PRODUKSI DAN BIOAKTIVITAS PROTEIN REKOMBINAN HORMON PERTUMBUHAN DARI TIGA JENIS IKAN BUDIDAYA INDRA LESMANA

Transkripsi

1 PRODUKSI DAN BIOAKTIVITAS PROTEIN REKOMBINAN HORMON PERTUMBUHAN DARI TIGA JENIS IKAN BUDIDAYA INDRA LESMANA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010

2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul Produksi Dan Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan Dari Tiga Jenis Ikan Budidaya adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Juni 2010 Indra Lesmana NRP.C

3 ABSTRACT INDRA LESMANA. Production and Bioactivity of Recombinant Protein for Growth Hormone of Three Cultured Fish Species. Under direction of AGUS OMAN SUDRAJAT, and ODANG CARMAN This study was aim to produce the growth hormone recombinant protein (rgh) of giant grouper (Epinephelus lanceolatus), giant gouramy (Osphronemus gouramy), and common carp (Cyprinus carpio) and compare their bioactivity by using of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) injecting their product. Fragment DNA encoding mature GH protein of giant grouper (El-mGH), giant gouramy (Og-mGH) and common carp (Cc-mGH) was amplified by PCR method and PCR products were then ligated to pcold 1 to generate pcold/el-mgh, pcold/ogmgh, and pcold/cc-mgh protein expression vector, respectively. Each of those expression vectors was transformed into the Escherichia coli BL21. E. coli BL21 was cultured using LB medium and protein production was induced by cold shock at 15±1 o C for overnight. The inclusion bodies of E. coli transformants containing protein expression vector were isolated by sonication method, and rgh production was analyzed by SDS-PAGE. Juvenile of Nile tilapia in average body weight of 11±1g was intramuscularly injected once a week for 4 weeks with rgh solution containing of 1 μg inclusion body of bacterial per gram fish body weight. The results showed that rgh in molecular weight of about 25 kda was obtained. Fish injected with rgh of El-mGH, Cc-mGH and Og-mGH grew 20.94%, 18.09% and 16.99% faster, respectively, compared with control. This result indicated that all rgh produced in E. coli possessed biological activity when tested in Nile tilapia, and it may be useful to improve growth of other aquaculture fish species. Keywords: Production, Bioactivity, Recombinant Proteins, Growth Hormone, Fish Aquacultures

4 RINGKASAN INDRA LESMANA. Produksi Dan Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan Dari Tiga Jenis Ikan Budidaya. Dibimbing oleh AGUS OMAN SUDRAJAT, dan ODANG CARMAN. Pertumbuhan merupakan salah satu faktor penting dalam keberhasilan usaha budidaya perikanan. Pertumbuhan yang lambat akan menyebabkan lamanya waktu pemeliharaan dan besarnya biaya yang harus dikeluarkan, lamanya waktu pemeliharaan juga akan meningkatkan resiko-resiko dalam pemeliharaan, seperti terserang penyakit, kematian massal, dan sebagainya. Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode pemberian protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) untuk meningkatkan laju pertumbuhan. Pada penelitian ini, protein rgh dari ikan kerapu kertang (Epinephelus lanceolatus), ikan gurame (Osphronemus gouramy) dan ikan mas (Cyprinus carpio) diproduksi dengan teknologi protein rekombinan melalui bakteri E. coli. Bioaktivitas rgh diuji dengan mengamati pertumbuhan ikan nila (Oreochromis niloticus) yang diinjeksi dengan rgh tersebut dibandingkan dengan ikan yang hanya diinjeksi dengan PBS atau protein dari pcold 1 tanpa fragmen DNA GH. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah satu solusi untuk meningkatkan laju pertumbuhan ikan-ikan budidaya. Tahapan dalam memproduksi rgh dari ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas adalah fragmen DNA penyandi protein GH mature (mgh) dari masing-masing ikan diamplifikasi dengan PCR dengan cetakan plasmid pgem-t Easy yang mengandung cdna yang telah diisolasi dari ikan kerapu kertang (Mulyadi et al. 2008), ikan gurame (Nugroho et al. 2007), dan ikan mas berdasarkan database Bank Gen no. akses M Primer yang digunakan untuk amplifikasi mgh ikan kerapu kertang (El-mGH) adalah primer forward El-mGH- F 5 - ctcgag cag cca atc aca gac ggc cag - 3 dan primer reverse El-mGH-R 5 - aagctt cta cag ggt aca gtt ggc ctc agg - 3 yang masing-masing dilengkapi dengan situs restriksi XhoI dan HindIII (digaris bawahi dan dicetak tebal). Primer untuk amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan gurame (Og-mGH) adalah primer forward Og-mGH-F 5 - ggatcc cag cca atc aca gac agc cag - 3 dan reverse OgmGH-R 5 - gaattc cta cag agt gca gtt agc ttc tgg - 3 yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan EcoRI. Selanjutnya primer untuk amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan mas (Cc-mGH) adalah primer forward Cc-mGH-F 5 - ggatcc tca gac aac cag cgg ctc ttc - 3 dan reverse Cc-mGH-R 5 - gtcgac cta cag ggt gca gtt gga atc cag - 3 yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan SalI. Fragmen DNA produk PCR diligasi (disambungkan) ke vektor kloning pgem-t Easy menggunakan T4 DNA ligase, dan plasmid yang dihasilkan disebut sebagai pt-mgh. pt-mgh produk ligasi ditransformasikan ke sel kompeten bakteri E. coli DH5α. Bakteri E. coli DH5α yang mengandung plasmid pt-mgh diseleksi menggunakan metode cracking (Alimuddin et al. 2008), dan selanjutnya bakteri tersebut dikultur pada media padat 2xYT (+Ampisilin). Plasmid pt-mgh diekstraksi dari bakteri E. coli DH5α menggunakan kit GF-1 Plasmid DNA Extraction Kit (Vivantis) dengan prosedur yang sesuai dengan manual kit yang digunakan. pt-mgh dipotong dengan enzim restriksi

5 seperti dijelaskan dalam sekuens primer yang digunakan dalam PCR, untuk isolasi dan purifikasi fragmen DNA mgh. Fragmen DNA mgh tersebut selanjutnya diligasi dengan vektor pcold 1 yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan yang digunakan memotong pt-mgh. Produk ligasi yang disebut dengan pcold-mgh ditransformasi ke dalam bakteri E. coli DH5α untuk diperbanyak secara in vivo. Plasmid pcold-mgh hasil perbanyakan selanjutnya ditransformasi ke bakteri E. coli BL21 untuk memproduksi protein rgh. Bakteri E. coli BL21 yang mengandung plasmid pcold-mgh dikultur pada media 2xYT (+Ampisilin), dan diinduksi dengan IPTG pada suhu inkubasi 15 o C selama 24 jam. Bakteri hasil kultur dipanen dan disentrifugasi untuk mengendapkan sel bakteri. Pelet bakteri yang dihasilkan disonikasi untuk memecah dinding selnya. Protein dari 1 µg pelet bakteri dianalisis menggunakan metode SDS-PAGE dengan konsentrasi gel poliakrilamid 10%, dan protein divisualisasi menggunakan pewarna Coomassie Blue. Ukuran protein rgh diprediksi berdasarkan konsensus bahwa 10 kda protein sama dengan 270 bp DNA. Hasil amplifikasi PCR dengan primer spesifik untuk mgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH) menghasilkan pita DNA dengan panjang fragmen masing-masing sekitar 576 bp, 579 bp, dan 576 bp. Masing-masing fragmen DNA mgh tersebut diligasi ke vektor kloning pgem-t Easy (plasmid yang dihasilkan disebut sebagai pt-mgh), selanjutnya ditransformasi ke bakteri E. coli DH5α, dan hasil cracking menunjukkan bahwa sebagian besar bakteri E. coli tersebut membawa plasmid pt-mgh. Hasil ligasi DNA mgh dengan pcold 1 untuk menghasilkan vektor ekspresi protein rekombinan pcold-mgh ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli DH5α untuk diperbanyak secara in vivo. Ukuran plasmid yang dihasilkan menjadi lebih besar dibandingkan dengan ukuran plasmid pcold 1. Plasmid-plasmid pcold-mgh tersebut selanjutnya disekuensing untuk mengetahui klon bakteri yang membawa mgh dengan sekuens DNA yang menyandikan asam amino lengkap dan sesuai dengan yang dilaporkan peneliti-peneliti sebelumnya. Dari hasil sekuensing, diperoleh 1 klon untuk pcold/og-mgh, 2 klon untuk pcold/elmgh dan 2 klon untuk pcold/cc-mgh. Selanjutnya plasmid-plasmid pcoldmgh dengan sekuens yang benar tersebut diisolasi untuk ditransformasikan ke dalam bakteri ekspresi E. coli BL21, dari hasil cracking didapatkan sebagian besar klon membawa plasmid pcold-mgh. Hasil PCR untuk mengetahui klon bakteri E. coli BL21 yang membawa plasmid pcold-mgh dengan arah ligasi mgh yang benar menunjukkan bahwa pita DNA produk PCR dengan ukuran sekitar 0,65 kb (sekitar 0,6 kb fragmen DNA mgh dan 0,05 kb fragmen DNA pcold 1) yang berarti bahwa klon bakteri tersebut mengandungkan plasmid pcold-mgh dengan orientasi ligasi mgh benar. Dari hasil uji orientasi arah ligasi didapatkan 10 klon untuk pcold/ogmgh, 10 klon untuk pcold/el-mgh dan 6 klon untuk pcold/cc-mgh Protein rgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH) pada bakteri E. coli BL21 menggunakan vektor ekspresi pcold 1 berhasil diproduksi, sebanyak 200 ml media kultur 2xYT cair (+Ampisilin) dapat menghasilkan ±0,93 gram pelet bakteri yang mengandung rgh. Tingkat produksi protein rgh diperkirakan % (diprediksi menggunakan software Totallab TL 120) dari total protein yang dihasilkan sel E. coli BL21.

6 Hasil visualisasi protein rgh menunjukan bahwa tingkat produksi rgh (ukuran sekitar 25 kda) untuk ketiga sumber mgh tersebut relatif sama, meskipun jumlah dan ukuran protein lainnya bervariasi. Sementara itu, protein yang dihasilkan oleh bakteri BL21 yang hanya membawa pcold 1 tanpa fragmen mgh adalah tidak memproduksi protein rgh dan protein yang lainnya seperti halnya pada BL21 yang membawa pcold-mgh. Selanjutnya, ukuran protein rgh adalah 25 kda, yang terdiri dari 22 kda prediksi ukuran rgh berdasarkan panjang fragmen DNA dan sisanya berasal dari vektor pcold 1, yaitu His-tag dan Factor Xa site. Pertambahan bobot ikan nila yang diinjeksi dengan rgh lebih tinggi (P<0.1) dibandingkan dengan kontrol (PBS dan pcold 1). Hal ini menandakan bahwa protein rgh yang dihasilkan tersebut ikut berperan dalam meningkatkan pertumbuhan ikan. Pertambahan bobot ikan nila yang diinjeksi dengan rgh ElmGH (20,94%) terlihat sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan kedua rgh lainnya (18,09% untuk Cc-mGH dan 16,99% untuk Og-mGH). Hal ini diduga karena respons ikan nila dalam menerima rgh dari ikan kerapu kertang lebih baik dari rgh ikan gurame dan ikan mas. Pertambahan bobot ikan nila yang diberi perlakuan injeksi rgh terlihat cukup tinggi setelah penyuntikan keempat. Respons yang lambat tersebut diduga terjadi karena reseptor memerlukan faktor intermediet atau waktu untuk mengenali rgh yang diinjeksikan. Selanjutnya, secara umum ikan yang diberi perlakuan rgh menunjukkan peningkatan nafsu makan yang ditunjukkan dengan tingkah laku yang agresif pada saat pemberian pakan. Hal yang sama juga dilaporkan pada ikan mas yang diinjeksikan rgh ikan giant catfish (Promdonkoy et al. 2004). Banyak penelitian tentang pemanfaatan rgh ikan untuk memacu laju pertumbuhan ikan budidaya seperti rgh ikan giant catfish oleh Promdonkoy et al. (2004), rgh ikan yellowfin porgy oleh Tsai et al. (1997) dan yang lainnya menyatakan bahwa sintesis protein rgh di dalam bakteri E. coli yang diuji aktivitas biologinya mempunyai potensi yang sama dengan GH alami yang dimiliki oleh spesies tersebut, walaupun kita belum mampu membandingkan aktivitas rgh yang kita cobakan dengan hormon alaminya. Namun dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa rgh yang diproduksi di dalam bakteri E. coli mempunyai aktivitas biologi, sehingga dapat diaplikasikan dalam kegiatan budidaya perikanan secara luas. Pada penelitian ini, deliveri rgh dilakukan menggunakan metode injeksi. Dengan pertimbangan teknis dan efisiensi aplikasi rgh dalam budidaya ikan, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui metode pemberian rgh yang cocok serta apakah bioktivitas rgh yang diberikan mulai pada fase larva. Hasil penelitian Tsai et al. (1997) menunjukkan peningkatan laju pertumbuhan hingga 60% pada juvenil ikan kakap hitam yang diberikan rgh melalui pakan. Selain itu hasil penelitian Acosta et al. (2007) pada ikan nila merah menunjukkan respons yang sangat signifikan (lebih dari 100% dibandingkan kontrol) dengan memberikan rgh dari ikan nila melalui perendaman pada larva. Pemberian rgh melalui pakan yang dicampur rgh serta melalui perendaman larva dalam media mengandung rgh secara teknis lebih praktis untuk diaplikasikan dibandingkan dengan metode injeksi. Kata kunci: Produksi, Bioaktivitas, Protein Rekombinan, Hormon Pertumbuhan, Ikan Budidaya

7 Hak Cipta milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

8 PRODUKSI DAN BIOAKTIVITAS PROTEIN REKOMBINAN HORMON PERTUMBUHAN DARI TIGA JENIS IKAN BUDIDAYA INDRA LESMANA Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Akuakultur SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010

9 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc.

10 Judul Tesis Nama NRP : Produksi dan Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan dari Tiga Jenis Ikan Budidaya : Indra Lesmana : C Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Agus Oman Sudrajat, M.Sc. Ketua Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc. Anggota Diketahui Ketua Program Studi Ilmu Akuakultur Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. Ir. Enang Harris, M.S. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S. Tanggal Ujian: 24 Juni 2010 Tanggal Lulus:

11 PRAKATA Puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT yang maha luas ilmu dan pengetahuannya, sehingga dengan rahmat dan karunianya penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2009 ini ialah Peningkatan laju pertumbuhan ikan budidaya dengan memanfaatkan teknologi protein rekombinan, sehingga diharapkan dapat memberikan solusi dalam peningkatan produksi perikanan Indonesia. Penelitian ini berjudul Produksi dan Bioaktivitas Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan dari Tiga Jenis Ikan Budidaya. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Agus Oman Sudrajat, M.Sc dan Bapak Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc selaku pembimbing, serta Bapak Dr Alimuddin, S.Pi, M.Sc yang telah banyak memberikan saran, masukan dan dana dalam penelitian dan penulisan tesis ini. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada staf dan teman-teman mahasiswa S1, S2, dan S3 yang juga sedang melakukan penelitian di Laboratorium Reproduksi dan Genetik Organisme Akuatik Departemen BDP FPIK-IPB, yang telah banyak membantu selama penelitian. Selain itu, ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Ika Malikha, STP staf Laboratorium Molekuler dan Biokimia PAU IPB atas bantuan dan pelajarannya dalam analisis protein rgh. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dekan Sekolah Pascasarjana IPB beserta staf, Ketua Mayor beserta staf dan Bapak/Ibu Dosen di Ilmu Akuakultur, atas segala ilmu dan layanan yang diberikan kepada penulis selama studi. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Pemerintah Provinsi Riau dan Pemerintah Kabupaten Kampar-Riau atas beasiswa yang diberikan, serta Yayasan R.v.G. Van Deventer Maas atas bantuan studi selama 12 bulan. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Ibunda Hj Murniati dan Ayahanda H. Chaidir atas dukungan moril maupun materil serta do a yang diberikan selama ini. Juga kepada saudara-saudaraku; kakanda Herlina Susanti, STP dan keluarga, Nita Andriani, S.Pd dan keluarga, adinda Deni Fitrah, S.Pt, Al Hidayati, AMd.Keb, dan Mar atus Soleha atas do a dan kasih sayangnya selama ini. Serta seluruh keluarga besarku di Salo-Riau. Penghargaan penulis sampaikan kepada teman-teman S2 AKU 07 atas kebersamaan, kekompakan, dan kerjasama yang baik serta bantuannya selama perkuliahan sampai penyusunan dan penyelesaian tugas akhir ini, serta teman-teman HIMMPAS (Himpunan Mahasiswa Muslim Pascasarjana) IPB atas kebersamaannya selama ini. dan ungkapan terima kasih kepada semua pihak yang tidak sempat disebutkan satu persatu. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Juni 2010 Indra Lesmana

12 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Riau pada tanggal 26 Maret 1984 dari ayah H Chaidir dan ibu Hj Murniati. Penulis merupakan anak ketiga dari enam bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SMA Muhammadiyah Bangkinang dan pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa di Universitas Riau pada Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan melalui jalur UMPTN (Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri) dan menamatkannya pada tahun Pada tahun 2007 penulis melanjutkan pendidikan program Magister sains di Institut Pertanian Bogor pada program studi Ilmu Akuakultur, dengan mendapatkan beasiswa dari Pemerintah Provinsi Riau dan Pemerintah Kabupaten Kampar serta penulis juga mendapatkan bantuan studi selama 12 bulan dari Yayasan R.v.G. Van Deventer Maas. Selama menempuh pendidikan S2 penulis aktif pada organisasi Himpunan Mahasiswa Muslim Pascasarjana (HIMMPAS IPB) dan pernah menjadi Ketua Umum pada periode 2008/2009.

