Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Menggunakan Metode Heat Shock ISSN: Maya Ekaningtias

Transkripsi

1 Transformasi Plasmid Dengan Sel Bakteri Escherichia coli Maya Ekaningtias Abstrak: Transformasi merupakan proses memperkenalkan DNA asing ke dalam sel-sel hidup. Umumnya, transformasi bertujuan mengekspresikan suatu gen tertentu berupa fragmen DNA di dalam sel inang. Agar gen tersebut dapat masuk ke dalam sel inang, gen tersebut harus dibuat menjadi DNA plasmid dengan menyisipkannya pada suatu DNA vektor. Salah satu metode transformasi yaitu dengan heat shock (kejutan panas). Tujuan penelitian ini adalah mempelajari proses transformasi plasmid ke dalam bakteri Escherichia coli menggunakan metode heat shock. Bakteri E. coli strain DH5α dibuat menjadi sel kompeten dengan ditumbuhkan pada 5 ml medium LB, suhu 37 o C selama 24 jam pada shaker. Setelah diperoleh pellet yang dibutuhkan kemudian ditambahkan TSS 2x sebanyak 1 ml, kemudian disuspensikan. Selanjutnya, suspensi bakteri E. coli dicampur dengan DNA plasmid (puc19) kemudian ditransformasi menggunakan metode heat shock pada suhu 42 o C selama 90 detik. Setelah itu, inokulasi 100 µl campuran tersebut pada media seleksi (medium LB yang diberi antibiotik ampisilin), Diinkubasi semalam pada suhu 37 o C dan keesokan harinya dilakukan pengecekan hasil transformasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi plasmid DNA ke dalam E. coli menggunakan TSS dan metode heat shock berhasil dilakukan. Hal ini diindikasikan dengan adanya E. coli yang mampu tumbuh pada medium LB yang mengandung antibiotik ampisilin. Dengan adanya ampisilin sebagai marka seleksi, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Kata Kunci: Transformasi, puc19, E. coli strain DH5α, Heat shock. PENDAHULUAN Transformasi merupakan proses memasukkan DNA plasmid hasil konstruksi yang telah mengandung materi asing ke dalam sel target. Dalam proses ini, untuk sementara dinding sel dibuat permeabel dan dapat dilalui oleh molekul DNA kecil. Transformasi dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain dengan heat shock dan dengan elektroporasi. Pada metode heat shock, campuran sel dan DNA plasmid rekombinan didinginkan dalam waktu yang lama, kemudian dipanaskan dengan segera pada suhu sekitar 42 o C. Adapun metode elektroporasi menggunakan suatu alat yang dialiri arus listrik. Transformasi genetik merupakan salah satu metode yang dapat dimanfaatkan untuk mempelajari regulasi gen, identifikasi fungsi gen, pengujian metabolisme, serta mempelajari fisiologi dan perkembangan sebagai akibat dari ekspresi gen tersebut. Agar gen yang berupa fragmen DNA tersebut dapat masuk, diperlukan suatu vektor DNA untuk 7 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 5 Nomor 2 November 2016

2 menyisipkan gen, misalnya vektor plasmid (Brown, 2006). Vektor adalah sekuen nukleotida DNA yang berperan sebagai perantara yang akan membawa fragmen DNA masuk ke dalam sel host dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut (Lodge et.al., 2007; Wiley et.al., 2011). Beberapa jenis vektor yang dapat digunakan antara lain plasmid, phage, cosmid, Yeast Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), dan sebagainya. Karena perannya yang sangat penting dalam transformasi, vektor memiliki beberapa persyaratan, antara lain: memiliki titik origin of replication (ORI) sebagai titik awal replikasi, sehingga vektor dapat bereplikasi sendiri; mengandung gen resistensi antibiotik tertentu sehingga memudahkan proses seleksi; memiliki situs pengenalan endonuklease restriksi atau multicloning site (MCS) yang dapat dipotong dengan enzim restriksi tertentu sebagai tempat penyisipan informasi genetik (Willey et.al., 2011). Plasmid merupakan DNA sirkular untai ganda ekstrakromosomal pada bakteri dengan panjang kurang dari 20 kb yang dapat bereplikasi sendiri, sehingga memungkinkan terdapatnya banyak kopi dalam satu sel (Willey et.al., 2011). Sebagian besar plasmid dalam sel tersusun dalam struktur molekul yang sangat berpilin (supercoiled). Supercoiling ini terjadi karena sebagian heliks ganda DNA plasmid terbuka oleh kerja enzim topoisomerase selama replikasi. Bentuk berpilin ini hanya dapat dipertahankan jika kedua untai polinukleotida dalam keadaan utuh, sehingga disebut DNA sirkular yang tertutup secara kovalen (covalently-closedcircular DNA). Jika salah satu untai polinukleotida terputus, maka heliks ganda akan berelaksasi kembali ke keadaan normalnya, ke bentuk alternatif plasmid yang disebut sirkular terbuka (open circular) (Hogg, 2005). Plasmid hampir selalu membawa gen tertentu (satu atau lebih gen) dan umumnya gen tersebut mengkode sifat-sifat penting yang ditunjukkan oleh bakteri asal. Plasmid membawa tipe gen yang sangat bervariasi fungsinya, seperti resistensi antibiotik, resistensi logam berat, sensitif terhadap mutagen, sensitif atau resistensi bakteriofag, produksi enzim restriksi, produksi asam amino, produksi toksin, penentu virulensi, katabolisme molekul organik kompleks, kemampuan pembentukan hubungan simbiosis, dan transfer DNA antar spesies (Hogg, 2005; Brown, 2006). Untuk mengetahui keberhasilan transformasi dengan penggunaan vektor plasmid, plasmid dilengkapi dengan gen penanda molekular (marker gene) tertentu saat konstruksinya. Penanda molekular 8 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 5 Nomor 2 November 2016

