OPTIMASI PEMBUATAN KIT IRMA CA 125

Transkripsi

1 16 ISSN Agus Ariyanto, dkk. OPTIMASI PEMBUATAN KIT IRMA CA 125 Agus Ariyanto., Siti Darwati, Gina Mondrida, Fitri Yunita, Puji Widayati, Sri Setiyowati, sulaiman, V. Yulianti dan Triningsih Pusat Pengembangan Teknologi Reaktor Riset, Serpong ABSTRAK OPTIMASI PEMBUATAN KIT IRMA CA-125. Telah dilakukan penelitian optimasi pembuatan kit IRMA CA-125 yang meliputi pembuatan perunut monoklonal anti Ca-125 bertanda 1251 dan pembuatan "coated tube". Oksidator yang digunakan adalah khloramin- T dan N-bromosuksinimid dengan memvariasikan jumlah oksidator yang digunakan pada penandaan. Optimas( pembuatan "coated tube" dilakukan dengan memvariasikan volume larutan "coating", pengaruh pencucian,-peng;;'ruh penambahan BSA, pengaruh bufer pelarut dan uji pcmas,mgan mo/wklo/wl anti CA-125. Hasil pcrcobaan memmjukkan bahwa oksidator Kloramin T dapat digunakan wltuk pembuatan perunut monoklonal anti Ca-125 dengan rendemen cukup tinggi yaitu 96.5 % dan kemumielll radiokimia 93.2 %. ]umlah oksidator yang optimal adalah 10 ug. Optimasi pembuatan "coated tube" Imtuk monoklarzal anti Ca-125 memberiktlll volume yang optimal 300 ul. Sedangka/I pencucielll dan penambahan BSA 0.1 % terlalu berpe/igaruh terhadap nilai NSB. Bufer yang sesuai untuk pembuatan "coated tube" adalah bl~fer bicarbonat. Untuk pemasangan monoklonal anti CA-125 diketahui bahwa monoklo/lal anti CA-125 M37203M dapat digwzakan sebagai peru nut sedangan monoklonal anti CA-125 M89694M sebagai "coating solution". Kala kllllci : Optimasi, IRMA, monoklonal anti CA-125, penlm~t ABSTRACT OPTIMATION FOR CA-125 IRMA KIT PRODUCTION. Optimation 0/1 the production of CA-125 IRMA kit has been studied. involving preparatio/i of 125/./abded monoclonal eii/ti CA-125 as a tracer alld production of coated tubes. Cllioramin- T and N-bro,,!osuccinimide were used as oxidators by varying them in their quatity. Optimation on preparation of coated tube JI'tIScarried out usi/ig <'ariation ill vollwle of coating solution, effect of washing, addition of BSA 0.1 %, buffer and pairing test for the monoclonal anti CA-125. The results show that cllioramin- T matched with the tracer of monoclonal anti CA-15 providing a high yield at about 96.5 % and radiochemical purity 93.2 %. Optimum oxidazing agent is 10 ug. Optimum volume for preparating monoclonal a/lti CA-125 coated tube is 3011.ul The noli specific binding (NSB) was found to be unaffected by washing step alld addition of BSA 0.1 %. A suitable buffer for coated tube preparation was bicarbonat buffer. It JI'tISSllOlI'/1that the monoclonal anti CA-125 M37203M used for tracer can be paired with monoclonal anti CA-125 M89694M Iised for coating solutio/i. Key words.' Optima/ion, IRMA, monoclonal anti CA-/25, Tracer PENDAHULUAN Cancer Antigen 125 (CA-125) adalah sejenis glikoprotein yang bersifat antigenic sehingga dapat bereaksi dengan monoklonal antigen. CA-125 ini merupakan tumor marker yang dapat