13 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR LAMPIRAN... vii PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 3 TINJAUAN PUSTAKA... 4 Hormon Pertumbuhan (Growth Hormone)... 4 Teknologi DNA Rekombinan... 4 Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rgh)... 7 BAHAN DAN METODE Produksi Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rgh) Kloning Fragmen DNA Penyandi Protein GH Mature (mgh) Pembuatan Vektor Ekspresi Protein rgh Produksi Protein rgh Uji Bioaktivitas Protein rgh Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Vektor Kloning Protein rgh Vektor Ekspresi Protein rgh Produksi Protein rgh Uji Bioaktivitas Protein rgh pada Ikan Nila dengan Cara Injeksi KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 37

14 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Peta vektor kloning pgem -T Easy Peta vektor ekspresi pcold 1 DNA Hasil isolasi plasmid pgem-t Easy yang mengandung Cc-cDNA GH, Og-cDNA GH, dan El-cDNA GH. M: marka panjang fragmen DNA (2- lod ladder, BioLabs Inc., New England); angka di sebelah kiri: ukuran fragmen DNA marka; angka 1-2 adalah nomor klon bakteri hasil isolasi plasmid cdna GH Produk PCR fragmen GH mature; Og-mGH, Cc-mGH, dan El-mGH Hasil cracking pgem-t Easy/El-mGH, pgem-t Easy/Og-mGH, dan pgem-t Easy/Cc-mGH dari bakteri konstruksi E. coli DH5α. T pada Gambar: marka ukuran plasmid pgem-t Easy (3 kb) dan nomor 1-5 adalah nomor sampel klon bakteri bakteri konstruksi E. coli DH5α yang mengandung pt-mgh Isolasi plasmid pt-mgh dari bakteri konstruksi E. coli DH5α Pemotongan pt-mgh dengan enzim restriksi untuk mengeluarkan mgh Pemotongan vektor ekspresi pcold1 DNA dengan enzim restriksi. M: marka panjang fragmen DNA; angka 1: pcold 1 yang belum didigesti, angka 2: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi BamHI dan SalI, angka 3: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi XhoI dan HindIII, dan angka 4: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi BamHI dan EcoRI Klon bakteri E. coli DH5α yang mengandung pcold-mgh Elektroforesis hasil cracking pcold-mgh dari bakteri E. coli BL21. M: marka panjang fragmen DNA; angka di sebelah kiri dan kanan: ukuran fragmen DNA marka; angka 1-16 adalah nomor klon bakteri hasil transformasi pcold-mgh; Gambar (a) hasil transformasi pcold/elmgh; Gambar (b) hasil transformasi pcold/og-mgh; dan Gambar.(c) hasil transformasi pcold/cc-mgh... 25

15 12. Produk PCR dalam uji orientasi ligasi fragmen DNA mgh pada pcold 1 M: marka panjang fragmen DNA; angka di sebelah kanan: ukuran fragmen DNA marka Hasil kultur klon bakteri E. coli BL21 yang telah diseleksi positif mengandung pcold-mgh dengan arah orientasi ligasi mgh yang benar SDS-PAGE protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (ElmGH). M: marka ukuran protein (Prestained protein marker, Broad range 7-175; Biolabs-P7708S); angka di sebelah kiri gambar merupakan ukuran marka protein; dan N: protein dari bakteri BL21 yang membawa pcold 1 tanpa fragmen DNA mgh Laju pertumbuhan bobot ikan nila per minggu yang disuntik dengan PBS dan pcold 1 (sebagai kontrol) dan protein rgh ikan kerapu kertang (El-mGH), ikan gurame (Og-mGH) dan ikan mas (Cc-mGH) Pertambahan bobot (g) ikan nila yang disuntik protein rgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH). Protein total dari 1 µg bakteri per gram ikan nila disuntikkan sekali seminggu selama 4 minggu, dan pertumbuhan ikan diukur setiap minggu selama 2 bulan. PBS kontrol: ikan nila disuntik dengan PBS; dan pcold 1: ikan nila disuntik dengan protein dari bakteri BL21 yang mengandung plasmid pcold 1 tanpa fragmen DNA mgh... 29

16 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Sekuens cdna yang mengkodekan hormon pertumbuhan (GH) ikan kerapu kertang berdasarkan data Genbank EU Sekuens cdna yang mengkodekan hormon pertumbuhan (GH) ikan mas berdasarkan data Genbank M Sekuens nukleotida dan hasil prediksi asam amino GH ikan kerapu kertang menggunakan program GENETYX versi Sekuens nukleotida dan hasil prediksi asam amino GH ikan mas menggunakan program GENETYX versi Sekuens nukleotida dan hasil prediksi asam amino GH ikan gurame menggunakan program GENETYX versi Prediksi daerah signal peptida pada CDS GH ikan kerapu kertang Prediksi daerah signal peptida pada CDS GH ikan mas Prediksi daerah signal peptida pada CDS GH ikan gurame Hasil sekuensing plasmid pcold/el-mgh Hasil sekuensing plasmid pcold/cc-mgh Alignment urutan nukleotida plasmid pcold/el-mgh hasil sekuensing dengan sekuens mgh dari data Genbank EU Alignment urutan nukleotida plasmid pcoldccgh hasil sekuensing dengan sekuens mgh dari data Genbank M Data uji bioaktivitas protein rgh dengan penyuntikan Hasil analisis sidik ragam pertumbuhan ikan nila dengan lama pemeliharaan selama 2 bulan Hasil analisis sidik ragam tingkat kelulus hidupan (SR) ikan nila diakhir pemeliharaan Dokumentasi penelitian... 61

17 PENDAHULUAN Latar Belakang Pertumbuhan merupakan salah satu faktor penting dalam keberhasilan usaha budidaya perikanan. Pertumbuhan yang lambat akan menyebabkan lamanya waktu pemeliharaan dan besarnya biaya yang harus dikeluarkan, lamanya waktu pemeliharaan juga akan meningkatkan resiko-resiko dalam pemeliharaan, seperti terserang penyakit, kematian massal, dan sebagainya. Berbagai upaya penelitian telah dilakukan untuk meningkatan laju pertumbuhan ikan budidaya, khususnya ikan-ikan yang pertumbuhannya lambat, seperti rekayasa lingkungan budidaya dan rekayasa pemberian pakan (Johnston et al. 2008) atau dengan meningkatkan kandungan protein pakan hingga 58% seperti yang dilakukan oleh Gauquelin et al. (2007) pada pakan udang. Namun kandungan protein pakan yang tinggi dapat meningkatkan kadar amoniak dalam perairan, sehingga dapat mempengaruhi pertumbuhan ikan budidaya. Selain dengan rekayasa lingkungan dan pemberian pakan, penelitian rekayasa genetika juga telah dilakukan untuk meningkatkan pertumbuhan ikan budidaya; seperti seleksi, hibridisasi, triploidisasi dan transgenesis. Aplikasi metode seleksi membutuhkan waktu yang relatif lama untuk mencapai hasil yang signifikan karena peningkatan kecepatan tumbuh yang dihasilkan per generasi relatif rendah, seperti yang dilaporkan oleh Bolivar et al. (2002) pada ikan nila yang dilakukannya selama 10 tahun untuk menghasilkan 12 generasi dengan kecepatan tumbuh 12,4% per generasi. Penerapan teknologi hibridisasi dan triploidisasi terbatas pada ikan-ikan budidaya yang sudah diketahui teknik pemijahan buatannya secara baik. Metode transgenesis juga sudah banyak dikembangkan seiring dengan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang molekuler. Kajian-kajian rekayasa genetika dalam bidang akuakultur sudah banyak diaplikasikan sejak tahun 1980-an dengan produk ikan transgenik yang pertama kali dilaporkan di Cina pada tahun 1985 (Dunham 2004). Kemudian hingga saat ini teknologi transgenesis terus berkembang dengan memberikan banyak keuntungan dan kelebihan, di antaranya adalah gen yang diintroduksi dapat terintegrasi dengan genom resipien dan selanjutnya dapat ditransmisikan ke keturunannya (Khoo 2000).

18 2 Selain memberikan banyak keuntungan dan kelebihan yaitu salah satunya dapat meningkatkan laju pertumbuhan ikan 30 kali lebih cepat dari ikan normal, seperti yang dilakukan oleh Nam et al. (2001) dengan mengintroduksi gen penyandi hormon pertumbuhan (GH) ke ikan mud loach (Misgurnus mizolepis). Namun demikian, saat ini teknologi transgenesis masih menimbulkan kontroversi dan kekhawatiran akan keamanan dalam mengkonsumsi organisme transgenik tersebut (foodsafety) atau disebut juga dengan GMO (Genetically Modified Organism), sehingga perlu ada cara lain untuk mengatasi masalah tersebut. Penggunaan protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan diduga sebagai salah satu metode alternatif untuk meningkatkan pertumbuhan ikan budidaya, penggunaan protein rgh ikan dalam meningkatkan produktivitas atau pertumbuhan ikan budidaya dilakukan dengan prosedur yang aman (Willard 2006 dalam Acosta et al. 2007), sehingga ikan yang diberikan rgh bukan merupakan organisme GMO (Acosta et al. 2007) dan rgh tersebut tidak ditransmisikan ke keturunannya. Pada ikan, seperti juga pada hewan-hewan vertebrata lainnya, pertumbuhan sel somatik diatur oleh adanya poros pertumbuhan, pituitari sebagai tempat penghasil hormon pertumbuhan (GH) merupakan suatu komponen pengatur yang penting dalam poros ini (Reinecke et al. 2005). GH memainkan peranan yang penting dalam mengatur banyak aspek fisiologi, termasuk pertumbuhan (Cavri et al. 1993), metabolisme (Rousseau and Dufour. 2007), osmoregulasi (Sakamoto et al. 1997), fungsi kekebalan tubuh (Yada et al. 1999) dan reproduksi (McLean et al. 1993). Penggunaan hormon pertumbuhan dalam berbagai aplikasi sudah banyak dilakukan, namun prosedur yang ada untuk mendapatkan hormon tersebut sangatlah rumit, selain itu hanya diperoleh dalam jumlah yang sedikit (Kawauchi et al. 1986; Yasuda et al. 1992). Hal ini disebabkan karena konsentrasi hormon pertumbuhan yang dihasilkan secara biologi oleh sel khusus pada kelenjer pituitari sangat kecil. Oleh sebab itu perlu dikembangkan metode yang efisien untuk menghasilkan hormon ini dalam jumlah besar melalui teknologi protein rekombinan. Hormon pertumbuhan (GH) merupakan hormon pituitari di bawah pengaturan hipotalamus (Bjo rnsson et al. 2004), GH diproduksi dalam jumlah

19 3 sedikit kemudian dengan mekanisme autocrine dan paracrine (Vong et al dalam Dong et al. 2008) dihantarkan ke organ target melalui peredaran darah untuk merangsang banyak aspek fisiologi tubuh. Selain itu juga GH dapat merangsang hati untuk menghasilkan insulin-like growth factors I (IGF-I) yang dapat merangsang metabolisme asam amino dan lipid di dalam tubuh (Cao et al. 1989; Kelley et al dalam Roberts et al. 2004). Bioaktivitas protein rgh dalam meningkatkan pertumbuhan telah dilaporkan pada beberapa jenis ikan seperti ikan rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) dengan menggunakan rgh ikan salmon (Moriyama et al. 1993), ikan flounder (Paralichtys olivaceus) dengan menggunakan rgh juga dari ikan flounder (Jeh et al. 1998), dan ikan mas dengan menggunakan rgh ikan giant catfish (Pangasianodon gigas) (Promdonkoy et al. 2004). Pada penelitian ini, protein rgh dari ikan kerapu kertang (Epinephelus lanceolatus), ikan gurame (Osphronemus gouramy) dan ikan mas (Cyprinus carpio) diproduksi dengan teknologi protein rekombinan melalui bakteri E. coli. Bioaktivitas rgh diuji dengan mengamati pertumbuhan ikan nila (Oreochromis niloticus) yang diinjeksi dengan rgh tersebut dibandingkan dengan ikan yang hanya diinjeksi dengan PBS atau protein dari pcold 1 tanpa fragmen DNA GH. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menghasilkan protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas dan membandingkan bioaktivitasnya dalam meningkatkan laju pertumbuhan ikan nila (Oreochromis niloticus). Selanjutnya penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah satu solusi untuk meningkatkan laju pertumbuhan ikan-ikan budidaya dalam upaya peningkatan produksi perikanan Indonesia.

20 4 TINJAUAN PUSTAKA Hormon Pertumbuhan (Growth Hormone) Hormon pertumbuhan (GH) merupakan hormon polipeptida penting dengan ukuran sekitar 22 kda yang diproduksi dari somatotropin di dalam kelenjar anterior pituitari yang berperan dalam mengontrol pertumbuhan somatik setelah kelahiran, perkembangan (Nicoll et al. 1999), metabolisme (Kaplan et al. 1999), reproduksi (Van der Kraak et al. 1990; Le Gac et al dalam Li et al. 2005) dan osmoregulasi (Sakamoto et el. 1993; Tatsuya dan Hirano. (1993) dalam Li et al. 2005). Fungsi kelenjar pituitari sebagai pengontrol pertumbuhan sudah dijelaskan pertama kali pada tahun 1921 (Evans dan Long 1921 dalam Venugopal et al. 2002) dan yang pertama kali diisolasi dan dikarakterisasi adalah cdna yang mengkode hormon pertumbuhan pada manusia. Hormon pertumbuhan mempunyai peranan yang penting pada proses transfer asam amino ekstraselluler melewati membran sel, khususnya ke dalam sel-sel otot dan menahan asam amino tersebut agar tetap berada di dalam sel. Selain itu hormon ini dapat memacu retensi tubuh terhadap berbagai mineral dan elemen esensial untuk pertumbuhan normal (Walsh 2002). Hormon pertumbuhan dapat menunda katabolisme asam-asam amino dan memacu inkoporasinya ke dalam protein-protein tubuh. Kerja hormon ini dipermudah oleh pankreas, korteks adrenal dan tiroid yang bekerja bersama-sama dalam memacu metabolisme lemak dan karbohidrat (Calduch-Giner et al. 2000; Walsh 2002). Kemudian Matty (1985) mengatakan bahwa GH dapat meningkatkan nafsu makan, konversi pakan, sintesis protein, menurunkan ekskresi (loading) nitrogen, merangsang metabolisme dan oksidasi lemak, serta memacu sintesis dan pelepasan insulin. Teknologi DNA Rekombinan Teknologi DNA rekombinan, disebut juga dengan kloning gen atau molekuler kloning adalah penyisipan DNA atau gen tertentu ke vektor, untuk membentuk molekul DNA baru yang dapat diperbanyak pada sel inang (Glick dan Pasternak 2003). Kloning gen dapat dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: isolasi gen, penyisipan gen ke dalam sistem vektor untuk membentuk vektor

21 5 rekombinan, dan introduksi atau memasukkan vektor rekombinan yang membawa sisipan gen kedalam sel inang (Suharsono 2000) Isolasi gen. Gen dapat diisolasi dengan berbagai cara yaitu: Pemotongan dengan enzim restriksi Gen yang sudah diketahui ukuran dan situs restriksinya dapat diisolasi secara langsung dari gel setelah dilakukan pemotongan DNA dan migrasi di dalam gel. Untuk gen yang berada pada organisme dengan genom besar dapat dilakukan dengan pembuatan pustaka genom. Genom suatu individu dipotong dengan enzim restriksi, disisipkan ke vektor rekombinan kemudian diintroduksikan ke sel inang. Pembuatan cdna DNA komplementer (cdna) adalah DNA yang dibuat berdasarkan mrna (messenger RNA). mrna spesifik digunakan sebagai cetakan bagi sintesis enzimatik DNA komplementer dengan menggunakan enzim reverse transcriptase sebagai katalisator. Pada metoda ini memerlukan primer DNA (Brown 1991). Pada mrna ini ditambahkan politimin yang bersifat komplementer dengan terminal 3 poliadenilasi. Politimin ini berperan sebagai inisiasi bagi reverse transcriptase yang melakukan transkriptasi mrna untuk membuat untai komplementer cdna dari campuran dntp sehingga menghasilkan untai tunggal cdna yang direplikasi oleh DNA polimerase I sehingga menghasilkan cdna untai ganda. cdna tersebut bersifat spesifik bagi protein yang gennya sedang diteliti. Pembentukan vektor rekombinan. Pembentukan vektor rekombinan adalah penyisipan gen atau DNA yang telah diisolasi ke dalam vektor, atau disebut juga dengan DNA rekombinan yang dapat bereplikasi dalam sel inang (bakteri). Beberapa jenis vektor yang dapat digunakan dalam kloning gen yaitu plasmid, fage, kromosom buatan dari khamir (YAC: yeast artificial chromosome) dan kosmid (cosmid). Penggunaan vektor sangat tergantung dari tujuan pengklonan, pembuatan pustaka cdna dapat menggunakan plasmid sebagai vektornya, sedangkan pustaka genom yang mengandung fragmen besar biasanya menggunakan fage, cosmid atau YAC (Suharsono 2000).