3 menggunakan gen yang mudah dianalisis ekspresinya. Dalam skala laboratorium, penanda resistensi antibiotik sering digunakan sebagai suatu selectable marker (Brown, 2006; Harisha, 2007). Selain menggunakan antibiotik, penanda molekuler lain yang biasa digunakan adalah gen lac Z. Gen lac Z adalah gen yang mengkode enzim β-galaktosidase yang menghidrolisis senyawa x-gal dengan membentuk warna biru. Bila gen lac Z disisipi oleh gen lain, maka gen lacz akan rusak sehingga tidak lagi menghasilkan enzim β- galaktosidase dan tidak dapat menghidrolisis senyawa 5-bromo-4chloro-3indolyl-β-Dgalactosidase (x-gal). Dalam hal ini, gen lacz merupakan lokasi untuk menyisipkan gen yang akan ditransfer, atau sering disebut sebagai multiple cloning site (MCS). Bakteri yang telah berhasil ditransfer dengan plasmid (gen lacznya telah tersisipi) akan membentuk koloni warna putih. Sebaliknya, bila gen lacznya belum tersisipi, maka koloninya akan berwarna biru. Koloni yang berwarna putih adalah koloni bakteri transforman, sedangkan koloni berwarna biru bukan bakteri transforman atau tidak bertransformasi. Seleksi dengan metode ini dikenal dengan nama blue white colony selection (Sun et al., 2006; Harisha, 2007). Berdasarkan hal di atas, maka tujuan penelitian ini adalah mempelajari proses transformasi plasmid ke dalam bakteri Escherichia coli menggunakan metode heat shock. METODE Bakteri Escherichia coli (E. coli) strain DH5α dibuat menjadi sel kompeten dengan ditumbuhkan pada 5 ml medium LB, suhu 37 o C selama 24 jam pada shaker. Selanjutnya sebanyak 500 µl bakteri tersebut dikultur kembali pada 10 ml medium LB, suhu 37 o C selama 2-3 jam pada shaker hingga mencapai OD 0,5-0,6. Bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm, suhu 4 o C selama 10 menit. Cairan dibuang dan pellet yang tersisa ditambahkan 1 ml 2 x TSS lalu disuspensikan. Pengambilan sebanyak 100 µl bakteri dan ditambahkan DNA plasmid (puc19) 2 3 µl lalu dicampur dengan cara suspensi. Selanjutnya, diinkubasi ke dalam es dengan suhu sekitar 4 o C selama 45 menit. Dilakukan heat shock pada suhu 42 o C selama 90 detik. Ditambahkan TSS 1x yang dingin sebanyak 500 µl. Inkubasi pada suhu 37 o C selama 1 jam pada shaker. Inokulasi 100 µl pada media seleksi (LB medium yang diberi antibiotik ampicilin), diinkubasi semalam pada suhu 37 o C dan keesokan harinya dilakukan pengecekan hasil transformasi. 9 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 5 Nomor 2 November 2016

4 HASIL DAN PEMBAHASAN Transformasi merupakan salah satu langkah dalam teknologi DNA rekombinan, yaitu rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom. Teknik DNA rekombinan meliputi isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup. Pada dasarnya transformasi memanfaatkan kemampuan bakteri yang mampu mengambil DNA asing dari lingkungan di sekelilingnya. Dalam transformasi gen ke dalam sel bakteri, perlu memperhatikan beberapa faktor, yaitu persiapan sel kompeten, pemilihan vektor plasmid, metode transformasi yang digunakan, serta seleksi koloni bakteri yang berhasil ditransformasi. Pada penelitian ini sel kompeten yang digunakan adalah bakteri E. coli DH5α yang merupakan bakteri yang sering digunakan dalam proses transformasi. Pemilihan E. coli DH5α sebagai sel kompeten mempertimbangkan beberapa karakter yang dapat meningkatkan efisiensi transformasi. Sedangkan vektor yang digunakan adalah puc19. Plasmid ini mempunyai ukuran genom sebesar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar dan mempunyai situs pemotongan dengan enzim restriksi. Selain itu, plasmid puc19 mempunyai gen penanda, yaitu satu gen ampr (gen resistensi ampisilin), dan sebuah fragmen N-terminal gen β-galaktosidase (lac Z) dari E. coli. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam, sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan puc19 menjadi resisten terhadap ampisilin. Pemilihan vektor yang akan digunakan dalam transformasi perlu memperhatikan karakter vektor dengan jelas, terutama sistem ekspresi dan jenis gen ketahanan terhadap antibiotik yang dimilikinya sehingga akan memudahkan dalam proses seleksi transforman. Hasil penelitian menunjukkan, bahwa proses transformasi yang dilakukan berhasil memperkenalkan DNA asing dalam bentuk plasmid puc19 ke dalam sel inang, yaitu E.coli DH5α. Hal ini dapat dilihat dari terbentuknya koloni bakteri pada medium seleksi menggunakan ampisilin, seperti yang terlihat pada gambar dibawah. Bakteri yang tidak tersisipi oleh plasmid puc19 akan mati dengan adanya antibiotik yang digunakan dalam medium seleksi, sedangkan bakteri yang berhasil ditransformasi dapat bertahan hidup dalam medium tersebut yang disebabkan adanya gen ampr pada plasmid puc19 yang terekspresi pada bakteri transforman. 10 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 5 Nomor 2 November 2016

