METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 III. METODOLOGI PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pengawasan Mutu, dan Bioindustri, Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Analisis komposisi asam lemak pada minyak ikan yang telah terhidrolisis dilakukan di Pusat Laboratorium Forensik, Mabes Polri, Jakarta Selatan. Waktu penelitian dimulai dari bulan Oktober 2009 sampai Januari B. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah kontainer gelas (berdiameter 4 cm dan tinggi 7 cm), gelas piala, buret, labu ukur (10, 25 dan 250 ml), labu erlenmeyer (100, 250 dan 300 ml), pipet Mohr (1, 5, 10 dan 25 ml), pipet volumetri (5, 10 dan 25 ml), labu soxhlet, syringe 10 ml, cling film, aluminium foil, wax (malam), rotary vacuum evaporator, shaker water bath dan GC-MS (gas chromatography mass spectrophotometry). Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah minyak ikan lemuru (Sardinella sp.) yang sudah dirafinasi (dari UD Tarbiyah, Banyuwangi), lipase dari Aspergillus niger (dari Amano Enzyme), toluena, gas nitrogen (Ultra High Purity) dan distilled water. Alat dan bahan yang digunakan pada analisis bilangan penyabunan, analisis bilangan asam dan pengukuran aktivitas lipase dapat dilihat pada metode pengukuran dari masing-masing analisis yang tercantum pada Lampiran 1 dan 2. C. Tata Laksana Penelitian Untuk melakukan penelitian ini, dilakukan pentahapan kerja seperti yang tertera pada Gambar 4. 18

2 Mulai Karakterisasi Minyak Ikan Pengukuran Aktivitas Enzim dengan Metode Spektrofotometri Penentuan Kondisi Terbaik Faktor yang Berpengaruh Analisa Produk Akhir (Kandungan EPA dan DHA) dengan menggunakan GC-MS Selesai Gambar 4. Diagram alir penelitian 1. Karakterisasi Minyak Ikan Karakterisasi minyak ikan dilakukan dengan tujuan mengetahui komposisi bahan di dalam minyak ikan yang akan diteliti. Karakterisasi komposisi minyak ikan meliputi pengukuran bilangan asam dan bilangan penyabunan. Berdasarkan data yang diperoleh dari kedua hasil pengukuran tersebut, maka dapat diketahui derajat hidrolisis pada reaksi ini. Prosedur analisis karakterisasi minyak ikan dapat dilihat pada Lampiran Pengukuran Aktivitas Lipase secara Spektrofotometri Pengukuran aktivitas lipase dilakukan untuk mengetahui aktivitas lipase dari Aspergillus niger yang akan digunakan. Prosedur yang digunakan 19

3 untuk mengukur aktivitas lipase secara spektrofotometri ini dapat dilihat pada Lampiran Hidrolisis Enzimatis Hidrolisis enzimatis terhadap minyak ikan dilakukan sebanyak dua kali. Hidrolisis enzimatis yang pertama dilakukan tanpa rekayasa media (tanpa penambahan pelarut) dan hanya menggunakan air destilata yang terkandung di dalam larutan buffer sebagai pereaksinya. Kemudian hidrolisis enzimatis yang kedua dilakukan melalui rekayasa media, yaitu dengan penambahan pelarut. Pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah toluena. Prosedur hidrolisis enzimatis ini dapat dilihat pada Lampiran Penentuan Pengaruh Faktor Penambahan air, Suhu dan ph Faktor berpengaruh terhadap penelitian ini yang akan diujikan adalah penambahan air, suhu dan ph. Variasi penambahan air yang akan diujikan terletak pada lima titik berselang antara 1%-5%. Variasi suhu yang diujikan terletak pada lima titik berselang antara o C. Sedangkan variasi ph yang diujikan terletak pada lima titik berselang antara 5-9. Pada hidrolisis enzimatis di dalam media air diberlakukan dua faktor, yaitu faktor suhu dan ph. Kedua faktor optimum ini akan digunakan sebagai faktor pada tahapan selanjutnya, yaitu hidrolisis enzimatis di dalam media yang ditambahkan pelarut toluena. Pada tahapan ini, faktor yang akan diujikan meliputi faktor penambahan air, ph dan suhu. Pengukuran yang dilakukan terhadap sampel meliputi pengukuran bilangan asam dan pengukuran kandungan omega-3 (asam dokosaheksanoat dan asam eikosapentanoat) pada hasil reaksi hidrolisis dengan menggunakan GC-MS. Pengukuran bilangan asam digunakan untuk menghitung besarnya tingkat hidrolisis yang merupakan parameter dalam penelitian ini. 20