22 6 Menurut Voet dan Voet (1994) mengatakan bahwa pembentukan DNA rekombinan disebut juga dengan proses ligasi yaitu memasukkan sekuens DNA yang diinginkan ke dalam elemen genetik yang dapat bereplikasi sendiri yaitu plasmid, bakteriofage, atau yeast artificial chromosome. Enzim yang digunakan dalam mengkatalisasi reaksi ligasi disebut dengan DNA ligase. Introduksi vektor rekombinan ke dalam sel inang. Vektor rekombinan yang membawa sekuens DNA diintroduksikan ke dalam sel bakteri agar dapat mengalami replikasi (penggandaan). Proses introduksi vektor rekombinan dapat dibedakan menjadi dua macam yaitu transformasi dan transfeksi. Istilah transformasi dipakai apabila vektor yang digunakan adalah plasmid, sedangkan transfeksi menggunkan vektor virus dan turunannya. Sel yang digunakan dalam proses transformasi disebut dengan sel kompeten (Darmawan 2004). Keberhasilan proses transformasi dipengaruhi oleh sifat kompeten bakteri dalam pengambilan molekul DNA asing (Glick dan Pasternak 2003). Sifat kompeten dapat terjadi secara alami pada beberapa bakteri, seperti pada genus Bacillus atau Streptococcus yang mempunyai mekanisme pengikatan dan pengambilan molekul DNA secara efisien (Suharsono 2000). Sifat kompeten tidak dimiliki oleh E. coli, sehingga perlu dilakukan induksi dengan beberapa bahan kimia dan kejutan suhu. Sel pada fase mid-log disuspensikan pada kalsium klorida (CaCl 2 ), kemudian dipertahankan pada suhu -70 o C hingga akan digunakan. Pada saat dilakukan transformasi, sel yang membeku dicairkan (thawing) di atas es dan dilakukan kejutan suhu 42 o C selama 1-2 menit. DNA dapat masuk ke dalam bakteri melalui pori-pori dinding dan membran yang terbuka. Bahan kimia lain yang digunakan adalah Mg atau detergen (triton-x) (Suharsono 2000). Metode lain dalam transformasi adalah menggunakan kejutan listrik yang dikenal dengan elektroporasi (Sambrook et al. 1989). Kejutan suhu pada tegangan tertentu dalam waktu singkat dapat membuka pori-pori sel inang. Seleksi transforman. Sel inang (bakteri) yang membawa DNA sisipan dapat diketahui dengan penanda seleksi, yaitu berupa sifat ketahanan terhadap antibiotika. Bakteri yang membawa vektor rekombinan (mengandung DNA sisipan) akan resisten terhadap antibiotik tertentu dan yang bukan vektor rekombinan akan mati. Sedangkan untuk mengetahui sel inang yang membawa vektor rekombinan atau membawa DNA sisipan atau tidak, dapat diketahui

23 7 dengan mengamati ekspresi gen penanda yang dibawa oleh vektor tersebut. Kobolak & Muller (2003) mengatakan bahwa penggunaan vektor pgem-t Easy pada bakteri E. coli yang memiliki marker gen lacz dan marker gen resisten ampisilin, diamana lacz sebagai gen pelapor (reporter gene). Dengan penambahan IPTG (Isopropil thiogalaktosida) dan X-gal (5-bromo-4-cloro-3- indolylbeta-d-galactopyranocide) pada media tumbuh, gen lacz pada vektor kloning yang menyandikan β-galactosidase akan mengubah molekul X-gal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-kloronigo, sehingga menghasilkan koloni bakteri berwarna biru.. Apabila terjadi insersi gen atau fragmen DNA pada MCS, maka gen lacz tidak dapat berfungsi sebagai mana mestinya sehingga tidak terjadi penguraian X-gal menjadi galaktosa yang menyebabkan koloni bakteri tetap berwarna putih. Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rgh) Protein merupakan komponen penyusun kehidupan yang disintesis melalui metabolisme alami di dalam tubuh selama hidup. Beberapa protein, seperti enzim berperan sebagai biokatalisator untuk meningkatkan reaksi metabolisme di dalam tubuh, sedangkan yang lain berbentuk cytoskeleton. Protein memainkan peranan penting dalam memberikan isyarat sel, respons kekebalan, siklus dan adhesi sel. Demain dan Vaishnav 2009 mengatakan bahwa salah satu protein yang berperan dalam tubuh adalah protein hormon pertumbuhan (GH). Sejak diketahuinya fungsi kelenjar pituitari yang memproduksi GH sebagai pengontrol pertumbuhan tahun 1921 oleh Evans dan Long dalam Venugopal et al. (2002) dan kemudian diketahui bahwa GH hewan mamalia mampu meningkatkan laju pertumbuhan ikan maka penelitian tentang penggunaan GH ikan mulai banyak dikembangkan dalam perikanan budidaya. Dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan, protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan diproduksi dan diaplikasikan untuk meningkatkan laju pertumbuhan ikan budidaya seperti yang dilakukan oleh Jeh et al. (1998) dengan menggunakan rgh dapat meningkatkan laju pertumbuhan 24% lebih cepat dibanding kontrol pada benih ikan flounder setelah pemeliharaan 7 minggu. Pada ikan gilthead seabream pemberian rgh dapat meningkatkan laju pertumbuhan 55-65% setelah pemeliharaan 38 hari yang diberikan pada ukuran larva (Ben-Atia et al. 1999),

24 8 60% pada ikan kakap hitam setelah pemeliharan 12 minggu (Tsai et al. 1997), dan 171% pada ikan nila (Acosta et al. 2007) yang diberikan pada ukuran larva setelah pemeliharaan 6 minggu. Metode Pembuatan Protein rgh. Metode pembuatan protein rgh mengacu kepada metode teknologi DNA rekombinan atau kloning gen. Tahapan kloning gen berdasarkan Glick dan Pasternak. (2003) yaitu: isolasi gen, dalam hal ini DNA yang mengkode hormon pertumbuhan (GH), penyisipan gen ke dalam sistem vektor untuk membentuk vektor rekombinan, dan selanjutnya vektor rekombinan yang membawa sisipan gen GH tersebut diintroduksikan ke dalam sel inang (bakteri atau ragi). Dan kemudian di dalam sel inang GH rekombinan tersebut akan diekspresikan dan diperbanyak dengan cepat sesuai dengan kecepatan sel inang membelah diri. Beberapa peneliti telah berhasil mengisolasi dan memproduksi rgh dari beberapa jenis ikan diantaranya adalah Fine et al. (1993); Anathy et al. (2001); Cheng et al. (1995). Beberapa gen GH ikan-ikan budidaya lainnya juga telah diisolasi namun belum diproduksi rekombinan GHnya, seperti ikan nila Oreochoromis niloticus (Kobayashi et al. 2007), ikan kerapu tikus Cromileptes altivelis (Syaifudin et al. 2007), ikan gurame Osphoronemus gouramy (Nugroho et al. 2008), dan ikan kerapu kertang Epinephelus lanceolatus (Mulyadi et al. 2008) Plasmid sebagai vektor kloning dan vektor ekspresi. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular yang terdapat bebas dalam sel bakteri (Brown 1991). Dewasa ini dari hasil-hasil penelitian diketahui bahwa plasmid dihasilkan oleh banyak spesies Eubacteria, tetapi ada juga yang dari Archaea dan sebagian kecil dari Eukarya. Pada penelitian ini vektor kloning yang digunakan adalah pgem-t Easy yang berukuran 3015 bp (Gambar 1). Plasmid pgem-t Easy merupakan plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah ori dan gen ketahanan terhadap ampisilin (Amp R ) serta mengandung multi cloning site. Karena memiliki kelebihan Timin yang menggantung di ujung terbuka, plasmid ini sering dipakai sebagai vektor dari produk PCR yang selalu terdapat kelebihan Adenin (A) pada ujungnya, sehingga penempelan gen insert tidak perlu menggunakan enzim restriksi (Old & Primrose 1994). Selain itu, plasmid pgem-t Easy termasuk plasmid high copy

25 9 number yang cocok untuk menyimpan gen insert dalam bakteri sebagai suatu inang. Gambar 1. Peta vektor kloning pgem -T Easy Vektor ekspresi yang digunakan adalah pcold 1 DNA yang merupakan sistem vektor ekspresi dengan kejutan dingin yang berukuran 4407 bp (Gambar 2). pcold 1 DNA dirancang untuk menghasilkan ekspresi protein secara efisien dengan menggunakan promoter yang berasal dari gen cspa. Promoter ini berasal dari E. coli, sebagian besar jenis E. coli dapat digunakan sebagai inang ekspresi ( Gambar 2. Peta vektor ekspresi pcold 1 DNA

26 10 Teknik Pengujian Aktivitas Protein rgh. Teknik pengujian aktivitas protein rgh dapat dilakukan dengan memberikan protein rgh yang telah diproduksi kepada ikan budidaya. Metode yang digunakan untuk memberikan protein rgh untuk memacu pertumbuhan atau meningkatkan kinerja banyak aspek fisiologi tubuh dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu; injeksi (penyuntikan), immersi (perendaman) dan pakan. Metode pemberian protein rgh melalui pakan, baik melalui pakan alami maupun pakan buatan telah banyak dilakukan diantaranya; Moriyama et al. (1993), Ben-Atia et al. (1999) dengan memberikan rgh ikan gilthead seabream pada larva, Tsai et al. (1997) pada juvenil ikan kakap hitam yang diberikan 2 kali sehari selama 12 minggu, Jeh et al. (1998) pada ikan flounder dengan frekuensi 1 kali seminggu selama 4 minggu, dan Promdonkoy et al. (2004) dengan memberikan protein rgh ikan giant catfish pada benih ikan mas umur 2 bulan. Pemberian rgh melalui pakan buatan merupakan metode yang cukup praktis, karena tidak perlu menangani ikan satu per satu (Jeh et al. 1998). Namun penggunaan pakan buatan terbatas pada benih ikan yang sudah memiliki sistem dan enzim pencernaan yang lengkap. Metode pemberian protein rgh dengan perendaman atau immersi juga bisa dilakukan yaitu dengan merendam ikan pada larutan rgh dengan dosis 30 mg/l selama 60 menit dengan interval 7 hari sekali kemudian di ukur pertumbuhannya, seperti yang dilakukan oleh Moriyama dan Kawauchi (2004), serta oleh Acosta et al. (2007). Metode lain yang juga bisa dilakukan adalah dengan injeksi atau menyuntikkan protein rgh ke dalam tubuh ikan. Metode injeksi seperti yang dilakukan oleh Promdonkoy et al.(2004) dengan menyuntikkan protein rgh ikan giant catfish ke benih ikan mas dengan dosis 0,1 dan 1 µg per 10 µl PBS per g bobot tubuh. Dengan metode injeksi dapat dipastikan bahwa protein rgh masuk ke tubuh melalui peredaran darah.

27 11 BAHAN DAN METODE Penelitian ini terdiri atas 2 tahapan utama, yaitu produksi protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) dari ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas, dan uji bioaktivitas protein rgh pada ikan nila. Produksi Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rgh) Kloning Fragmen DNA Penyandi Protein GH Mature (mgh) Isolasi Plasmid cdna GH. Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit FlexiPrep dari Amersham Pharmacia Biotech dengan prosedur sesuai dengan manual. cdna GH masing-masing ikan; kerapu kertang (Mulyadi et al. 2008), gurame (Nugroho et al. 2007) dan mas (berdasarkan database Bank Gen no. akses M27000) dalam bentuk plasmid pada vektor kloning pgem-t Easy telah tertransformasi dalam bakteri konstruksi E.coli DH5α. Bakteri konstruksi diinkubasi pada suhu 37 C dalam media 2xYT (+Ampisilin) cair 8 ml di tabung L sampai warnanya pekat (± 20 jam). Bakteri dari setiap tabung kultur dituang ke dalam tabung mikro 1,5 ml, selanjutnya bakteri diendapkan dengan cara spin down 30 detik rpm pada suhu 4 C kemudian supernatannya dibuang. Selanjutnya ke dalam tabung mikro berisi pelet bakteri ditambahkan larutan 1 sebanyak 200 µl, divortex hingga pelet bakteri lepas dari dasar tabung. Kemudian ditambahkan larutan 2 sebanyak 200 µl, tabung mikro dibolak-balik sekitar 10 kali sebelum ditambahkan dengan larutan 3 sebanyak 200 µl. Tabung dibolak-balik hingga terbentuk gumpalan-gumpalan putih, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan rpm pada suhu ruang selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru, disentrifugasi sekali lagi dengan kecepatan dan lama waktu yang sama dengan sebelumnya. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro berisi isopropanol 420 µl. Dihomogenasi dengan vortex selama sekitar 1 menit dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit selanjutnya dilakukan sentrifugasi rpm selama 15 menit. Setelah isopropanol (supernatannya) dibuang dengan bantuan aspirator, ke dalam tabung mikro berisi pelet DNA ditambahkan sephaglass 150 µl, dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit selanjutnya sentrifugasi rpm selama 30