digunakan secara klinik untuk memonitor pasien yang mempunyai penyakit kanker ovarium (1). Pada kondisi normal CA-125 dapat ditemukan di dalam cairan amnion sebagai derivat jaringan epitel "fetal coelemic". Antigen ini ditemukan pula pada jaringan wanita dewasa seperti jaringan epitel "tuba fallopian", endomentrium, endocervix pleura, dan rongga perut(2). Peningkatan level atau konsentrasi CA 125 di dalam darah sangat berhubungan dengan adanya perkembangan kanker pada pasien. Proses "gynecological" seperti inflamasi pada pelvic, endometriosis dan menstruasi juga memberikan 'peningkatan adanya CA-125(2). Kandungan CA-125 di dalam serum darah pasien yang normal ( <35 D/ml). Di Amerika kanker ovarium kanker merupakan penyebab kematian yang nomoi' 5 dan merupakan penyebab kematian paling tinggi pada kanker-kanker "gynecologic". Di Indonesia berdasarkan data dari Yayasan Kanker Indonesia tahun 1991 bahwa kanker ovarium ini menduduki peringkat ke 6 terbanyak(4) P3TM-BATAN Yogyakarta, 8 Juti 2003

2 Ag/ls Ariyallto, dkk. ISSN /7 Selain untuk pemeriksaan kanker ovarium CA-125 dapat juga digunakan untuk pemeriksaan kanker-kanker sbb : - kanker leher rahim - kanker corpus - kanker cervik - kanker endometrium Teknik pemeriksaan CA-125 umumya dilakukan dengan ultra-sonografi secara langsung atau melalui invitro assay dengan menentukan kadar atau levelnya pada serum darah pasien (5). Dewasa ini telah banyak pereaksi atau kit yang beredar dipasaran baik yang non radioaktif maupun yang radioaktif untukm pemeriksaan serum secara in vitro. Sebagian besar pereaksi tersebut merupakan produk import yang harganya cukup mahal y, sehingga pemeriksaanj pendeteksian dini kanker tersebut sulit untuk dilaksanakan bagi pasien berpenghasilan rendal1.. Dalam makalah ini dilaporkan optimasi pembuatan kit IRMA CA-15 dalam upaya pereaksi dapat dibuat di dalam negeri agar terjangkau oleh masyarakat TATA KERJA Bahan yang digullakan Monoklonal anti-ca-125 (Biodesign International USA), Human CA-125 antigen calibrator grade (Biodesign International), USA, Bovine serum albumin (Sigma), normal mouse serum (CIAE, China), Kit IRMA CA 125 (CIAE China), NaH2P04.H20 dan Na2HP04.7H20 dari E Merck, Kolom PD-I0 dari Pharmacia. Nal25I didapat dari rdion Canada dan P2RR Batan, NaHC03 dari Sigma, Tabung dasar bintang dari NUNC Alat yang digullakall Pencacah Gamma (Nucleus), Centrifuge (CS-15 Beckman), inkubator (Eyela), berbagai macam ukuran pipet eppendorf, vortex. Cara Kerja 1. Penandaan Monoklonal meng-gunakan metode dengan 1251 anti-ca 125 kloramin-t Kedalam tabung dimasukkan 10 ul larutan monoklonal anti-ca 125 (10 ug larutan monoklonal anti CA-125 dalam 10 ul larutan bufer fosfat salin 0,025 M ph 7,4) dan tambahkan 20 ul bufer fosfat 0,2 M ph 7,4, dan 450 uci larutan Nal25I, kemudian tambahkan Kloramin-T sesuai dengan variasi 5, 10, 20 ug. Selanjutnya campuran dikocok selama 2 menit menggunakan vorteks, lalu ditambahkan 10 ul larutan Na2~04 ( Img Na2S204 