4 5. Rancangan Percobaan a) Hidrolisis enzimatis tanpa penambahan pelarut 1) Pengaruh suhu (tinggi 7 cm dan diameter 4 cm) kemudian dimasukkan gas nitrogen murni selama 30 detik, tutup wadah dengan sumbat karet, cling film dan wax untuk mencegah masuknya oksigen. Persiapkan lipase dari Aspergillus niger sebanyak 800 Unit (200 U/g substrat) ke dalam larutan buffer fosfat ph 7, 1 M sebanyak 6 ml. Suntikkan larutan enzim tersebut ke dalam wadah gelas. Kemudian masukkan wadah tersebut ke dalam shaker water bath sesuai temperatur yang akan diujikan (25, 35, 45, 55, dan 65 C) dengan kecepatan 200 rpm selama 48 jam. Tabel 7. Rancangan berbagai perlakuan suhu pada media air Run Suhu ph 1 25 o C o C o C o C o C 7 o 2) Pengaruh ph (tinggi 7 cm dan diameter 4 cm) kemudian dimasukkan gas nitrogen murni selama 30 detik, tutup wadah dengan sumbat karet, cling film dan wax untuk mencegah masuknya oksigen. Persiapkan lipase dari Aspergillus niger sebanyak 800 Unit (200 U/g substrat) ke dalam larutan buffer fosfat 1 M sebanyak 6 ml sesuai dengan ph yang akan diujikan (5, 6, 7, 8 dan 9). Suntikkan larutan enzim tersebut ke dalam wadah gelas. Kemudian masukkan wadah tersebut ke dalam shaker water bath sesuai ph yang akan diujikan (temperatur 45 o C) dengan kecepatan 200 rpm selama 48 jam. 21

5 Tabel 8. Rancangan berbagai perlakuan ph pada media air Run Suhu ph 1 45 o C o C o C o C o C 9 c) Hidrolisis enzimatis dengan penambahan pelarut toluena 1) Pengaruh penambahan air (tinggi 7 cm dan diameter 4 cm). Tambahkan akuades sesuai dengan penambahan air yang diujikan. Tambahkan pelarut toluena ke dalam campuran minyak dan larutan enzim tersebut dengan perbandingan 1:3 terhadap larutan enzim kemudian dimasukkan gas nitrogen murni selama 30 detik, tutup wadah dengan sumbat karet, cling film dan wax. Persiapkan lipase dari Aspergillus niger sebanyak 800 Unit (200 U/g substrat) ke dalam larutan buffer fosfat 1 M sebanyak 6 ml dengan ph optimum sesuai hasil yang diperoleh dari hidrolisis tanpa penambahan pelarut. Suntikkan larutan enzim tersebut ke dalam wadah gelas. Kemudian masukkan wadah tersebut ke dalam shaker water bath sesuai dengan temperatur optimum yang telah diperoleh dari hasil hidrolisis tanpa penambahan pelarut dengan kecepatan 200 rpm selama 48 jam. Tabel 9. Rancangan berbagai perlakuan penambahan air pada media yang ditambahkan toluena Run Suhu optimum ph optimum Penambahan air 1 Hasil percobaan 1.a Hasil percobaan 1.b 1% 2 Hasil percobaan 1.a Hasil percobaan 1.b 2% 3 Hasil percobaan 1.a Hasil percobaan 1.b 3% 4 Hasil percobaan 1.a Hasil percobaan 1.b 4% 5 Hasil percobaan 1.a Hasil percobaan 1.b 5% 22