28 12 detik. Supernatan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 200 µl larutan Wash Buffer dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang, dan diganti dengan etanol 70% dingin sebanyak 300 µl kemudian dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi rpm selama 30 detik. Setelah semua etanol dibuang, tabung mikro dibiarkan kering udara selama sekitar 10 menit, selanjutnya plasmid DNA dilarutkan dengan SDW sebanyak µl, dihomogenasi dengan vortex dan tabung mikro yang berisi plasmid dibiarkan selama 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi rpm selama 1-2 menit. Selanjutnya supernatan yang berisi plasmid DNA dipindahkan ke tabung yang baru menggunakan mikropipet. Sebanyak 1 µl hasil isolasi digunakan untuk elektroforesis dan selanjutnya diamplifikasi dengan PCR. Amplifikasi PCR. Untuk mendapatkan fargmen GH mature (mgh) masing-masing ikan dilakukan amplifikasi degan PCR. Primer yang digunakan untuk amplifikasi mgh ikan kerapu kertang (El-mGH) adalah primer forward ElmGH-F 5 - ctcgag cag cca atc aca gac ggc cag - 3 dan primer reverse El-mGH-R 5 - aagctt cta cag ggt aca gtt ggc ctc agg - 3 yang masing-masing dilengkapi dengan situs restriksi XhoI dan HindIII (digaris bawahi dan dicetak tebal). Primer untuk amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan gurame (Og-mGH) adalah primer forward Og-mGH-F 5 - ggatcc cag cca atc aca gac agc cag - 3 dan reverse Og-mGH-R 5 - gaattc cta cag agt gca gtt agc ttc tgg - 3 yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan EcoRI. Selanjutnya primer untuk amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan mas (Cc-mGH) adalah primer forward Cc-mGH-F 5 - ggatcc tca gac aac cag cgg ctc ttc - 3 dan reverse Cc-mGH-R 5 - gtcgac cta cag ggt gca gtt gga atc cag - 3 yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan SalI. Reaksi PCR dilakukan dengan volume 10 µl yang mengandung 1 µl plasmid cdna GH masing-masing ikan dari hasil isolasi, 1 µl primer GH mature forward maupun reverse (10 pmol/µl), 1 µl dntp, 1 µl Ex Taq buffer, 0.05 µl Ex Taq polymerase (TAKARA) kemudian sisanya ditambahkan SDW. Selanjutnya proses PCR dijalankan pada suhu 94 C selama 3 menit (Pra PCR); (Denaturasi 94 C selama 30 detik; Annealing 67 C selama 30 detik; Extension 72 C selama 1

29 13 menit) sebanyak 35 siklus; dan Pasca PCR 72 C selama 3 menit: dan 4 o C (tak hingga), untuk amplifikasi El-mGH dan Cc-mGH menggunakan suhu annealing 67 C, sedangkan Og-mGH menggunkan suhu annealing 69 C. Ligasi ke vektor kloning. Fragmen DNA produk PCR diligasi (disambungkan) ke vektor kloning pgem-t Easy menggunakan T4 DNA ligase (TAKARA). Vektor pgem-t Easy disentrifugasi agar kandungannya terkumpul pada dasar tabung, selanjutnya reaksi ligasi dicampur pada tabung mikro dengan komposisi: 6,5 µl 2x buffer ligasi; 0,5 µl Vektor pgem-t Easy (50 ng); 1 µl T4 DNA ligase sebanyak; produk PCR sebanyak 5 µl; dan SDW 5,2 µl. Inkubasi dilakukan selama 2 jam pada suhu ruang dan dilanjutkan semalaman di dalam refrigerator (suhu 4 C). Pembuatan Sel Kompeten. Sel kompeten adalah sel bakteri yang digunakan dalam proses transformasi, untuk kloning (perbanyakan) digunakan bakteri Escherichia coli DH5α, sedangkan untuk ekspresi digunakan bakteri Escherichia coli BL21 (DE3). Pembuatannya adalah; koloni tunggal bakteri E. coli DH5α atau BL21 (DE3) dikultur dalam 25 ml LB (komposisinya adalah 1 gram tryptone 1%, 0,59 gram yeast exstract 0,5%, dan 1 gram NaCl 1% di dalam 100 ml SDW ) kemudian diinkubasi (shaker) pada suhu 37 o C selama jam. Selanjutnya 1% kultur E. coli diambil untuk dilakukan sub kultur dengan memasukkan ke dalam 25 ml LB yang baru kemudian selanjutnya diinkubasi selama 3 jam (peremajaan bakteri), selanjutnya kultur bakteri tersebut disimpan dalam wadah yang berisi es selama 30 menit. Kemudian, kultur bakteri sebanyak 1,5 ml dimasukkan ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi pada 5000 rpm selama 2 menit, supernatan yang terbentuk kemudian dibuang (dilakukan sebanyak 2 kali). Pelet yang ada dalam tabung mikro selanjutnya dicuci dengan menggunakan 1 ml NaCl mix dingin dan disentrifugasi selama 2 menit pada 5000 rpm, supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian ditambahkan CaCl 2 mix dingin sebanyak 1 ml, selanjutnya di biarkan selama 20 menit dalam wadah yang berisi es, kemudian disentrifugasi kembali selama 2 menit pada 5000 rpm, selanjutnya supernatannya dibuang. Kemudian pelet yang terbentuk disuspensikan dengan 200 µl CaCl 2 mix, selanjutnya campuran tersebut diinkubasi dalam es selama 20 menit hingga 1 jam, kemudian siap digunakan sebagai sel kompeten.

30 14 Transformasi. Transformasi merupakan proses memasukkan plasmid yang mengandung fragmen DNA insersi ke dalam bakteri E. coli DH5α sebagai wahana kloning plasmid atau ke dalam bakteri E. coli BL21 sebagai wahana ekspresi protein. Sebanyak 6,5 µl plasmid hasil ligasi dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi sel kompeten. Kemudian, campuran ini didiamkan selama 20 hingga 30 menit di dalam wadah yang berisi es. Transformasi dilakukan dengan cara diberikan kejutan suhu 42 o C selama 45 detik. Setelah itu tabung mikro diinkubasi on-ice selama 2-3 menit. Selanjutnya, sebanyak 200 µl LB ditambahkan ke dalam tabung mikro. (Larutan LB mengandung 1 gram tryptone 1%, 0,59 gram yeast extract 0,5%, 1 gram NaCl 1% dengan pelarut 100 ml SDW). Selanjutnya diinkubasi pada shaker dengan suhu 37 o C selama 1,5 jam pada 200 rpm. Kemudian bakteri disebar di dalam media agarosa 2xYT yang mengandung IPTG, X-gal dan ampisilin, sehingga disingkat menjadi 2xYT (I, X, A). 2xYT mengandung tryptone 1,6%, yeast extract 1%, NaCl 0,5%, Bacto agar dalam SDW). Kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama jam. Identifikasi Transforman. Identifikasi dilakukan dengan metode cracking (Alimuddin et al. 2008). Koloni putih hasil transformasi yang tumbuh di atas agarosa 2xYT diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke ujung tabung mikro dan dilanjutkan dengan pembuatan master plate agarosa 2xYT (I, X dan A). Master plate kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C sekitar 8 jam. Ke dalam tabung mikro yang telah dioleskan bakteri ditambahkan 10 µl cracking buffer, 10 µl EDTA 1 M dan 1 µl loading buffer cracking berisi KCl 1 M dengan perbandingan volume 1:1. (Cracking buffer mengandung 0,2 gram saccharosa, 40 µl NaOH 5 M, 50 µl SDS 10% dan sisanya SDW hingga volume larutan menjadi 1 ml). Selanjutnya tabung mikro di Spin down pada 5000 rpm selama 2 hingga 3 detik kemudian divortex. Larutan tersebut disentrifugasi pada rpm selama 5 menit. Selanjutnya dielektriforesis sebanyak 10 µl supernatan yang terbentuk dengan gel agarose 0,7% untuk mengidentifikasi apakah bakeri yang sudah ditransformasi membawa plasmid yang berisi gen yang kita insersikan dan membandingkannya dengan kontrol, vektor pgem-t Easy tanpa insersi fragmen DNA mgh.

31 15 Pembuatan Vektor Ekspresi Protein rgh Isolasi Fragmen GH Mature. Plasmid pgem-t Easy yang mengandung mgh (El-mGH, Og-mGH dan Cc-mGH) yang telah dikloning di dalam bakteri E coli DH5α kemudian diisolasi menggunakan kit GF-1 Plasmid DNA Extraction Kit (Vivantis) dengan prosedur yang sesuai dengan manual kit yang digunakan. Selanjutnya vektor pgem-t Easy yang mengandung El-mGH (kerapu kertang) dipotong dengan menggunakan enzim restriksi XhoI dan HindIII, vektor pgem-t Easy yang mengandung Og-mGH (gurame) dipotong dengan menggunakan enzim restriksi BamHI dan EcoRI, sedangkan vektor pgem-t Easy yang mengandung Cc-mGH (mas) dipotong dengan menggunakan enzim restriksi BamHI dan SalI. Untuk mengeluarkan fragmen GH mature dari vektor pgem-t Easy, pereaksinya adalah 5 µl masing-masing plasmid pgem-t Easy yang mengandung mgh dimasukkan kedalam tabung mikro selanjutnya di tambahkan 5 µl Buffer (ElmGH: 10x M Buffer; Og-mGH: 10x K Buffer; Cc-mGH: 10x T Buffer), kemudian ditambahkan enzim restriksi masing-masing 1 µl, selanjutnya ditambahkan SDW sebanyak 38 µl. Fragmen mgh terpotong dan siap diligasikan ke vektor ekspresi protein. Preparasi Vektor Ekspresi. Vektor ekspresi yang akan digunakan adalah pcold 1 DNA (Takara-bio). Vektor ekspresi sebanyak 2 μl dimasukkan masingmasing ke dalam tabung mikro lalu dicampurkan dengan 5 µl 10x Buffer. Untuk El-mGH ditambahkan enzim restriksi XhoI dan HindIII, untuk Og-mGH menggunakan enzim BamHI dan EcoRI, dan untuk Cc-mGH menggunakan enzim BamHI dan SalI masing-masing 1 µl, kemudian ditambah SDW sebanyak 30 μl. Campuran ini diinkubasi pada suhu 37 C selama 2 hingga 4 jam. Selanjutnya, vektor yang sudah dipotong kemudian disimpan pada suhu -20 C hingga akan digunakan. Ligasi mgh ke Vektor Ekspresi. Reaksi ligasi yang dilakukan meliputi 5 µl larutan mgh masing-masing El-mGH, Og-mGH, dan Cc-mGH; kemudian 0,5 µl pcold 1 DNA yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi; 6,5 µl 5x buffer ligasi, dan 1 µl enzim T4 DNA ligase (TAKARA). Selanjutnya larutan diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang, kemudian inkubasi dilanjutkan semalaman direfrigerator (suhu sekitar 4 o C).

32 16 Transformasi ke E. coli BL21. Bakteri yang digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan rgh adalah bakteri E. coli BL21 yang sebelumnya sudah dibuat menjadi kompeten. Sebanyak 6,5 µl plasmid hasil ligasi yang sudah diinsersikan gen dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi sel kompeten. Kemudian, campuran ini didiamkan selama 20 hingga 30 menit di dalam wadah yang berisi es. Transformasi dilakukan dengan cara diberikan kejutan suhu 42 o C selama detik. Setelah itu tabung mikro diinkubasi on-ice selama 2-3 menit. Kemudian ditambahkan LB sebanyak 200 µl ke dalam tabung mikro. Selanjutnya diinkubasi pada shaker dengan suhu 37 o C selama 1,5 jam pada 200 rpm, kemudian bakteri disebar di dalam media agarosa 2xYT yang ditambahkan ampisilin. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama jam. Identifikasi dan Peremajaan Transforman. Bakteri E. coli BL21 yang membawa plasmid pcold 1 DNA yang telah disisipi fragmen mgh ikan kerapu kertang (El-mGH), ikan gurame (Og-GH), dan ikan mas (Cc-mGH) dicracking kemudian diidentifikasi untuk membuktikan bahwa bakteri tersebut membawa plasmid yang berisi gen yang telah kita insersikan. Selanjutnya bakteri tersebut diremajakan dan dikultur secara massal untuk memproduksi protein rekombinan yang diekspresikan oleh plasmid pcold-mgh di dalam bekteri tersebut. Produksi Protein rgh Ekspresi protein rgh di dalam E. coli BL21. Klon bakteri E. coli BL21 yang positif mengandung pcold-mgh dikultur selama Jam dengan dishake pada tabung erlenmeyer dengan media 2xYT cair 200 ml tambah ampisilin, selanjutnya subkultur selama 2 jam pada suhu 37 o C dengan dishake. Selanjutnya kultur bakteri diberi kejutan dingin pada suhu 15 o C selama 30 menit. Kemudian ditambahkan 200 µl IPTG 100 mm, kultur dilanjutkan selama 24 jam dengan dishake pada suhu 15 o C, kemudian pelet bakteri dikoleksi dengan disentrifugasi 4000 rpm selama 5 menit, selanjutnya pelet bakteri E. coli BL21 yang mengandung protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) dianalisis dengan teknik SDS-PAGE. Analisis protein rgh. Pelet BL21 hasil ekspresi kemudian diresuspensi dengan PBS (16 mm Na 2 HPO 4-2H 2 O, 4 mm NaH 2 PO 4 2H 2 O, 120 mm NaCl, ph

33 17 7.4) ditambah 0.1% (w/v) Triton X-100 kemudian dilisis dengan alat sonikasi 6 siklus dengan kekuatan penuh menggunakan probe 9 mm, dengan perlakuan 1 menit dihidupkan dan 1 menit dimatikan sambil suspensinya dibenamkan di dalam es. Kemudian disentrifugasi untuk memisahkan material yang tidak larut dalam homogenate sel, protein rgh akan terikat di dalam pelet dan supernatannya dibuang, selanjutnya pelet yang terbentuk dicuci dua kali dengan 1 M NaCl yang berisis 1% (w/v) Triton X-100 dan terakhir dibilas dengan PBS, selanjutnya pelet bakteri yang mengandung protein rgh ikan kerapu kertang, ikan gurame dan ikan mas dianalisis dengan teknik SDS-PAGE. SDS-PAGE atau sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elektroforesis merupakan teknik yang secara luas digunakan dalam bidang biokimia, forensik, genetika, dan biologi molekuler untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya dengan memigrasikannya pada gel elektroporesis atau SDS-PAGE berfungsi mengikat polipeptida sehingga terbentuk protein kompleks yang tereduksi sesuai dengan berat molekulnya. Protein dari 1 µg pelet bakteri dianalisis menggunakan metode SDS-PAGE dengan konsentrasi gel poliakrilamid 10%, dan protein divisualisasi menggunakan pewarna Coomassie Blue. Ukuran protein rgh diprediksi berdasarkan konsensus bahwa 10 kda protein sama dengan 270 bp DNA. Uji Bioaktivitas Protein rgh Bioaktivitas protein rgh ditentukan dengan menganalisis pertumbuhan ikan nila yang diinjeksi dengan rgh dan dibandingkan dengan ikan nila yang hanya disuntik dengan PBS atau protein dari pcold 1 tanpa fragmen DNA mgh. Juvenil ikan nila ukuran ±11 g/ekor diinjeksi dengan protein total (inclusion body) dengan dosis 1 µg pelet bakteri yang dilarutkan dalam 10 μl PBS per gram ikan. Injeksi dilakukan secara intramuscular seminggu sekali selama 4 minggu. Bobot ikan diukur seminggu sekali selama 2 bulan pengamatan dan diakhir dihitung kelulus hidupannya Analisis Data Vektor kloning dan vektor ekspresi yang dihasilkan serta produksi protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan kerapu kertang (El-mGH), ikan

34 18 gurame (Og-mGH), dan ikan mas (Cc-mGH) disajikan dalam bentuk gambar kemudian dianalisis dan dijabarkan secara deskriptif. Selanjutnya data hasil uji bioaktivitas di analisis ragam dan jika terjadi perbedaan antar perlakuan dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil.