dalam 1011bufer fosfat salin 0,25 M ph 7,4). Selanjutnya tambahkan 50 ullarutan KI 50 %. Campuran rekasi dibiarkan selama 2 merlit. Hasil penandaan dimurnikan dengan menggunakn kolom PD-I0 yang telah dikondisikan dengan bufer fosfat 0,01 M ph 7,4 dan dijenuhkan dengan 1 mllarutan BSA 10 %. Kolom PD-10 kemudian dielusi dengan bufer fosfat 0,01 M ph 7,4. Sebanyak 500 ul eluat ditampung per fraksi dengan tabung reaksi. Eluat dalam tabung kemudian dicacah dengan pencacah gamma. Rendemen, kemurnian radiokimia dan aktifitivitas spesific ditentukan dengan menggunakan rumus berikut: % Rendcmcn.: Na1251 dim fraksi antibodi X 100 % Total radioaktif yang digunakan %Kemumian Radiokimia= Na1251 fraksi antibodi X 100 % oakh\'itas dalam produk Aktivitas Spesifik = HasH rendemenxtotal Radioakt. Massa dari antibodi 2. Penandaan MonoklonaI anti-ca 125 meng-gunakan metode N-Bromo-suksinimid dengan 1251 Kedalam tabung dimasukkan 10 ul anti CA 125 (lihat tatakerja 1) lalu tambahkan 20 ul larutan bufer fosfat 0,2 M ph 7,4 dan 450 uci larutan Na125I,kemudian tambahkan 10 ullarutan N-Bromosuksinimid dengan variasi larutan N-Bromosuksinimid 5, 10, 20 ug. Campuran divortek selama 120 detik, lalu kedalam larutan campuran ditatnbahkan 200 ul larutan bufer fosfat salin 0,01 M ph 7,4. Kemudian tambahkan 50 ul larutan KI 50 %. Campuran reaksi dibiarkan selama 2 menit. Hasil penandaan dimurnikan dengan memasukkan campuran reaksi kedalam kolom PD-I0 yang telah dikondisikan dengan larutan bufer fosfat 0,01 M ph 7,4 dan dijenuhkan dengan 1 ml larutan BSA 10 %.. Kolom kemudian dielusi dengan larutan bufer fosfat 0,01 M ph 7,4. Sebanyak 500 ul eluat ditampung per fraksi dalam tabung reaksi. Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir

3 18 ISSN Agus Ariyallto, dkk. Eluat dalam tabung dicacah dengan pencacah gamma. Rendemen, kemurnian radiokimia dan aktifitivitas spesific ditentukan seperti 1. U '".<: rj c: '" I w '" 3. Pembuatan "coated tube" Otimasi pembuatan dilakukan dengan memvariasikan volume larutan "coating" yang dimasukkan kedalam tabung (300, 400, 500, 600 ul) yang telah ditentukan titernya. Tabung diinkubasikan semalam pada temperatur 4 C. Pada tahap pencucian dilakukan juga variasi tanpa pencucian dan pencucian dengan aqua demin. Tabung hasil pencucian dengan aqua demin sebagian diblok o Tabung Gambar 1. Fraksi hasil penandaan monoklonal anti CA-125 dwgan ,05 M PBS[ ph,4) dan sebagian lain tanpa diblok. dengan 300 Kenlil U12,1utan ian tabung-tabung BSA (0,1 %BSAtersebut dalam diinkubasikan semalam pada temperatur 4 C. Tabung kemudian dicuci 300 ul larutan 0,05 M PBS ph 7,4 sebanyak (ug) kali.pengaruh jumlah volume larutan "coating", pencucian dan penambahan larutan BSA 1 % akan diuji secara statistik menggunakan uji t. Pengaruh larutan bufer terhadap larutan "coating" juga diamati dengan menggunakan larutan yaitu bufer fosfat M ph 7,4 dan bufer bicarbonat 0.01 M ph 8,5 4. Pembuatan standar Konsentrasi larutan standar yang disiapkan