6 2) Pengaruh ph (tinggi 7 cm dan diameter 4 cm). Tambahkan akuades sesuai dengan hasil penelitian dari pengaruh penambahan air. Tambahkan pelarut toluena ke dalam campuran minyak dan larutan enzim tersebut dengan perbandingan 1:3 terhadap larutan enzim kemudian dimasukkan gas nitrogen murni selama 30 detik, tutup wadah dengan sumbat karet, cling film dan wax. Persiapkan lipase dari Aspergillus niger sebanyak 800 Unit (200 U/g substrat) ke dalam larutan buffer fosfat 1 M sebanyak 6 ml sesuai dengan ph yang akan diujikan (5, 6, 7, 8 dan 9). Suntikkan larutan enzim tersebut ke dalam wadah gelas. Kemudian masukkan wadah tersebut ke dalam shaker water bath sesuai temperatur optimum yang telah diperoleh dari hasil hidrolisis tanpa penambahan pelarut dengan kecepatan 200 rpm selama 48 jam. Tabel 10. Rancangan berbagai perlakuan ph pada media yang ditambahkan toluena Run Suhu optimum ph Penambahan Air 1 Hasil percobaan 1.a 5 Hasil percobaan 2.a 2 Hasil percobaan 1.a 6 Hasil percobaan 2.a 3 Hasil percobaan 1.a 7 Hasil percobaan 2.a 4 Hasil percobaan 1.a 8 Hasil percobaan 2.a 5 Hasil percobaan 1.a 9 Hasil percobaan 2.a 3) Pengaruh suhu (tinggi 7 cm dan diameter 4 cm). Tambahkan akuades sesuai dengan hasil penelitian dari pengaruh penambahan air. Tambahkan pelarut toluena ke dalam campuran minyak dan larutan enzim tersebut dengan perbandingan 1:3 terhadap larutan enzim kemudian dimasukkan gas nitrogen murni selama 30 detik, tutup wadah dengan sumbat karet, cling film dan wax. Persiapkan lipase dari Aspergillus niger sebanyak 800 Unit (200 U/g substrat) ke dalam larutan buffer fosfat ph 7, 1 M sebanyak 6 ml. Suntikkan larutan enzim tersebut ke 23

7 dalam wadah gelas. Kemudian masukkan wadah tersebut ke dalam shaker water bath sesuai temperatur yang akan diujikan (25, 35, 45, 55, dan 65 o C) dengan kecepatan 200 rpm selama 48 jam. Tabel 11. Rancangan berbagai perlakuan suhu pada media yang ditambahkan toluena Run Suhu ph optimum Penambahan Air 1 25 o C Hasil percobaan 1.b Hasil percobaan 2.a 2 35 o C Hasil percobaan 1.b Hasil percobaan 2.a 3 45 o C Hasil percobaan 1.b Hasil percobaan 2.a 4 55 o C Hasil percobaan 1.b Hasil percobaan 2.a 5 65 o C Hasil percobaan 1.b Hasil percobaan 2.a 6. Analisa Produk Akhir a) Analisa tingkat hidrolisis Pemisahan acylglycerols dan sisa hasil hidrolisis lainnya setelah hidrolisis selektif menggunakan lipase dari Aspergillus niger dilakukan dengan menambahkan pelarut hidrofobik toluena hingga terbentuk dua lapisan yang jelas berbeda antara lapisan nonpolar dan polar. Diamkan selama beberapa hari di dalam ruang pendingin agar pemisahan lapisan dapat terbentuk sempurna. Acylglycerols dan FFA akan terlarut ke dalam pelarut toluena dan membentuk lapisan teratas dari campuran tadi, sedangkan larutan buffer, enzim dan air akan cenderung turun dan berada di bagian dasar tabung serta memiliki warna yang lebih gelap. Hasil hidrolisis kemudian dimasukkan ke dalam labu pemisah dan ditambahkan 50 ml air distilat. Pemisahan dilakukan berdasarkan sifat kepolarannya. Air yang bersifat polar akan menempati lapisan paling bawah untuk kemudian dipisahkan dan dibuang. Sifat pelarut organik hidrofobik yang cenderung non polar akan memisah dan berada pada lapisan paling atas. Pada lapisan pelarut organik hidrofobik yang mengandung tri-, di-, dan monoacylglycerols dicuci kembali dengan air distilat 50 ml sebanyak dua kali. Pelarut organik hidrofobik yang dikhawatirkan masih tertinggal di dalam sisa larutan asam lemak bebas kemudian dihilangkan dengan cara memanaskan larutan tersebut di dalam labu Erlenmeyer dengan menggunakan water bath. Pelarut yang tersisa akan menguap ketika telah 24

8 mencapai titik didihnya. Kemudian dianalisis bilangan asam sehingga dapat ditentukan derajat hidrolisisnya. Prosedur untuk menentukan persentase derajat hidrolisis dapat dilihat pada Lampiran 1. b) Analisa dengan GC-MS Pengukuran total EPA dan DHA dari fraksi minyak tidak terhidrolisis dilakukan setelah pelarut pelarut organik hidrofobik yang terkandung dihilangkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 110 o C. Prosedur untuk destilasi pelarut organik hidrofobik hasil hidrolisis dapat dilihat pada Lampiran 4. Kadar total asam lemak omega-3 (EPA dan DHA) yang terbentuk diukur dengan alat gas chromatography mass spectrophotometry (GC-MS). 25