5 Koloni bakteri yang terbentuk Gambar 1. Hasil seleksi transforman pada medium seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin. Proses transformasi diawali dengan pembuatan sel kompeten. Sel Kompeten merupakan sel bakteri yang telah mengalami perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya, sehingga bakteri tersebut dapat menyerap DNA asing dari luar sel. Tidak semua sel secara alami memiliki kemampuan untuk menyerap DNA asing. Setiap sel memiliki efisiensi yang berbeda dalam menyerap molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat menyerap DNA secara efisien adalah Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong tidak efisien dalam menyerap DNA adalah Escherichia coli. Sel ini memiliki kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah (Tsen et al., 2002). Kemampuan sel dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan dengan perlakuan khusus, sehingga sel tersebut menjadi kompeten. Sel kompeten adalah sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia. Proses pembuatan sel kompeten dalam penelitian ini menggunakan larutan TSS yang mengandung ion dari MgCl. Ion tersebut akan menetralisir aksi tolak-menolak antara muatan negatif dan bagian kepala fosfolipid dengan muatan negatif gugus fosfat DNA (Szostkova and Horakova, 1998). Zhang et al. (2007) melakukan pengujian pengaruh Mg 2+ terhadap membran lipid bilayer buatan, dan menemukan bahwa Mg 2+ menurunkan kerapatan membran. Berdasarkan kedua hasil tersebut dapat diketahui bahwa ion-ion dari MgCl2 berperan dalam mengganggu kestabilan membran sel E.coli. selain itu TSS dingin dapat menyebabkan terganggunya struktur membran sel sehingga membentuk pori-pori yang memungkinkan membran sel dapat dimasuki oleh DNA sirkuler. 11 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 5 Nomor 2 November 2016

6 Selanjutnya, sel E. coli yang telah kompeten diberi perlakuan kejut panas (heat shock) untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Proses ini dilakukan dengan memindahkan secara cepat sel yang tadinya diinkubasi dalam es ke dalam suhu hangat ±42 C selama 90 detik, jika terlalu lama menyebabkan kerusakan membran sel sehingga bakteri akan mati. Proses ini harus dilakukan secara cepat dan tepat waktu sehingga sel benar-benar dalam kondisi "terkejut". Brown (2006) mengatakan bahwa pemanasan yang cepat pada suhu 42 o C menimbulkan gradien panas yang menyebabkan aliran yang mengalir ke dalam sel yang memungkinkan DNA masuk ke dalam sel. KESIMPULAN Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa transformasi plasmid DNA ke dalam E. coli menggunakan TSS dan metode heat shock. berhasil dilakukan yang diindikasikan dengan adanya E. coli yang mampu tumbuh pada medium LB yang mengandung antibiotik ampisilin. DAFTAR PUSTAKA Brown, T.A Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Fifth edition. Wiley Blackwell. Harisha, S Biotechnology procedures and experiments handbook (An introduction to biotechnology). Infinity Science Press LLC. Hingham, MA. Canada. Hogg, S Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd. England. Lodge, J., P. Lund and S. Minchin Gene Cloning: Principles and Applications. Taylor & Francis Group. Birmingham. Sun, D., Y. Zhang, Y. Mei, H. Jiang, Z. Xie, H. Liu, X. Chen, and P. Shen Escherichia coli is Naturally Transformable In A Novel Transformation System. FEMS Microbiology Letters. 265 (2) : Szostkova, M. and D. Horakova The Effect of Plasmid DNA Size and other Factors on Electrotransformation of Escherichia coli JM109. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47: Tsen et al Natural Plasmid Transformation in Escherichia coli. Journal of Biomedical Science. 9: Willey, J.M., L.M. Sherwood and C.J. Woolverton Prescott s Microbiology. 8ed. McGraw-Hill. Zhang et al Effects of Mg2+ on Supported Bilayer Membrane on A Glassy Carbon Electrode During Membrane Formation. International Journal of Electrochemical Science. 2: Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 5 Nomor 2 November 2016