adalah 0, 25, 50, 100, 200 dan 500 miu/mi. Pembuatan larutan standard CA-125 menggunakan Human CA-125 calibrator grade (Biodesign USA) yang 1. (ug) dilarutkan dengan Bovine Serum Albumin 1 % dalam larutan 0,05 M PBS ph 7,4. mju/ml Vol olarutan ul u) ul ulvo. stock ul ul BSA I % TabeI 1. PenggUllaall oksidator klora11lin- T Sedangkan bromosu ksinim id lebih rendah dari Tabel wltuk penalldaall 11lonokonal allti-ca 125 Jmloksidator radiokimia , ,6 60 Kemumian 97, Rendemen % % 2 berikut) Jm) rddiokimia oksidator ,9 80,4 Kemumian 1,2 3,4 94,2 90 ('x. Rendemen ) % oksidator N- memberikan rendeman pada kloramin-t ( lihat TabeI 2. Pengaruh ju 111lalz oksidator N brolllosllksinimid IIntlik penandaall Illonoklonal anti- CA 125 HASIL DAN PEMBAHASAN Dari hasil penandaan diketahui bahwa jumlah oksidator akan berpengaruh terhadap hasil rendemen penandaan (Tabel I dan Tabel II) Penggunaan 10 ug oksidator kloramin-t mampu meningkatkan hasil rendemen penandaan cukup tinggi sampai 96.5 % (lihat Gambar 1). Penggunaan 5 ug oksidator N bromosuksinimid memberikan persentase hasil rendemen yang maksimum (35,9 %), tetapi lebih rendah jika dibandingkan dengan oksidator kloramin-t. Hal ini disebabkan karena. kloramin-t merupakan oksidator kuat sehingga dapat mengoksidasi 1251 menjadi 1251+secara optimal. Tabel 3. memperlihatkan pengaruh jumlah volume larutan "coating" dan pencucian pada pembuatan" coated tube" monoklonal anti CA 125. Nilai NSB dan B/Tnya hampir tidak berbeda nyata, bila dilakukan pencucian terhadap "coated tube" meskipun volume larutan "coating" bervariasi Prosiding Pertemuan dan Presentasi IImiah Penelitian Dasar IImu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir

4 Agus Ariyal/to, dkk. ISSN antara 300 ul sampai 600 ul. Oari uji t didapatkan nilai t dari perhitungan yaitu 0.5 untuk NSB dan 0,17 lebih kecil dari t di tabel (t(,,05 = 2,45, t("ol = 3,71)i dengan ini dapat dikatakan bahwa Bufer jumlah Bufer bicarbonat fosfat volume M Mlarutan "coating" dan pencucian dalam proses pembuatan "coated tube" tidak berpengaruh terhadap nilai NSB maupun % BIT. Tabel 3. Pengaruh digunakan pembuatan ani CA 125 Volume % Dengan NSB 9.6 BIT NSB pencucian Tanpa pencucian jumlah volume yang dan pencucian pada "coated tube" manaklanal Penambahan Bovine Serum Albumin (BSA) 1 % yang tujuannya untuk menurunkan nilai NSB ditunjukan Tabel3. Tabel 5. Pengaruh jenis bufer yang digunakan sebagai pelarut manaklanal anti CA 125 untuk "caaed tube" Bufer % BIT%NSB Oari Tabel 5. juga diketahui bahwa nilai % NSB kedua bufer memberikan nilai yang relatif tidak begitu berbeda sedangkan untuk nilai % B/Tnya bufer bicarbonat memberikan nilai % yang lebih tinggi (16.93 %) dari sini dapat dikatakan bahwa bufer bicarbonat lebih baik dari pada bufer fosfat. Penggunaan monoklonal antibodi untuk pembuatan pereaksi kit IRMA memerlukan penelusuran jenis monoklonal yang mempunyai "binding site" yang cocok satu sarna lain sehingga dapat memberikan nilai % NSB