35 19 HASIL DAN PEMBAHASAN Vektor Kloning Protein rgh Isolasi Plasmid cdna GH. Plasmid pgem-t Easy yang mengandung cdna; El-mGH, Og-mGH dan Cc-mGH berhasil diisolasi dari bakteri konstruksi E. coli DH5α dengan menggunakan kit FlexiPrep. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya pita DNA dengan ukuran sekitar 3953 bp untuk pgem-t Easy yang mengandung cdna; El-GH, 3858 bp untuk Og-GH, dan 3648 bp untuk Cc-GH. Pita ini menunjukkan jumlah ukuran vektor pgem-t Easy yang berukuran 3015 bp ditambah dengan cdna GH masing-masing ikan; kerapu kertang, ikan gurame dan ikan mas (Gambar 3). kb 5,0-3,0-2,0 - Cc-cDNA GH Og-cDNA GH El-cDNA GH M Gambar 3. Hasil isolasi plasmid pgem-t Easy yang mengandung Cc-cDNA GH, Og-cDNA GH, dan El-cDNA GH. M: marka panjang fragmen DNA (2-lod ladder, BioLabs Inc., New England); angka di sebelah kiri: ukuran fragmen DNA marka; angka 1-2 adalah nomor klon bakteri hasil isolasi plasmid cdna GH. Analisis Fragmen GH Mature. Sekuens cdna yang mengkodekan hormon pertumbuhan (GH) ikan kerapu kertang berdasarkan data Genbank EU berukuran sekitar 938 bp yang menyandikan 205 asam amino dan dilengkapi dengan signal peptida (Lampiran 1). Untuk ikan mas sekuens cdna yang mengkode hormon pertumbuhannya berukuran sekitar 1164 bp yang menyandikan 211 asam amino berdasarkan data Genbank M27000 (Lampiran 2), namun yang tersambung dalam plasmid pgem-t Easy hanya bagian CDSnya yang berukuran sekitar 633 bp. Dan cdna yang mengkode hormon pertumbuhan ikan gurame belum terdapat di data Genbank, namun berdasarkan penelitian Nugroho et al. (2008) sekuens cdna yang mengkode hormon pertumbuhan ikan gurame berukuran sekitar 843 bp yang menyandikan 205 asam amino. pgem-t Easy/ cdna GH Prediksi asam amino gen GH menggunakan program GENETYX version 7 pada ikan kerapu kertang (Lampiran 3), ikan mas (Lampiran 4), dan ikan gurame (Lampiran 5), sehingga dapat ditentukan gen target atau disebut juga dengan GH

36 20 mature (mgh) yang digunakan dalam pembuatan protein rekombinan GH. Untuk ikan kerapu kertang (El-mGH) berukuran sekitar 576 bp, ikan mas (Cc-mGH) berukuran sekitar 579 bp, dan ikan gurame (Og-mGH) berukuran sekitar 576 bp yang masing-masing diambil dari daerah yang ditranslasikan atau CDS dengan menghilangkan signal peptidanya. Signal peptida biasanya terdiri dari 16 hingga 50 asam amino yang diprediksi dengan memasukkan sekuens yang ditranslasi ke dalam program SignalP 3.0 Server pada website sehingga diketahui kemungkinan besar signal peptida CDS GH ikan kerapu kertang terdapat pada posisi 17 dan 18 (Lampiran 6), ikan mas terdapat pada posisi 22 dan 23 (Lampiran 7), pada ikan gurame terdapat pada posisi 17 dan 18 (Lampiran 8). Amplifikasi PCR. Amplifikasi PCR cdna GH masing-masing ikan; ikan gurame, ikan mas, dan ikan kerapu kertang dengan menggunakan primer spesifik menghasilkan pita DNA yang masing-masing berukuran sekitar 576 bp, 579 bp, dan 576 bp setelah dimigrasikan pada gel elektroforesis (Gambar 4) Og-mGH Cc-mGH El-mGH kb M ,8-0,5 - mgh 0,3 - Gambar 4. Produk PCR fragmen GH mature; Og-mGH, Cc-mGH, dan El-mGH. Kloning ke Vektor pgem-t Easy dan Transformasi ke E. coli DH5α. Fragmen mgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH), dan ikan kerapu kertang (El-mGH) yang telah diamplifikasi dengan PCR kemudian disambungkan (ligasi) ke vektor kloning pgem-t Easy untuk diperbanyak secara in vivo di dalam bakteri konstruksi E. coli DH5α. Plasmid yang dihasilkan disebut sebagai pt-mgh. Keberhasilan dalam penyambungan (ligasi) sekuens GH mature ikan kerapu gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH), dan ikan kerapu kertang (El-mGH) ke vektor kloning pgem-t Easy dapat diketahui dengan cara mengidentifikasi masuknya plasmid tersebut pada bakter konstruksi E. coli DH5α (transforman). Koloni bakteri yang mengandung vektor yang tersisipi mgh akan tumbuh berwarna putih, sedang koloni bakteri yang mengandung vektor yang tidak tersisipi dengan mgh akan berwarna biru. Hal ini dikarenakan vektor pgem-t

37 21 Easy memiliki marker gen LacZ sebagai gen pelapor (Kobolak & Muller 2003). Selanjutnya Suharsono (2000) mengatakan bahwa dengan penambahan IPTG (Isopropil thiogalaktosida) dan X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolylbeta-Dgalactopyranocide) pada media tumbuh, maka gen LacZ yang mengkode enzim β- galaktosidase dapat menguraikan X-gal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4- kloroindigo, sehingga menghasilkan koloni berwarna biru. Namun, apabila terjadi insersi gen (rgh) pada MCS, maka gen LacZ tidak dapat berfungsi untuk menguraikan X-gal menjadi galaktosa sehingga koloni bakteri berwarna putih. T T T T T T pgem-t Easy/El-mGH pgem-t Easy/Og-mGH pgem-t Easy/Cc-mGH 3 kb Gambar 5. Hasil cracking pgem-t Easy/El-mGH, pgem-t Easy/Og-mGH, dan pgem-t Easy/Cc-mGH dari bakteri konstruksi E. coli DH5α. T pada gambar: marka ukuran plasmid pgem-t Easy (3 kb) dan nomor 1-5 adalah nomor sampel klon bakteri. Proses ligasi dan transformasi telah berhasil dilakukan. Hal ini dapat dilihat dari hasil cracking yang menunjukkan bahwa sebagian besar bakteri E. coli tersebut membawa plasmid pt-mgh (Gambar 5). Keberhasilan ligasi ditunjukkan dengan bertambah besarnya ukuran plasmid dibandingkan dengan ukuran pgem- T Easy (T= 3 kb). (Gambar 5). Selanjutnya koloni bakteri konstruksi E. coli DH5α yang positif mengandung plasmid rekombinan GH dikoleksi kemudian diremajakan dan ditumbuhkan pada media 2xYT + Ampisilin untuk diperbanyak secara in vivo (Gambar 6). DH5α: pt/el-mgh DH5α: pt/og-mgh DH5α: pt/cc-mgh Gambar 6. Klon bakteri konstruksi E. coli DH5α yang mengandung pt-mgh.

38 22 Vektor Ekspresi Protein rgh Isolasi Plasmid Fragmen GH Mature. Hasil elektroforesis plasmid ptmgh (El-mGH, Og-mGH, dan Cc-mGH) terdapat pita yang masing-masing berukuran sekitar 3,5 kb (Gambar 7). Hal ini menunjukkan bahwa plasmid pgem-t Easy yang mengandung fragmen DNA mature berhasil diisolasi dari bakteri konstruksi E. coli DH5α. kb 10,0-5,0-3,0-2,0-1,0-0,5-0,2 - M M M pt/el-mgh pt/og-mgh pt/cc-mgh Gambar 7. Isolasi plasmid pt-mgh dari bakteri konstruksi E. coli DH5α. Selanjutnya, masing-masing plasmid pt-mgh dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai dengan situs pemotongan yang dipasang diawal pada pembuatan primer. Sehingga, didapatkan hasil pemotongan pada Gambar 8 terdapat dua pita, pita pertama merupakan pgem-t Easy yang berukuran sekitar 3,0 kb, sedangkan pita kedua merupakan fragmen DNA mature (mgh) berukuran sekitar 0,5 kb yang telah terlepas dari plasmid pt-mgh yang dipotong dengan enzim restriksi. 2 1 M 2 1 M 2 1 M kb - 10,0 pgem-t Easy mgh - 3,0-2,0-1,0-0,5 pt/el-mgh pt/cc-mgh pt/og-mgh Gambar 8. Pemotongan pt-mgh dengan enzim restriksi untuk mengeluarkan mgh.

39 23 Preparasi Vektor Ekspresi. Vektor ekspresi yang digunakan adalah pcold 1 DNA merupakan vektor ekspresi yang dapat diinduksi dengan kejutan dingin, berukuran 4,4 kb yang merupakan plasmid DNA sirkular tertutup, sehingga untuk menyambungkan fragmen DNA GH mature ke plasmid tersebut dan menyiapkan tempat ligasi maka plasmid pcold 1 DNA perlu dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan yang digunakan untuk mengisolasi fragmen DNA mgh dari plasmid pt-mgh masing-masing ikan (El-mGH, Og-mGH, dan Cc-mGH). kb M M 10,0-5,0-3,0-2,0-1,0-0,5-0,2 - Gambar 9. Pemotongan vektor ekspresi pcold 1 DNA dengan enzim restriksi. M: marka panjang fragmen DNA; angka 1: pcold 1 yang belum didigesti, angka 2: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi BamHI dan SalI, angka 3: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi XhoI dan HindIII, dan angka 4: pcold 1 yang didigesti dengan enzim restriksi BamHI dan EcoR. Mobilitas fragmen DNA pcold 1 hasil digesti berbentuk linier dalam gel agarosa sehingga menjadi lebih lambat dibandingkan dengan plasmid pcold 1 berbentuk sirkular (Gambar 9; kolom 1), sehingga ukurannya terlihat lebih besar (Gambar 9; kolom 2, 3, dan 4). Ligasi Fragmen mgh dan Transformasi ke E. coli DH5α. Fragmen DNA mgh yang telah dipotong dan dipurifikasi dari vektor kloning pgem-t Easy kemudian disambungkan dengan Vektor Ekspresi pcold 1 DNA yang juga sudah dipotong dengan enzim restriksi yang sama (Gambar 9). Selanjutnya untuk perbanyakan secara in vivo diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli DH5α yang ditumbuhkan pada media 2xYT + Ampisilin. Untuk mengetahui keberhasilan transformasi, dilakukan seleksi koloni bakteri yang mambawa vektor Ekspresi pcold 1 DNA yang mengandung fragmen

40 24 DNA mgh dengan metode cracking bakteri. Ukuran plasmid yang dihasilkan menjadi lebih besar dibandingkan dengan ukuran plasmid pcold 1. Plasmidplasmid pcold-mgh tersebut selanjutnya disekuensing untuk mengetahui klon bakteri yang membawa mgh dengan sekuens DNA yang menyandikan asam amino lengkap dan sesuai dengan yang dilaporkan peneliti-peneliti sebelumnya. Dari hasil sekuensing, diperoleh 1 klon untuk pcold/og-mgh, 2 klon untuk pcold/el-mgh dan 2 klon untuk pcold/cc-mgh (Gambar 10) DH5α: pcold El-mGH DH5α: pcold Og-mGH DH5α: pcold Cc-mGH Gambar 10. Klon bakteri E. coli DH5α yang mengandung pcold-mgh Isolasi plasmid pcold 1 mgh dan Analisis Urutan Nukleotida. Plasmid pcold 1 yang mengandung fragmen mgh selanjutnya di isolasi dari klon bakteri E. coli DH5α hasil transformasi, kemudian disekuensing untuk menganalisis urutan nukleotida yang telah tersambung pada vektor ekspresi pcold 1 DNA (Lampiran 9 dan 10). Urutan nukleotida yang diperoleh dari hasil sekuensing disejajarkan dengan sekuens mgh dari data Genbank dengan menggunakan program GENETYX version7 untuk melihat kesamaan dan keberhasilan ligasi sekuens mgh ke vektor ekspresi (Lampiran 11 dan 12). Hal ini menunjukkan bahwa urutan nukleotida plasmid pcold 1 yang mengandung mgh ikan kerapu kertang dan ikan mas hasil sekuensing memiliki tingkat kesamaan sekitar 99% dengan sekuens GH mature dari data Genbank. Hal ini menunjukkan bahwa proses ligasi atau penyambungan sekuens mgh ke dalam plasmid pcold 1 berhasil dilakukan. Transformasi ke Bakteri Ekspresi E. coli BL21. Plasmid pcold 1 yang mengandung GH mature hasil isolasi dari bakteri konstrusiksi E. coli DH5α yang telah sekuensing kemudian di transformasikan ke dalam bakteri ekspresi E. coli

41 25 BL21 untuk mengekspresikan protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas. Selanjutnya untuk menseleksi koloni yang mengandung pcold 1 yang membawa sisipan sekuens mgh dilakukan dengan metode cracking bakteri kemudian dielektroforesis pada gel agarose 0,7%. Pada vektor ekspresi pcold 1 DNA tidak memiliki gen penanda LacZ seperti pada vektor pgem-t Easy, sehingga tidak menyebabkan koloni bakteri hasil transformasi tumbuh berwarna putih-biru, sehingga untuk memastikan gen traget tersambung pada plasmid dan berhasil ditransformasikan maka cracking dilakukan pada bakteri hasil transformasi dengan memilih 16 klon tunggal yang berukuran besar (Gambar 11). kb 10,0-5,0-3,0 - M (a) kb 10,0-5,0-3,0 - M (b) kb 10,0-5,0-3,0 - M (c) Gambar 11. Elektroforesis hasil cracking pcold-mgh dari bakteri E. coli BL21. M: marka panjang fragmen DNA; angka di sebelah kiri: ukuran fragmen DNA marka; angka 1-16 adalah nomor klon bakteri hasil transformasi pcold-mgh; Gambar (a) hasil transformasi pcold/elmgh; Gambar (b) hasil transformasi pcold/og-mgh; dan Gambar (c) hasil transformasi pcold/cc-mgh. Hasil cracking didapatkan sebagian besar klon bakteri E. coli BL21 membawa plasmid pcold-mgh. Selanjutnya PCR dilakukan untuk mengetahui klon bakteri E. coli BL21 yang membawa plasmid pcold-mgh dengan arah ligasi mgh yang benar. DNA produk PCR dengan ukuran sekitar 0,65 kb (sekitar 0,6 kb fragmen DNA mgh dan 0,05 kb fragmen DNA pcold 1) diperoleh pada sampel no. 1, 2, 4, 5 dan 8, yang berarti bahwa klon bakteri tersebut mengandungkan plasmid pcold-mgh dengan orientasi ligasi mgh benar (Gambar 12).

42 26 kb 1,0-0,5-0,3 - M M Gambar 12. Produk PCR dalam uji orientasi ligasi fragmen DNA mgh pada pcold 1. M: marka panjang fragmen DNA; angka di sebelah kiri: ukuran fragmen DNA marka. Dari hasil uji orientasi arah ligasi didapatkan 10 klon untuk pcold/ogmgh, 10 klon untuk pcold/el-mgh dan 6 klon untuk pcold/cc-mgh, selanjutnya klon bakteri E. coli BL21 yang membawa plasmid pcold-mgh tersebut dikultur dan diremajakan untuk memproduksi protein rgh (Gambar 13). BL21 : pcold/el-mgh BL21 : pcold/og-mgh BL21 : pcold/ Cc-mGH Gambar 13. Hasil kultur klon bakteri E. coli BL21 yang telah diseleksi positif mengandung pcold-mgh dengan arah orientasi ligasi mgh yang benar. Produksi Protein rgh Ekspresi dan Analisis Protein rgh dengan Teknik SDS-PAGE. Protein rgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (ElmGH) pada bakteri E. coli BL21 menggunakan vektor ekspresi pcold 1 berhasil diproduksi, sebanyak 200 ml media kultur 2xYT cair (+Ampsilin) dapat menghasilkan ±0.93 gram pelet bakteri yang mengandung rgh. Tingkat produksi protein rgh dari ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas diperkirakan % (diprediksi menggunakan software Totallab TL 120) dari total protein yang dihasilkan sel E. coli BL21. Berdasarkan banyak penelitian melaporkan bahwa ekspresi protein rekombinan hormon pertumbuhan oleh bakteri E. coli BL21 dalam bentuk insoluble protein yang terekspresi 5-10% dari total protein E.

