGGAGATGACCAGATTTATAATGTAATTGT AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT 3 5-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT 4 6-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT 5 10-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT 6 11-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT 7 12-AF_282.ab1 GCCATAAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT 8 14-AF_282.ab1 GCCCTAAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTATAATGTAATTGT 9 16-AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTACTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT AF_282.ab1 GCTTTAAGCCTCCTAATCCGGGCTGAGCTAAGTCAACCTGGCGCCTTATTAGGTGATGACCAAATCTATAACGTTATTGT AF_282.ab1 GCTTTAAGCCTCCTAATCCGGGCTGAGCTAAGTCAACCTGGCGCCTTATTAGGTGATGACCAAATCTATAACGTTATTGT AF_282.ab1 GCCATTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT AF_282.ab1 GCCATAAGCCAACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT AF_282.ab1 GCCCTTAGCCTACTCATCCGAGCTGAACTAAGCCAACCTGGGGCTCTTCTAGGTGACGACCAAATTTACAATGTAATTGT 1 3-AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTGATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATAATTGGAGGCTTTGGAAACTGGCTCATCCCCC AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC 3 5-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC 4 6-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC 5 10-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGAAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC 6 11-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC 7 12-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC 8 14-AF_282.ab1 TACTGCACATGCTTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATGATTGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCCC 9 16-AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATCATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGATTTGGAAACTGACTAATCCCAC AF_282.ab1 CACCGCCCACGCATTTGTTATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGGTTTGGGAATTGACTAATTCCAC AF_282.ab1 CACCGCCCACGCATTTGTTATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGGTTTGGGAATTGACTAATTCCAC

23 AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC AF_282.ab1 TACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATTATGATTGGAGGCTTTGGAAACTGACTAATCCCAC 1 3-AF_282.ab1 TAATGATCGGAGCCCCTGACATGGCCTTCCCTCGTATGAACAACATGAGCTTTTGGCTCCTCCCTCCCTCATTCCTGCTC AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT 3 5-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT 4 6-AF_282.ab1 TAATGATTGGTGCCCCCGACATGGCTTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGGCTGCTTCCTCCATCATTCCTTCTT 5 10-AF_282.ab1 TAATGATCGGGGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT 6 11-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT 7 12-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT 8 14-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCCCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTGCTTCCTCCCTCATTCCTTCTT 9 16-AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT AF_282.ab1 TAATAATTGGCGCCCCTGATATGGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGCTTTTGACTGTTGCCTCCTTCCTTCCTCCTG AF_282.ab1 TAATAATTGGCGCCCCTGATATGGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGCTTTTGACTGTTGCCTCCTTCCTTCCTCCTG AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT AF_282.ab1 TAATGATCGGCGCCCCTGACATGGCCTTTCCTCGAATAAATAACATGAGCTTTTGGCTTCTTCCCCCATCATTCCTTCTT 1 3-AF_282.ab1 CTCCTGGCATCTTCAGGCGTCGAGGCAGGAGCTGGCACTGGTTGAACAGTTTACCCCCCTCTGGCAGGAAACCTTGCTCA AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA 3 5-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA 4 6-AF_282.ab1 CTTCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTATCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCTCA 5 10-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA 6 11-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA 7 12-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA 8 14-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCTGGAGCTGGGACTGGCTGAACAGTTTACCCCCCACTAGCAGGAAACCTTGCCCA 9 16-AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGTTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA

24 AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA AF_282.ab1 CTACTTTCTTCTTCTTGAGTCGAGGCAGGAGCCGGGACAGGATGAACGGTCTACCCCCCGCTAGCAGGGAACCTTGCACA AF_282.ab1 CTACTTTCTTCTTCTTGAGTCGAGGCAGGAGCCGGGACAGGATGAACTGTCTACCCTCCGCTAGCAGGGAACCTTGCACA AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA AF_282.ab1 CTCCTAGCCTCCTCAGGAGTTGAAGCAGGGGCTGGAACTGGCTGAACAGTTTACCCTCCCCTAGCAGGAAACCTTGCTCA 1 3-AF_282.ab1 TGCCGGAGCTTCTGTCGACCTGACAATTTTCTCACTTCACTTAGCCGGGATTTCGTCTATCTTAGGTGCAATTAATTTTA AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA 3 5-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA 4 6-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA 5 10-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCGATTAACTTTA 6 11-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA 7 12-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA 8 14-AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGACCTTACAATTTTCTCCCTACACTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA 9 16-AF_282.ab1 CGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCGGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA AF_282.ab1 CGCTGGGGCATCAGTAGACCTCACTATTTTCTCCTTACATCTCGCTGGTATTTCCTCAATTCTTGGGGCTATCAATTTTA AF_282.ab1 CGCTGGGGCATCAGTAGACCTCACTATTTTCTCCTTACATCTCGCTGGTATTTCCTCAATTCTTGGGGCTATTAATTTTA AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA AF_282.ab1 TGCAGGAGCTTCTGTTGATCTCACAATTTTCTCCCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATTTTAGGTGCAATTAATTTTA 1 3-AF_282.ab1 TTACAACCATCCTAAATATGAAACCCCCTGCAATCTCGCAATACCAGACACCATTGTTTGTCTGGGCTGTCCTCATTACA AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCTCACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA 3 5-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCTCACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA 4 6-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTCCTTATTACA 5 10-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCGTGCAATCTCACGATACCAGACACCACTGTGTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA

25 AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCTCACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA 7 12-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA 8 14-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATCACACAATACCAGACACCCCTGTTTGTCTGAGCTGTCCTTATTACA 9 16-AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTACTTATCACA AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTACTTATTACA AF_282.ab1 TCACCACAATTCTAAATATGAAACCCCCGGCCATTTCTCAGTACCAGACGCCCCTGTTCGTATGAGCAGTACTAATCACC AF_282.ab1 TCACCACAATTCTAAATATGAAACCCCCGGCCATTTCTCAGTACCAAACGCCCCTGTTCGTATGAGCAGTACTAATCACC AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTACTTATTACA AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTGTGAGCTGTACTTATTACA AF_282.ab1 TTACAACCATTCTAAACATGAAACCCCCTGCAATTTCACAATACCAAACACCCCTGTTTGTATGAGCTGTACTTATTACA 1 3-AF_282.ab1 GCAGTTCTTCTGCTTCTTTCCCTCCCAGTACTTGCAGCCGGTATTACAATACTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC 3 5-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCCAAATCTGTACACAAC 4 6-AF_282.ab1 GCAGTCCTACTGCTTCTCTCCCTACCTGTCCTTGCAGCTAGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC 5 10-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTAGCATTACGATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC 6 11-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC 7 12-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC 8 14-AF_282.ab1 GCAGTTCTACTGCTTCTTTCTCTACCTGTTCTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGATCGAAATCTAAACACAAC 9 16-AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC AF_282.ab1 GCCGTGCTTTTACTTCTCTCACGGCCAGTACTTGCTGCCGGCATTACAATGCTTCTCACAGACCGAAATCTAAATACAAC AF_282.ab1 GCCGTGCTTTTACTTCTCTCACTGCCAGTACTTGCTGCCGGCATTACAATGCTTCTCACAGACCGAAATCTAAATACAAC AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC AF_282.ab1 GCAGTTCTGCTTCTTCTCTCCCTCCCTGTACTTGCAGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGAAACCTAAACACAAC

26 AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGTGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATCCTGATTCTTGGG AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATCCTGATTCTTCGA 3 5-AF_282.ab1 CTTCTGTGACCCCTCAGGAGGCGCAGACCCAAATCTTAACCAACACGTATCCTGAGTCTTTGT 4 6-AF_282.ab1 CTTCTTTGATCCCTCAGGAGGCGGTGATCCAATTCTTTACCAACACCTATCCTGATTCTTCGA 5 10-AF_282.ab1 CTTCTGTGACCCCTCAGGAGGCGGTGACCCAGTTCTTTACCAACACCTATCCTGATTCTTTGG 6 11-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG 7 12-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG 8 14-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTTTACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG 9 16-AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGA AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG AF_282.ab1 ATTCTTTGATCCTGCAGGAGGAGGAGACCCCATTCTTTACCAACGGGTATCTTGATTCTTCGG AF_282.ab1 ATTCTTTGATCCTGCAGGAGGAGGAGACCCCATTCTTTACCAACACCTATTTTGATTCTTCGG AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATCCTGATTCTTCGG AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCGTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATTCTGATTCTTCGG AF_282.ab1 CTTCTTTGACCCCTCAGGAGGTGGTGACCCAATTCTATACCAACACCTATGCTGATTCTTGGA