yang rendah dan nilai % BIT yang tinggi. Pada penelitian ini digunakan hanya 2 jenis monoklonal anti CA-125 masing-masing M37203M dan M86924M yang diperoleh dari Biodesign International Co. Tabel 4. Pcngaruh penambahalz landan 1 % (BSA) tcrlwdap nilai NSB dalz % Bjf I Volume % NSB BIT % NSBSA BIT Tanpa 1 % BSA 1 % M37203M M86924M Pe~unut M37203M Tabel 6. Pengaruh pasangalz mol/aklonal alzti CA 125 tcrlwdap Izilai % NSB dalz % Bjf. Pasangan % BIT coated M86924M M37203M r-.n7203m antibodi tube % NSB Tabel 4. memperlihat bahwa penambahan larutan BSA 1 % dan tanpa penambahan larutan BSA 1 % tidak begitu berpengaruh terhadap penurunan nilai NSB% ini dapat dibuktikan secara uji t bahwa nilai t terhitung (1,447) lebih rendah dari t(,.05= 2,45 atau t(,,01 = 3,71. Sedangkan untuk % BIT ternyata berpengaruh, terlihat bahwa % BIT pada penambahan larutan BSA 1 % lebih rendah (rata-rata 9,8 %) dibandingkan dengan tanpa penambahan BSA 1 % (rata-rata 12,8 %). Hal ini terjadi karena proses pencucian sebelum penambahan BSA 1 % kemungkinan ada monoklonal anti CA 125 yang terbawa sehingga menurunkan nilai % BIT. Secara uji t juga didapat dibuktikan bahwa harga t terhitung (16,8) lebih tinggi dari pada harga t(,,05=2,45 atau t("ol= 3,71 Tabel 6 memperlihatkan bahwa pasangan monoklonal M37203M sebagai peru nut dan monoklonal M86924M sebagai "coated tube" merupakan pasangan yang paling sesuai karena dapat memberikan nilai % NSB (0.21 %) yang paling rendah dan nilai % BIT yang tertinggi (26.11 %). KESIMPULAN Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa oksidator kloramin-t dapat digunakan sebagai oksidator untuk menandai monoklonal anti CA-125 menggunakan 1251 dengan rendemen penandaan 96.5 % dan konsentrasi kloramin-t yang optimum adalah sebesar 10 ug. Sedangkan untuk volume larutan "coating" yang baik adalah 300 ul dan pencucian pada proses pembuatan "coated

5 20 ISSN Agus Ariyanto, dkk. tube" tidak perlu dilakukan, begitu juga untuk penambahan BSA 1 %. Pasangan monolonal anti CA 125 yang cocok adalah M37203M sebagai peru nut dan M89624M sebagai "coated tube", sedangkan bufer yang baik untuk pelarut monoklonal untuk "coating" adalah bufer bicarbonat 0.01 M. DAFfARPUSTAKA 1. SCHARL A, CROMBACH G, VIERCHEM M, BOLTE A ; The use of CA 125 as a tumor marker for adenocarcinomas ofen do cervix, endometrium and fallofian tube tumor diagnostic and theraphie, 10 (1989): VIJAY NA TH MD; Ovarium Tumor Markers : Cancer Antigen 125: PersonalMD.com Medical Contributor, 24 October ~; 3. LANDIS SH, MURRAY T, BOLDEN S, ET AL ; zcancer Statistics, Ca-A Cancer Journal for Clinicians 49(1):8-31, DIREKTORAT JENDRAL PELAYANAN MEDIK DEPARTEMEN KESEHATAN R I BADAN REGISTRASI KANKER lkatan AHLI PATOLOGI INDONESIA, YAYASAN KANKER INDONESIA; Kanker di Indonesia Tahu Data Histopatologik. 5. ROSE DAHER PhD; Cancer Antigen 125 (CA 125) in Serum By Microparticle Enzym Immunoassay (MEIA): Laboratory Medicine 25(3); , 1994 P3TM-BATAN Yogyakarta. 8 Juli 2003