43 27 coli, seperti: GH ikan nila (Rantier-Dulue et al. 1989), GH ikan tuna (Sato et al. 1988), dan GH ikan yellowfin progy (Tsai et al. 1995). Selanjutnya hasil visualisai protein rgh ditunjukkan pada Gambar 14. Tingkat produksi rgh (ukuran sekitar 25 kda, ditunjukkan dengan tanda panah) untuk ketiga sumber mgh tersebut relatif sama, meskipun jumlah dan ukuran protein lainnya bervariasi. Sementara itu, protein yang dihasilkan oleh bakteri BL21 yang hanya membawa pcold 1 tanpa fragmen mgh adalah tidak memproduksi protein rgh dan protein yang lainnya seperti halnya pada BL21 yang membawa pcold-mgh. Selanjutnya, ukuran protein rgh seperti ditunjukkan pada Gambar 14 adalah 25 kda, yang terdiri dari 22 kda prediksi ukuran rgh berdasarkan panjang fragmen DNA dan sisanya berasal dari vektor pcold 1, yaitu His-tag dan Factor Xa site. Gambar 14. SDS-PAGE protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH). M: marka ukuran protein (Prestained protein marker, Broad range 7-175; Biolabs-P7708S); angka di sebelah kiri gambar merupakan ukuran marka protein; dan N: protein dari bakteri BL21 yang membawa pcold 1 tanpa fragmen DNA mgh. Uji Bioaktivitas Protein rgh Pada Ikan Nila dengan Cara Injeksi Bioaktivitas protein rgh diketahui dengan membandingkan pertumbuhan ikan nila yang diinjeksi rgh dan ikan kontrol (yaitu ikan yang diinjeksi dengan protein dari bakteri BL21 yang mengandung pcold 1 saja dan yang diinjeksi

44 Bobot ikan nila (gram) 28 dengan PBS saja). Seperti ditunjukkan pada Gambar 15, pertambahan bobot ikan nila yang diinjeksi dengan rgh lebih tinggi (P<0.1) dibandingkan dengan kontrol (PBS dan pcold 1). Hal ini menandakan bahwa protein rgh yang dihasilkan tersebut ikut berperan dalam meningkatkan pertumbuhan ikan PBS pcold1 Og-mGH Cc-mGH El-mGH Minggu ke- Gambar 15. Laju pertumbuhan bobot ikan nila per minggu yang disuntik dengan PBS dan pcold 1 (sebagai kontrol) dan protein rgh ikan kerapu kertang (El-mGH), ikan gurame (Og-mGH) dan ikan mas (CcmGH). Pertambahan bobot ikan nila yang diinjeksi dengan rgh El-mGH (20,94%) terlihat sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan kedua rgh lainnya (18,09% untuk Cc-mGH dan 16,99% untuk Og-mGH) (Gambar 16). Hal ini diduga karena perbedaan respons ikan nila dalam menerima rgh dari ikan kerapu kertang lebih baik dari rgh ikan gurame dan ikan mas. Pertambahan bobot ikan nila yang diberi perlakuan injeksi rgh terlihat cukup tinggi setelah penyuntikan keempat. Respons yang lambat tersebut diduga terjadi karena reseptor memerlukan faktor intermediet atau waktu untuk mengenali rgh yang diinjeksikan. Selanjutnya, secara umum ikan yang diberi perlakuan rgh menunjukkan peningkatan nafsu makan yang ditunjukkan dengan tingkah laku yang agresif pada saat pemberian pakan. Hal yang sama juga dilaporkan pada ikan mas yang diinjeksikan rgh ikan giant catfish (Promdonkoy et al. 2004).

45 29 a ab abc bc c Gambar 16. Pertambahan bobot (g) ikan nila yang disuntik protein rgh ikan gurame (Og-mGH), ikan mas (Cc-mGH) dan ikan kerapu kertang (El-mGH). Protein total dari 1 µg bakteri per gram ikan nila disuntikkan sekali seminggu selama 4 minggu, dan pertumbuhan ikan diukur setiap minggu selama 2 bulan. PBS kontrol: ikan nila disuntik dengan PBS; dan pcold 1: ikan nila disuntik dengan protein dari bakteri BL21 yang mengandung plasmid pcold 1 tanpa fragmen DNA mgh. Banyak penelitian tentang pemanfaatan rgh ikan untuk memacu laju pertumbuhan ikan budidaya seperti rgh ikan giant catfish oleh Promdonkoy et al. (2004), rgh ikan yellowfin porgy oleh Tsai et al. (1997) dan yang lainnya menyatakan bahwa sintesis protein rgh di dalam bakteri E. coli yang diuji akttivitas biologinya mempunyai potensi yang sama dengan GH alami yang dimiliki oleh spesies tersebut, walaupun kita belum mampu membandingkan aktivitas rgh yang kita cobakan dengan hormon alaminya. Namun dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa rgh yang diproduksi di dalam bakteri E. coli mempunyai aktivitas biologi, sehingga dapat diaplikasikan dalam kegiatan budidaya perikanan secara luas. Pada penelitian ini, deliveri rgh dilakukan menggunakan metode injeksi. Dengan pertimbangan teknis dan efisiensi aplikasi rgh dalam budidaya ikan, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui metode pemberian rgh yang cocok serta apakah bioktivitas rgh yang diberikan mulai pada fase larva. Hasil penelitian Tsai et al. (1997) menunjukkan peningkatan laju pertumbuhan hingga 60% pada juvenil ikan kakap hitam yang diberikan rgh melalui pakan.

46 30 Selain itu hasil penelitian Acosta et al. (2007) pada ikan nila merah menunjukkan respons yang sangat signifikan (lebih dari 100% dibandingkan kontrol) dengan memberikan rgh dari ikan nila melalui perendaman pada larva. Pemberian rgh melalui pakan yang dicampur rgh serta melalui perendaman larva dalam media mengandung rgh secara teknis lebih praktis untuk diaplikasikan dibandingkan dengan metode injeksi. Banyak penelitian tentang pemanfaatan rgh ikan untuk memacu laju pertumbuhan ikan budidaya seperti rgh ikan giant catfish oleh (Promdonkoy et al. 2004), rgh ikan yellowfin porgy oleh (Tsai et al. 1997) dan yang lainnya menyatakan bahwa sintesis protein rgh didalam bakteri E. coli yang diuji akttivitas biologinya mempunyai potensi yang sama dengan GH alami yang dimiliki oleh organisme tersebut, walaupun kita belum mampu membandingkan aktivitas rgh yang kita cobakan dengan hormon alaminya. Namun dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa rgh yang diproduksi didalam bakteri E. coli mempunyai aktivitas biologi, sehingga dapat diaplikasikan dalam kegiatan budidaya perikanan secara luas.

47 31 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Protein rekombinan hormon pertumbuhan (rgh) ikan kerapu kertang, ikan gurame dan ikan mas telah dapat diproduksi dengan teknologi protein rekombinan melalui bakteri E. coli BL21 menggunakan vektor ekspresi pcold 1, dan protein rgh tersebut dapat mempercepat pertumbuhan ikan nila sebagai ikan percobaan. Saran Pengembangan metode pemberian rgh secara masal termasuk waktu pemberian yang berhubungan dengan fase perkembangan ikan, dosis dan frekuensi pemberian rgh pada berbagai spesies ikan budidaya, khususnya yang memiliki pertumbuhan yang relatif lambat, perlu dilakukan.

48 32 DAFTAR PUSTAKA Acosta JR, Morales R, Morales M, Alonso M, Estrada MP Pichia pastoris Expressing Recombinant Tilapia Growth Hormone Accelerates the Growth of Tilapia. Biotechnol Lett 29: Alimuddin, Octavera A, Arifin OZ, Sumantadinata K Karakterisasi promoter β actin ikan nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Akuakultur Indonesia 7: Anathy VT, Venugopal R, Koteeswaran TJ, Pandian, Mathavan S Cloning, Sequencing and Expression of cdna Encoding Growth Hormone from Indian Catfish (Heteropneustes fossilis). Journal of Bioscience 26: Ben-Atia IM, Fine A, Tandler B, Funkenstein S, Maurice B, Cavari, Gertler A Preparation of Recombinant Gilthead Seabream (Sparus aurata) Growth Hormone and Its Use for Stimulation of Larvae Growth by Oral Administration. General and Comparative Endocrinology 113: Björnsson BTh, Johansson V, Benedet S, Einarsdottir IE, Hildahl J, Agustsson T, Jönsson E Growth hormone endocrinology of salmonids: regulatory mechanisms and mode of action. Fish Physiol. Biochem. In: Plisetskaya, E.M. (Ed.), Special Issue: Fish Growth and Metabolism. Environmental, Nutritional and Hormonal regulation (published in 2004) 27: Bolivar RB, Gary F, Newkirk Response to within family selection for body weight in Nile tilapia Oreochromis niloticus using a single-trait animal model. Aquaculture 204: Brown TA Pengantar kloning gen. S.A. Muhamad dan Praseno (editor).yayasan Essentia Medika. Yogyakarta. Calduch-Giner JA, Duval H, Chesnel F, Boeuf G, Perez-Sanchez J and Bouhard D Fish growth hormone receptor: Molecular characterization of two membrane-anchored forms. J Endocrine Society 142: Cavri B, Funkenstein B, Chen TT, Gonzalez-Villasenor LI, Schartl M Effect of growth hormone on the growth rate of the gilthead seabream (Sparus aurata), and use of different constructs for the production of transgenic fish. Aquaculture 111: Cheng CM, Lin, CM, Shamblott M Production of biologically active recombinant teleostean growth hormone in E. coli cells. Mol Cell Endocrinal 108:

49 33 Glick BR and Pasternak JJ Molecular biotechnology: Principles and aplications of recombinant DNA (Third Edition). ASM Press, Washington, D.C. Darmawan N Isolasi, kloning dan sekuensing gen putatif enzim PQQ glukosa dehidrogenase dari Agrobacterium tumefaciens. Skripsi. Program Studi Kimia. FMIPA. IPB. Demain AL, dan Vaishnav P Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances 27: Dong H, Zeng L, Duan D, Zhang H, Wang Y, Li W, Lin H Growth hormone and two forms of insulin-like growth factors I in the giant grouper (Epinephelus lanceolatus): molecular cloning and characterization of tissue distribution. Fish Physiol Biochem 36: Dunham RA Aquculture and fisheries biotechnology genetic approach. CABI Publishing. Wallingford. Oxfordshire UK 372 pp. Fine M, Sakal E, Vashdi D Recombinant carp (Cyprinus carpio) growth hormone: expression, purification, and determination of a biological activity in vitro and in vivo. Gen Comp Endocrinol 89: Gauquelin FG, Cuzon G, Gaxiola C, Rosas L, Arena DP, Bureau JC, Cochard Effect of dietary protein level on growth and energy utilization by Litopenaeus stylirostris under laboratory conditions. Aquaculture 271: Jeh HS, Chun HK, Hong KL, Kyuboem H Recombinant flounder Growth h ormone from Escherichia coli: overexpression, efficient recovery, and growthpromoting effect on juvenile flounder by oral administration. Journal of Biotechnology 60: Johnston D, Melville-Smith R, Hendriks B, Phillips B Growth rates and survival of western rock lobster (Panulirus cygnus) at two temperatures (ambient and 23 C) and two feeding frequencies. Aquaculture 279: Kaplan SL Hormonal regulation of growth and metabolic effects of growth hormone. In: Kostyo, J.L., Goodman, H.M. (Eds.), Handbook of Physiology, Section 7: The Endocrine System, Volume V: Hormonal Control of Growth. Oxford University Press, NY, pp Kawauchi H, Moriyama S, Yasuda A, Yamaguchi K, Shirahata K, Kubota J, Hirano T Isolation and characterization of chum salmon growth hormone. Arch Biochem Biophysic 244: Khoo HW Transgenesis its applications in aquaculture. Asian Fish Sci 8:1-25.

50 34 Kobayashi S, Alimuddin, Tetsuro M, Misako M, Jun L, Masato E, Toshio T, Goro Y Transgenic Nile tilapia (Oreochromis niloticus) over-expressing growth hormone show reduced ammonia excretion. Aquaculture 270: Kobolak J, Muller F Reporter gene activities in fish can bryos. In Fingerman M, Nagabhushanan, editors. Recent Advances in Marine Biotechnology Molecular Genetics of Marine Organisme, Vol. 10. Science Publishers USA, UK; Li WS, Chen D, Wong AOL, Lin HR Molecular cloning, tissue distribution, and ontogeny of mrna expression of growth hormone in orangespotted grouper Epinephelus coioides. J Endocrinol 144: Matty AJ Fish endocrinology. Croom Helm London and Sydney Timber Press. Portland, Oregon. 267 p. McLean E, Donaldson EM, Teskeredzic E, Souza LM Growth enhancement following dietary delivery of recombinant porcine somatotropin to diploid and triploid of coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Fish Physiol Biochem 11: Moriyama S, Kawauchi H Somatic growth acceleration of juvenile abalone, Haliotis discus hannai, by immersion in and intramuscular injection of recombinant salmon growth hormone. Aquaculture Moriyama S, Hiroshi Y, Seiji S, Toshio A, Tetsuya H, Hiroshi K Oral administration of recombinant salmon growth hormone to rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 112: Mulyadi, D. Alimuddin. Subyako, Rustidja, Maftuch Kloning gen hormone pertumbuhan (GH) ikan kerapu kertang (Epinephelus lanceolatus). Disampaikan dalam Simposium Nasional Bioteknologi Akuakultur II, 14 Agustus IPB International Convention Center, Botani Square, Bogor. (Abstrak). Nam YK, Noh JK, Cho YS, Cho HJ, Cho KN, Kim CG, Kim DS Dramatically accelerate growth and extraordinary gigantism of transgenic mud loach Misgurnus mizolepis. Transgenic Res 10: Nicoll CS, Rodgers BD, Kelly KM Hormonal regulation of growth and development of nonmammalian vertebrates. In: Kostyo, J.L., Goodman, H.M. (Eds.), Handbook of Physiology, Section 7: The Endocrine System, Volume V: Hormonal Control of Growth. Oxford University Press, NY, pp Nugroho E, Alimuddin, Anang HK, Odang C, Novi M, Komar S Kloning cdna hormon pertumbuhan dari ikan gurame (Osphronemus gouramy) J Ris Akuakultur 2:

51 35 Old RW and Primrose SB Principles of genetic manipulation. 5 th edition. Oxford: Blackwell Sciencetific. Promdonkoy B, Warit S, Panyim S Production of a biologically active growth hormone from giant catfish (Pangasianodon gigas) in Escherichia coli. Biotechnology Lett 26: Reinecke M, Bjo rn TB, Walton WD, Stephen DM, Isabel No, Deborah M, Joaquim G Growth hormone and insulin-like growth factors in fish: where we are and where to go. Gen Comp Endocrinol 142: Rentier-Dulue F, Swenner D, Philippart JC, L-Hoir C, Lion M, Benrubi O, Martial JA Tilapia growth hormone: molecular cloning of cdna and expression in Escherichia coli. DNA 8: Roberts ST. Barryb J. Malisonb F. Goetz Production of a recombinantly derived growth hormone antibody and the characterization of growth hormone levels in yellow perch Aquaculture 232: Rousseau K, Dufour S Comparative aspects of GH and metabolic regulation in lower vertebrates. Neuroendocrinol 86(3): Sakamoto T, Shepherd BS, Madsen SS, Nishioka RS, Siharath K, RichmanIII NH, Bern HA, Grau EG Osmoregulatory actions of growth hormone and prolactin in an advanced teleost. Gen Comp Endocrinol 106: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T Molecular cloning: A Laboratory Mnual (Book I). Cold spring harbor. Lab. Press. New York. Sato N, Murata K, Watanabe K, Haryami T, Kariya Y, Sakaguchi M, Kimura S, Nonaka M, Kimura A Growth-promoting aktivity of tuna growth hormone and expression of tuna growth hormone cdna in Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem. 10: Suharsono S Dasar-dasar pengklonan gen : Kumpulan bahan kuliah dalam pelatihan peningkatan dan keterampilan teknisi laboratorium biologi molekuler. Bogor, Maret Kerjasama Proyek Pembinaan Kelembagaan Penelitian dan Pengembangan Pertanian/ARMP II, Badan Litbang Pertanian, Deptan dengan PAU Bioteknologi, IPB. Syaifudin M, Alimuddin, Widyastuti U, Sudrajat AO, Sumantadinata K. Aliah RS cdna encoding growth hormone from humpback grouper (Cromileptes altivelis). BIOTROPIA, 14: 1-6. Tsai H, Lin K, Kuo J, Chen S Highly efficient expression of fish growth hormone by Escherichia coli cells. Appl Environ Microbial 61:

52 36 Tsai HJ, Hsih MH, dan JC, Kuo Escherichia coli Produced Fish Growth Hormone as a Feed Additive to Enhance the Growth of Juvenile Black Seabream (Acanthopagrus schlegeli). J Appl Ichthyol 13: Venugopal T, Mathavan S and Pandian TJ Molecular cloning of growth hormone encoding cdna of Indian major carps by a modified rapid amplification of cdna ends strategy. J Biosci 27: Voet D and Voet JG Biochemistry. 2 nd Edition. New York: John Willey and sons inc. Walsh G Proteins. Biochemistry and biotechnology. John Wiley & Sons, LTD Yada T, Nagae M, Moriyama S, Azuma T Effects of prolactin and growth hormone on plasma immunoglobulin M levels of hypophysectomized rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen Comp Endocrinol 115: Yasuda A, Yamaguchi K, Noso T, Papkoff H, Palenov AL, Nicoll CS, Kawauchi H The complete amino acid sequence of growth hormone from sturgeon (Acipencer guldenstadti). Biochim Biophys Acta 1120:

53 LAMPIRAN 37

54 38 Lampiran 1. Sekuens cdna yang mengkodekan hormon pertumbuhan (GH) ikan kerapu kertang berdasarkan data Genbank EU LOCUS EU bp mrna linear VRT 07-NOV-2008 DEFINITION Epinephelus lanceolatus growth hormone mrna, complete cds. ACCESSION EU VERSION EU GI: KEYWORDS. SOURCE Epinephelus lanceolatus (giant grouper) ORGANISM Epinephelus lanceolatus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei; eoteleostei; Acanthomorpha; Acanthopterygii; Percomorpha; Perciformes; Percoidei; Serranidae; Epinephelinae; Epinephelus. REFERENCE 1 (bases 1 to 938) AUTHORS Dong,H., Zeng,L., Duan,D., Zhang,H., Wang,Y., Li,W. and Lin,H. TITLE Growth hormone and two forms of insulin-like growth factors I in the giant grouper (Epinephelus lanceolatus): molecular cloning and characterization of tissue distribution JOURNAL Fish Physiol. Biochem /s (2008) In press REFERENCE 2 (bases 1 to 938) AUTHORS Dong,H.Y., Zeng,L.X., Duan,D., Li,W.S. and Lin,H.R. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (14-NOV-2007) Life Sciences, Aquatic Economic Animals and Guangdong, 135 West Xingang Road, Guangzhou, Guangdong , China FEATURES Location/Qualifiers source /organism="epinephelus lanceolatus" /mol_type="mrna" /db_xref="taxon:310571" CDS /codon_start=1 /product="growth hormone" /protein_id="abz " /db_xref="gi: " /translation="mdrvvlllsvvslgvssqpitdgqrlfsiavsrvqhlhllaqrl FSDFESTLQTEEQRQLNKIFLQDFCNSDYIISPIDKHETQRSSVLKLLSISYRLVESW EFPSRSLSGGSAPRNQISPKLSELKTGILLLIRANQDGAELFPDSSALQLAPYGNYYQ SLGADESLRRTYELLACFKKDMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTL" ORIGIN 1 agaatgctct gagcagctga actcagacct gatccaccag agccagacct gatcccagac 61 cagccatgga ccgagtcgtc ctcctgctgt cagtagtgtc tctgggtgtt tcctctcagc 121 caatcacaga cggccagcgt ctgttctcca tcgccgtcag cagagttcaa catctccacc 181 tgcttgctca gagactcttc tccgactttg agagcactct gcagacggag gagcagcgac 241 agctcaacaa gatcttcctg caggacttct gtaactctga ttacatcatc agccccatcg 301 acaagcacga gacgcagcgc agctccgtgt tgaagctatt gtcgatctcc tatcggttgg 361 tggagtcctg ggagttcccc agtcggtccc tgtccggagg ttctgctccc agaaaccaga 421 tttctcccaa actgtctgaa ttgaagaccg ggatcctgct gctgatcagg gccaatcagg 481 acggagcgga gctcttccct gacagctccg ccctccagtt ggctccttat gggaactatt 541 atcagagtct gggcgccgac gagtcgctgc gacgaacgta cgaactgctg gcttgtttca 601 agaaagacat gcacaaggtg gagacctacc tgacggtggc taaatgtcga ctctctcctg 661 aggccaactg taccctgtag ccccgcctct ccagtatgaa gacacgctcc catgtggatg 721 atgtaatgct gtgtgttctg tagtcccgcc cacatgtttt ctgactctgc taattagcat 781 tagcatttgt gttagccaca gtgttagcct gtgttcagtt gtttgttgga gcaggtgtta 841 ttatgatgac agccatcaac aggaagtgat atcatactgt caccatgtgt aataaagtgt 901 gtgctgtgtt gcattcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa //

55 39 Lampiran 2. Sekuens cdna yang mengkodekan hormon pertumbuhan (GH) ikan mas berdasarkan data Genbank M27000 LOCUS CYIGH 1164 bp mrna linear VRT 08-AUG-1994 DEFINITION Cyprinus carpio growth hormone (GH) mrna, complete cds. ACCESSION M27000 VERSION M GI: KEYWORDS growth hormone. SOURCE Cyprinus carpio (common carp) ORGANISM Cyprinus carpio Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Ostariophysi; Cypriniformes; Cyprinidae; Cyprinus. REFERENCE 1 (bases 1 to 1164) AUTHORS Koren,Y., Sarid,S., Ber,R. and Daniel,V. TITLE Carp growth hormone: molecular cloning and sequencing of cdna JOURNAL Gene 77 (2), (1989) PUBMED COMMENT On Aug 9, 1994 this sequence version replaced gi: Original source text: Cyprinus carpio pituitary gland cdna to mrna. FEATURES Location/Qualifiers source /organism="cyprinus carpio" /mol_type="mrna" /db_xref="taxon:7962" /tissue_type="pituitary gland" gene /gene="gh" CDS /gene="gh" /codon_start=1 /product="growth hormone" /protein_id="aaa " /db_xref="gi:529028" /translation="marvlvllsvvlvsllvnqgrasdnqrlfnnavirvqhlhqlaa KMINDFEDSLLPEERRQLSKIFPLSFCNSDYIEAPAGKDETQKSSMLKLLRISFHLIE SWEFPSQSLSGTVSNSLTVGNPNQLTEKLADLKMGISVLIQACLDGQPNMDDNDSLPL PFEDFYLTMGENNLRESFRLLACFKKDMHKVETYLRVANCRRSLDSNCTL" sig_peptide /gene="gh" mat_peptide /gene="gh" /product="growth hormone" polya_signal /gene="gh" polya_site 1164 /gene="gh" ORIGIN 1 aactaagcct gcaagagttt gtctaccctg agcgaaatgg ctagagtatt agtgctattg 61 tcggtggtgc tggttagttt gttggtaaac caggggagag catcagacaa ccagcggctc 121 ttcaataatg cagtcattcg tgtacaacac ctgcaccagc tggctgcaaa aatgattaac 181 gactttgagg acagcctgtt gcctgaggaa cgcagacagc tgagtaaaat cttccctctg 241 tctttctgca attctgacta cattgaggcg cctgctggaa aagatgaaac acagaagagc 301 tctatgctga agcttcttcg catctctttt cacctcattg agtcctggga gttcccaagc 361 cagtccctga gcggaaccgt ctcaaacagc ctgaccgtag ggaaccccaa ccagctcact 421 gagaagctgg ccgacttgaa aatgggcatc agtgtgctca tccaggcatg tctcgatggt 481 caaccaaaca tggatgataa cgactccttg ccgctgcctt ttgaggactt ctacttgacc

56 40 // 541 atgggggaga acaacctcag agagagcttt cgtctgctgg cttgcttcaa gaaggacatg 601 cacaaagtcg agacctactt gagggttgca aattgcagga gatccctgga ttccaactgc 661 accctgtaga tggcaccggt gtattgttag tcaatgcctg taacacattt gtgctttgct 721 gcaaatataa gaccagttta cagtctggtc ttatatgtgc aggaaatgtc aaccagcatg 781 cctaggtctg tgttttcttt tttccctccc atatttaaac attacctatt gtatttattc 841 ttctcatttg ggagtgtctc ataaatttaa aaccgttcct ttaaaacgta agggatggat 901 ctggaacatt tcacagtggt gtctaagcaa tttatggcaa tattttaaaa tgtggccaaa 961 ttgaccttag tcaaagtgct gacaatatgt taaaaaaagg gctaaagatc agtgttacgt 1021 ggaaattgta atttaaatcg gatgtgttca ctcttcggtg tatgcatgtt aacatttgtc 1081 tcatatatta tgctcttatt attaactcat cgtatcctct tcaagcgctg tgtctttctc 1141 tattaaagtt ttaaattgca tcca

57 41 Lampiran 3. Sekuens nukleotida dan hasil prediksi asam amino GH ikan kerapu kertang menggunakan program GENETYX versi 7 [GENETYX : Translation of Nucleotides into Amino Acids for Thesis] Date : Filename : Epinephelus lanceolatus growth hormone mrna Sequence Size : 938 Sequence Position: Translation Position: 1-938; Genetic Code : The Standard Code agaatgctctgagcagctgaactcagacctgatccaccagagccagacctgatcccagac cagccatggaccgagtcgtcctcctgctgtcagtagtgtctctgggtgtttcctctcagc M D R V V L L L S V V S L G V S S Q P CAATCACAGACGGCCAGCGTCTGTTCTCCATCGCCGTCAGCAGAGTTCAACATCTCCACC I T D G Q R L F S I A V S R V Q H L H L TGCTTGCTCAGAGACTCTTCTCCGACTTTGAGAGCACTCTGCAGACGGAGGAGCAGCGAC L A Q R L F S D F E S T L Q T E E Q R Q AGCTCAACAAGATCTTCCTGCAGGACTTCTGTAACTCTGATTACATCATCAGCCCCATCG L N K I F L Q D F C N S D Y I I S P I D ACAAGCACGAGACGCAGCGCAGCTCCGTGTTGAAGCTATTGTCGATCTCCTATCGGTTGG K H E T Q R S S V L K L L S I S Y R L V TGGAGTCCTGGGAGTTCCCCAGTCGGTCCCTGTCCGGAGGTTCTGCTCCCAGAAACCAGA E S W E F P S R S L S G G S A P R N Q I TTTCTCCCAAACTGTCTGAATTGAAGACCGGGATCCTGCTGCTGATCAGGGCCAATCAGG S P K L S E L K T G I L L L I R A N Q D ACGGAGCGGAGCTCTTCCCTGACAGCTCCGCCCTCCAGTTGGCTCCTTATGGGAACTATT G A E L F P D S S A L Q L A P Y G N Y Y ATCAGAGTCTGGGCGCCGACGAGTCGCTGCGACGAACGTACGAACTGCTGGCTTGTTTCA Q S L G A D E S L R R T Y E L L A C F K AGAAAGACATGCACAAGGTGGAGACCTACCTGACGGTGGCTAAATGTCGACTCTCTCCTG K D M H K V E T Y L T V A K C R L S P E AGGCCAACTGTACCCTGTAGccccgcctctccagtatgaagacacgctcccatgtggatg A N C T L *

58 atgtaatgctgtgtgttctgtagtcccgcccacatgttttctgactctgctaattagcat tagcatttgtgttagccacagtgttagcctgtgttcagttgtttgttggagcaggtgtta ttatgatgacagccatcaacaggaagtgatatcatactgtcaccatgtgtaataaagtgt gtgctgtgttgcattcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Keterangan: Sekuens nukleotida yang ditulis dengan huruf kecil pada nukletida 1-65 merupakan bagian terminal 5 yang tidak terkodekan (5 -UTR, UnTranslated Region) dan pada nukleo tida merupakan bagian terminal 3 yang tidak terkodekan (3 -UTR, UnTranslated Region). CDS Epinephelus lanceolatus growth hormone berukuran sekitar 615 bp dimulai dari nukleotida ke 66 sampai 680 dengan start codon ATG dan stop codon TAG. Penanda poliadenilasi (polyadenylation signal, aataaa) terletak pada nukleotida digaris bawahi. dan ujung poliadenilasi (polyadenylation tail) pada nukleotida Sekuens nukleotida yang ditulis dengan huruf tebal pada nukletida merupakan signal peptide. Nukleotida yang di ditulis huruf besar miring merupakan sekuens untuk pembuatan primer.

59 43 Lampiran 4. Sekuens nukleotida dan hasil prediksi asam amino GH ikan mas menggunakan program GENETYX versi 7 [GENETYX : Translation of Nucleotides into Amino Acids for Thesis] Date : Filename : GH Full Mas Sequence Size : 1164 Sequence Position: Translation Position: ; Genetic Code : The Standard Code aactaagcctgcaagagtttgtctaccctgagcgaaatggctagagtattagtgctattg M A R V L V L L TCGGTGGTGCTGGTTAGTTTGTTGGTAAACCAGGGGAGAGCATCAGACAACCAGCGGCTC S V V L V S L L V N Q G R A S D N Q R L TTCAATAATGCAGTCATTCGTGTACAACACCTGCACCAGCTGGCTGCAAAAATGATTAAC F N N A V I R V Q H L H Q L A A K M I N GACTTTGAGGACAGCCTGTTGCCTGAGGAACGCAGACAGCTGAGTAAAATCTTCCCTCTG D F E D S L L P E E R R Q L S K I F P L TCTTTCTGCAATTCTGACTACATTGAGGCGCCTGCTGGAAAAGATGAAACACAGAAGAGC S F C N S D Y I E A P A G K D E T Q K S TCTATGCTGAAGCTTCTTCGCATCTCTTTTCACCTCATTGAGTCCTGGGAGTTCCCAAGC S M L K L L R I S F H L I E S W E F P S CAGTCCCTGAGCGGAACCGTCTCAAACAGCCTGACCGTAGGGAACCCCAACCAGCTCACT Q S L S G T V S N S L T V G N P N Q L T GAGAAGCTGGCCGACTTGAAAATGGGCATCAGTGTGCTCATCCAGGCATGTCTCGATGGT E K L A D L K M G I S V L I Q A C L D G CAACCAAACATGGATGATAACGACTCCTTGCCGCTGCCTTTTGAGGACTTCTACTTGACC Q P N M D D N D S L P L P F E D F Y L T ATGGGGGAGAACAACCTCAGAGAGAGCTTTCGTCTGCTGGCTTGCTTCAAGAAGGACATG M G E N N L R E S F R L L A C F K K D M CACAAAGTCGAGACCTACTTGAGGGTTGCAAATTGCAGGAGATCCCTGGATTCCAACTGC H K V E T Y L R V A N C R R S L D S N C ACCCTGTAGatggcaccggtgtattgttagtcaatgcctgtaacacatttgtgctttgct T L *

60 gcaaatataagaccagtttacagtctggtcttatatgtgcaggaaatgtcaaccagcatg cctaggtctgtgttttcttttttccctcccatatttaaacattacctattgtatttattc ttctcatttgggagtgtctcataaatttaaaaccgttcctttaaaacgtaagggatggat ctggaacatttcacagtggtgtctaagcaatttatggcaatattttaaaatgtggccaaa ttgaccttagtcaaagtgctgacaatatgttaaaaaaagggctaaagatcagtgttacgt ggaaattgtaatttaaatcggatgtgttcactcttcggtgtatgcatgttaacatttgtc tcatatattatgctcttattattaactcatcgtatcctcttcaagcgctgtgtctttctc tattaaagttttaaattgcatcca Keterangan: Sekuens nukleotida yang ditulis dengan huruf kecil pada nukletida 1-36 merupakan bagian terminal 5 yang tidak terkodekan (5 -UTR, UnTranslated Region) dan pada nukleotida merupakan bagian terminal 3 yang tidak terkodekan (3 -UTR, UnTranslated Region). CDS Cyprinus carpio growth hormone berukuran sekitar 633 bp dimulai dari nukleotida ke 37 sampai 669 dengan start codon ATG dan stop codon TAG. Sekuens nukleotida yang ditulis dengan huruf tebal pada nukletida merupakan signal peptida. Nukleotida yang di ditulis huruf besar miring merupakan sekuens untuk pembuatan primer.

61 45 Lampiran 5. Sekuens nukleotida dan hasil prediksi asam amino GH ikan gurame menggunakan program GENETYX versi 7 [GENETYX : Translation of Nucleotides into Amino Acids for Thesis] Date : Filename : Gurame full Sequence Size : 843 Sequence Position: Translation Position: 1-843; Genetic Code : The Standard Code gatttcacaaccgctatggacaaagttgtgttcctgctgtctgtcctgtctgtgggcgtc M D K V V F L L S V L S V G V TCCTCTCAGCCAATCACAGACAGCCAGCGTCTCTTCTCCATCGCCGTGAGCAGAGTCCAA S S Q P I T D S Q R L F S I A V S R V Q CACCTGCACCTGCTCGCCCAGAGACTCTTCTCCGACTTCGAGAGCTCTTTGCAGACTGAG H L H L L A Q R L F S D F E S S L Q T E GAGCAGCGTCAACTCAACAAAATCTTCCTGCAGGATTTTTGTAACTCAGATTACATCATC E Q R Q L N K I F L Q D F C N S D Y I I AGCCCTATCGACAAGCACGAGACCCAGCGCAGCTCTGTGCTGAAGCTGTTATCGATCTCT S P I D K H E T Q R S S V L K L L S I S TATCGGCTGATCGAGTCCTGGGAGTTCCCCAGCCGGTCTCTGTATGGAGGTTCTGCTCAA Y R L I E S W E F P S R S L Y G G S A Q AGATACCAGATTTCTCCCAAACTGTCGGAGCTGATGCGAGGAATCCAGCTGCTGATCAAG R Y Q I S P K L S E L M R G I Q L L I K GCCAATCAGGATGGAGCAGAGATGTTCTCTGACGGCGTGGTTCCGCAGCTCGCTCCGTAC A N Q D G A E M F S D G V V P Q L A P Y GGAAACTACTACCAGAGTCTGGGAGATGACGAGTCGCTGAGACGCAGCTATGAACTGCTG G N Y Y Q S L G D D E S L R R S Y E L L GCCTGCTTCAAAAAGGACATGCACAAGGTGGAGACGTACCTGACTGTGGCTAAATGCCGA A C F K K D M H K V E T Y L T V A K C R CTCTCTCCAGAAGCTAACTGCACTCTGTAGcccccccatctggacaatgacatcatcgtg L S P E A N C T L * tttgttctatagccctgttctttactctgtgaactagcattagcaatagcattagcctct

62 ttctggtggttttttgttgcaggttgaacacaaagtgatgtcacactgtcagtacatgaa ataaagtttgtttgattctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaa 850 Keterangan: Sekuens nukleotida yang ditulis dengan huruf kecil pada nukletida 1-15 merupakan bagian terminal 5 yang tidak terkodekan (5 -UTR, UnTranslated Region) dan pada nukleotida merupakan bagian terminal 3 yang tidak terkodekan (3 -UTR, UnTranslated Region). CDS Osphronemus gouramy growth hormone berukuran sekitar 615 bp dimulai dari nukleotida ke 16 sampai 630 dengan start codon ATG dan stop codon TAG. Penanda poliadenilasi (polyadenylation signal, aataaa) terletak pada nukleotida digaris bawahi. dan ujung poliadenilasi (polyadenylation tail) pada nukleotida Sekuens nukleotida yang ditulis dengan huruf tebal pada nukletida merupakan signal peptida. Nukleotida yang di ditulis huruf besar miring merupakan sekuens untuk pembuatan primer.

63 47 Lampiran 6. Prediksi daerah signal peptida pada CDS GH ikan kerapu kertang SignalP 3.0 Server - prediction results Technical University of Denmark Using neural networks (NN) and hidden Markov models (HMM) trained on eukaryotes >Sequence SignalP-NN result: # data >Sequence length = 70 # Measure Position Value Cutoff signal peptide? max. C YES max. Y YES max. S YES mean S YES D YES # Most likely cleavage site between pos. 17 and 18: VSS-QP SignalP-HMM result:

64 48 # data >Sequence Prediction: Signal peptide Signal peptide probability: Signal anchor probability: Max cleavage site probability: between pos. 17 and 18

65 49 Lampiran 7. Prediksi daerah signal peptida pada CDS GH ikan mas SignalP 3.0 Server - prediction results Technical University of Denmark Using neural networks (NN) and hidden Markov models (HMM) trained on eukaryotes >Sequence SignalP-NN result: # data >Sequence length = 70 # Measure Position Value Cutoff signal peptide? max. C YES max. Y YES max. S YES mean S YES D YES # Most likely cleavage site between pos. 22 and 23: GRA-SD

66 50 SignalP-HMM result: # data >Sequence Prediction: Signal peptide Signal peptide probability: Signal anchor probability: Max cleavage site probability: between pos. 22 and 23

67 51 Lampiran 8. Prediksi daerah signal peptida pada CDS GH ikan gurame SignalP 3.0 Server - prediction results Technical University of Denmark Using neural networks (NN) and hidden Markov models (HMM) trained on eukaryotes >Sequence SignalP-NN result: # data >Sequence length = 70 # Measure Position Value Cutoff signal peptide? max. C YES max. Y YES max. S NO mean S YES D YES # Most likely cleavage site between pos. 17 and 18: VSS-QP

68 52 SignalP-HMM result: # data >Sequence Prediction: Signal peptide Signal peptide probability: Signal anchor probability: Max cleavage site probability: between pos. 17 and 18

69 53 Lampiran 9. Hasil sekuensing plasmid pcold/el-mgh

70 54

71 Lampiran 10. Hasil sekuensing plasmid pcold/cc-mgh 55

72 56

73 57 Lampiran 11. Alignment urutan nukleotida plasmid pcold/el-mgh hasil sekuensing dengan sekuens mgh dari data Genbank EU Mature kerapu kertang.txt sekuensing elgh8.txt 1 T A G A A G G G G T A T A C A C C A T G A A A T C A C A A A G T G C A T C A T C A T C A T C A T C A T A T C G A A G G T 60 Mature kerapu kertang.txt C A G C C A A T C A C A G A C G G C C A G C G T C T G T T C T C C 33 sekuensing elgh8.txt 61 A G G C A T A T G G A G C T C G G T A C C C T C G A G C A G C C A A T C A C A G A C G G C C A G C G T C T G T T C T C C 120 Mature kerapu kertang.txt 34 A T C G C C G T C A G C A G A G T T C A A C A T C T C C A C C T G C T T G C T C A G A G A C T C T T C T C C G A C T T T 93 sekuensing elgh8.txt 121 A T C G C C G T C A G C A G A G T T C A A C A T C T C C A C C T G C T T G C T C A G A G A C T C T T C T C C G A C T T T 180 Mature kerapu kertang.txt 94 G A G A G C A C T C T G C A G A C G G A G G A G C A G C G A C A G C T C A A C A A G A T C T T C C T G C A G G A C T T C 153 sekuensing elgh8.txt 181 G A G A G C A C T C T G C A G A C G G A G G A G C A G C G A C A G C T C A A C A A G A T C T T C C T G C A G G A C T T C 240 Mature kerapu kertang.txt 154 T G T A A C T C T G A T T A C A T C A T C A G C C C C A T C G A C A A G C A C G A G A C G C A G C G C A G C T C C G T G 213 sekuensing elgh8.txt 241 T G T A A C T C T G A T T A C A T C A T C A G C C C C A T C G A C A A G C A C G A G A C G C A G C G C A G C T C C G T G 300 Mature kerapu kertang.txt 214 T T G A A G C T A T T G T C G A T C T C C T A T C G G T T G G T G G A G T C C T G G G A G T T C C C C A G T C G G T C C 273 sekuensing elgh8.txt 301 T T G A A G C T A T T G T C G A T C T C C T A T C G G T T G G T G G A G T C C T G G G A G T T C C C C A G T C G G T C C 360 Mature kerapu kertang.txt 274 C T G T C C G G A G G T T C T G C T C C C A G A A A C C A G A T T T C T C C C A A A C T G T C T G A A T T G A A G A C C 333 sekuensing elgh8.txt 361 C T G T C C G G A G G T T C T G C T C C C A G A A A C C A G A T T T C T C C C A A A C T G T C T G A A T T G A A G A C C 420 Mature kerapu kertang.txt 334 G G G A T C C T G C T G C T G A T C A G G G C C A A T C A G G A C G G A G C G G A G C T C T T C C C T G A C A G C T C C 393 sekuensing elgh8.txt 421 G G G A T C C T G C T G C T G A T C A G G G C C A A T C A G G A C G G A G C G G A G C T C T T C C C T G A C A G C T C C 480 Mature kerapu kertang.txt 394 G C C C T C C A G T T G G C T C C T T A T G G G A A C T A T T A T C A G A G T C T G G G C G C C G A C G A G T C G C T G 453 sekuensing elgh8.txt 481 G C C C T C C A G T T G G C T C C T T A T G G G A A C T A T T A T C A G A G T C T G G G C G C C G A C G A G T C G C T G 540 Mature kerapu kertang.txt 454 C G A C G A A C G T A C G A A C T G C T G G C T T G T T T C A A G A A A G A C A T G C A C A A G G T G G A G A C C T A C 513 sekuensing elgh8.txt 541 C G A C G A T C G T A C G A A C T G C T G G C T T G T T T C A A G A A A G A C A T G C A C A A G G T G G A G A C C T A C 600 Mature kerapu kertang.txt 514 C T G A C G G T G G C T A A A T G T C G A C T C T C T C C T G A G G C C A A C T G T A C C C T G T A G sekuensing elgh8.txt 601 C T G A C G G T G G C T A A A T G T C G A C T C T C T C C T G A G G C C A A C T G T A C C C T G T A G A A G C T T G T C 660 Mature kerapu kertang.txt sekuensing elgh8.txt 661 G A C C T G C A G T C T A G A T A G G T A A T C T C T G C T T A A A A G C A C A G A A T C T A A G A T C C C T G C C A T 720 Mature kerapu kertang.txt sekuensing elgh8.txt 721 T T G G C G G G G A T T T T T T T A T T T G T T T T C A G G A A A T A A A T A A T C G A T C G C G T A A T A A A A T C T 780 Mature kerapu kertang.txt sekuensing elgh8.txt 781 A T T A T T A T T T T T G T G A A G A A T A A A T T T G G G G T G C A A T G A G A A T G C G C 827

74 58 Lampiran 12. Alignment urutan nukleotida plasmid pcold/cc-mgh hasil sekuensing dengan sekuens mgh data Genbank M Mature Mas.txt sekuensing ccgh-f (G411).txt 1 C A G G G A A T T A C A A C C A T G G A A T C A C A A A G T G C A T C A T C A T C A T C A T C A T A T C G A A G G T A G 60 Mature Mas.txt T C A G A C A A C C A G C G G C T C T T C A A T A A T G C A G T C 33 sekuensing ccgh-f (G411).txt 61 G C A T A T G G A G C T C G G T A C C C T C G A G G C T C A G A C A A C C A G C G G C T C T T C A A T A A T G C A G T C 120 Mature Mas.txt 34 A T T C G T G T A C A A C A C C T G C A C C A G C T G G C T G C A A A A A T G A T T A A C G A C T T T G A G G A C A G C 93 sekuensing ccgh-f (G411).txt 121 A T T C G T G T A C A A C A C C T G C A C C A G C T G G C T G C A A A A A T G A T T A A C G A C T T T G A G G A C A G C 180 Mature Mas.txt 94 C T G T T G C C T G A G G A A C G C A G A C A G C T G A G T A A A A T C T T C C C T C T G T C T T T C T G C A A T T C T 153 sekuensing ccgh-f (G411).txt 181 C T G T T G C C T G A G G A A C G C A G A C A G C T G A G T A A A A T C T T C C C T C T G T C T T T C T G C A A T T C T 240 Mature Mas.txt 154 G A C T A C A T T G A G G C G C C T G C T G G A A A A G A T G A A A C A C A G A A G A G C T C T A T G C T G A A G C T T 213 sekuensing ccgh-f (G411).txt 241 G A C T A C A T T G A G G C G C C T G C T G G A A A A G A T G A A A C A C A G A A G A G C T C T A T G C T G A A G C T T 300 Mature Mas.txt 214 C T T C G C A T C T C T T T T C A C C T C A T T G A G T C C T G G G A G T T C C C A A G C C A G T C C C T G A G C G G A 273 sekuensing ccgh-f (G411).txt 301 C T T C G C A T C T C T T T T C A C C T C A T T G A G T C C T G G G A G T T C C C A A G C C A G T C C C T G A G C G G A 360 Mature Mas.txt 274 A C C G T C T C A A A C A G C C T G A C C G T A G G G A A C C C C A A C C A G C T C A C T G A G A A G C T G G C C G A C 333 sekuensing ccgh-f (G411).txt 361 A C C G T C T C A A A C A G C C T G A C C G T A G G G A A C C C C A A C C A G C T C A C T G A G A A G C T G G C C G A C 420 Mature Mas.txt 334 T T G A A A A T G G G C A T C A G T G T G C T C A T C C A G G C A T G T C T C G A T G G T C A A C C A A A C A T G G A T 393 sekuensing ccgh-f (G411).txt 421 T T G A A A A T G G G C A T C A G T G T G C T C A T C C A G G C A T G T C T C G A T G G T C A A C C A A A C A T G G A T 480 Mature Mas.txt 394 G A T A A C G A C T C C T T G C C G C T G C C T T T T G A G G A C T T C T A C T T G A C C A T G G G G G A G A A C A A C 453 sekuensing ccgh-f (G411).txt 481 G A T A A T G A C T C C T T G C C G C T G C C T T T T G A G G A C T T C T A C T T G A C C A T G G G G G A G A A C A A C 540 Mature Mas.txt 454 C T C A G A G A G A G C T T T C G T C T G C T G G C T T G C T T C A A G A A G G A C A T G C A C A A A G T C G A G A C C 513 sekuensing ccgh-f (G411).txt 541 C T C A G A G A G A G C T T T C G T C T G C T G G C T T G C T T C A A G A A G G A C A T G C A C A A A G T C G A G A C C 600 Mature Mas.txt 514 T A C T T G A G G G T T G C A A A T T G C A G G A G A T C C C T G G A T T C C A A C T G C A C C C T G sekuensing ccgh-f (G411).txt 601 T A C T T G A G G G T T G C A A A T T G C A G G A G A T C C C T G G A T T C C A A C T G C A C C C T G A G G T C G A C C 660 Mature Mas.txt sekuensing ccgh-f (G411).txt 661 T G C A G T C T A G A T A G G T A A T C T C T G C T T A A A A G C A C A G A A T C T A A G A T C C C T G C C A T T T G G 720 Mature Mas.txt sekuensing ccgh-f (G411).txt 721 C G G G G A T T T T T T T A T T T G T T T T C A G G A A A T A A A T A A T C G A T C G C G T A A T A A A A T C T A T T A 780 Mature Mas.txt sekuensing ccgh-f (G411).txt 781 T T A T T T T T G T G A A G A A T A A A T T T G G G G T G C A A T G A G A A T G C G C A G G C C C C T T T T C G T C T T 840 Mature Mas.txt sekuensing ccgh-f (G411).txt 841 C G C G C G T T T C 850

75 59 Lampiran 13. Data uji bioaktivitas protein rgh dengan penyuntikan Bobot rata-rata ikan nila per minggu (gram) Perlakuan Pekan ke- I II III IV V VI VII VIII PBS pcold rgh Gurame rgh Mas rgh Kertang Pertambahan bobot ikan nila selama perlakuan Perlakuan Bobot awal Bobot minggu ke-8 Pertambahan bobot Rataan SD Rataan SD Rataan SD persentase PBS kontrol pcold kontrol rgh Gurame rgh Mas rgh Kertang Kelulushidupan (SR) ikan nila pada setiap perlakuan selama 2 bulan pemeliharaan Perlakuan Ulangan Jumlah awal (e) Jumlah akhir (e) Kelulushidupan (%) PBS kontrol Rataan STDV pcold kontrol Rataan STDV rgh Gurame Rataan STDV rgh Mas Rataan STDV rgh Kertang Rataan STDV

76 60 Lampiran 14. Hasil analisis sidik ragam pertumbuhan ikan nila dengan lama pemeliharaan selama 2 bulan. Oneway Pertumbuhan Perlakuan N Mean Std. Deviation Descriptives Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum PBS (kontrol) pcold1 (kontrol) Og-mGH Cc-mGH El-mGH Total Pertumbuhan ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups Within Groups Total Homogeneous Subsets Pertumbuhan Duncan a Subset for alpha = 0.1 Perlakuan N PBS (kontrol) pcold1 (kontrol) Cc-mGH Og-mGH El-mGH Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size =

77 61 Lampiran 15. Hasil analisis sidik ragam tingkat kelulus hidupan (SR) ikan nila diakhir pemeliharaan. Oneway Kelulushidupan (SR) Descriptives Perlakuan N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound PBS (kontrol) pcold 1 (kontrol) Og-mGH Cc-mGH El-mGH Total ANOVA Kelulushidupan (SR) Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups Within Groups Total

78 62 Lampiran 16. Dokumentasi penelitian Mesin Thermocycle (PCR) Vortex Sentrifuse Micropipette dan Tip Laminar Air Flow Ultraviolet Illuminator Timbangan Microwave Bak Elektroforesis Dry ThermoUnit Alat Sonikator Bak Elektroforesis SDS-DAGE Erlenmeyer Kultur Bakteri Akuarium Pemeliharaan Peremajaan Bakteri Kultur Bakteri Penyuntikan rgh