Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik Vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens

Transkripsi

1 Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik Vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens I. Pendahuluan Vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens adalah vaksin untuk pengendalian dan penanggulangan penyakit Newcastle Disease (ND) dan Marek s Disease (MD) yang sangat virulen pada ayam. Vaksin ini diproduksi oleh Ceva Biomune Veterinary Biologicals Co., USA, yang akan diedarkan oleh PT Ceva Animal Health Indonesia. Kandungan vaksin ini adalah virus HVT-ND (Master Seed) dan virus MD strain Rispens. Virus HVT-NDV merupakan jasad renik PRG virus Herpesvirus of Turkey (HVT) yang disisipi gen F virus ND. Virus HVT-ND juga digunakan dalam vaksin PRG Vectormune HVT-NDV yang telah terdaftar dan memperoleh Certificate of Free Sale diberbagai Negara seperti Amerika Serikat (2007), Afrika Utara (2013), Bangladesh (2012), Bolivia (2010), Brazil (2010), Ekuador (2011), Filipina (2011), Guatemala (2013), Honduras (2012), Kolombia (2010), Kostarika (2012), Kuwait (2012), Libanon (2011), Malaysia (2012), Mauritus (2011), Meksiko (2010), Maroko (2012), Mesir (2012), Panama (2012), Peru (2008), Rusia (2011), Thailand (2010), Tunisia (2012), Turki (2012), Ukraina (2012), Venezuela (2012) dan Yordania (2011). Sementara untuk vaksin PRG Vectormune HVT-NDV&Rispens telah terdaftar dan memperoleh Certificate of Free Sale di Amerika Serikat (2010), Libanon (2013), Rusia (2013), Srilanka (2013), Turki (2013), Uzbekistan (2013) danyordania (2013). Berdasarkan Peraturan Pemerintah No. 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik, dan Peraturan Menteri Lingkungan Hidup No. 25 Tahun 2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko Lingkungan Produk Rekayasa Genetik, maka Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH PRG) telah melakukan pengkajian keamanan lingkungan vaksin PRG Vectormune HVT- NDV&Rispens. Pengkajian didasarkan pada informasi genetik dan informasi keamanan lingkungan yang terdiri atas hospes alami dari tetua jasad renik PRG, sifat genetik yang direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG, kemampuan penyebaran jasad renik, dan kemungkinan menimbulkan risiko terhadap lingkungan, sebagaimana diuraikan dibawah ini.

2 II. Informasi Jasad Renik PRG II.1 Deskripsi Umum Jasad Renik PRG Jasad renik PRG yang digunakan untuk memproduksi vaksin Vectormune HVT- NDV&Rispens adalah Herpesvirus of Turkey (HVT) strain FC-126 sebagai inang yang disisipi gen F virus Newcastle Disease (ND) strain D-26 sebagai gen donor. II.2 Informasi Sifat Genetik Jasad Renik Tetua jasad renik PRG adalah virus HVT strain FC-126, tidak pathogen pada ayam bahkan dapat memberikan perlindungan terhadap penyakit MD dan ND. Sebagai donor gen F adalah virus ND strain D-26, yang termasuk dalam strain lentogenik. Gen F disisipkan di antara untranslated region UL-45 dan UL-46 virus HVT, sehingga manipulasi ini tidak menghilangkan atau menginaktivasi virus HVT. Jumlah kopi gen yang disisipkan sebanyak satu gen F (Esaki and Yasuda, 2013; Lamp 4). Gen F menyandi protein F yang merupakan glikoprotein permukaan virus ND. Fungsi protein F ini adalah bertanggungjawab pada perlekatan/fusi dengan sel hospes, sehingga protein F ini dapat menginduksi pembentukan antibodi netralisasi (Esaki and Yasuda, 2013; Lamp 4). Secara detil sekuen gen F virus ND strain D-26 ini dapat dilihat dari Gen Bank dengan nomor akses M (Lamp 5). Master seed virus rekombinan HVT-ND telah diuji stabilitas genetiknya secara in vitro pada Chicken Embryo Fibroblast (CEF) 7x pasase dan secara in vivo dengan 7x pasase balik pada ayam Specific Pathogen Free (SPF). Hal ini dapat terlihat dari data pengujian yang tercantum dalam laporan Back Passage : Genetic Stability And Safety Of Marek s Disease-Newcastle Disease, Serotype 3, Live Marek s Disease Vector (Lamp 2). II.3 Metode Konstruksi Genetik Untuk melakukan insersi elemen DNA ekstra genus ke dalam genom HVT perlu disusun plasmid insersi. Fragmen HindIII/EcoRI dari genom HVT yang terletak diantara UL45 dan UL46 diamplifikasi dengan PCR dengan penambahan tapak restriksi SfiI. Fragmen amplikon ini diklon ke dalam plasmid puc18 sehingga menjadi p45/46sfii. Fragmen gen F sebesar 1680 bp virus ND strain D-26 diisolasi dari plasmid rekombinan pxliii10h dengan menggunakan PCR (Sato et al.,1987; Lamp 9). Untuk mengekspresikan gen F digunakan promoter Pec yang diinsersikan upstream gen F.

3 Promoter Pec merupakan rekombinasi dari sekuen enhancer Cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) promoter dengan sekuen inti chicken beta-actin promoter. Konstruksi promoter Pec ini ditambah tapak restriksi BglI diujung 5 dan XbaI diujung 3. Sekuen polya SV40 diisolasi dari plasmid pbk-cmv dan ditambah dengan tapak restriksi KpnI di ujung 5 dan SfiI di ujung 3. Konstruksi plasmid insersi disusun dengan menyisipkan promoter Pec, fragmen gen F dan fragmen sekuen polya ke dalam plasmid p45/46sfi sehingga menjadi plasmid p45/46-pecf. Rekombinan virus HVT-ND diperoleh melalui ko-transfeksi antara virus HVT dengan plasmid p45/46-pecf ke dalam CEF. II.4 Karakter Modifikasi Genetik HVT-ND rekombinan adalah virus Herpesvirus of Turkey (HVT) strain FC-126 yang disisipi gen F virus Newcastle Disease (ND) strain D-26. Modifikasi genetik yang berupa penyisipan gen F virus ND ke genom HVT tidak mempengaruhi virulensi virus tetuanya (HVT) bahkan penyisipan gen F tersebut akan mengekspresi protein F yang berfungsi untuk memproteksi terhadap infeksi ND. Rekombinan HVT-ND bersifat stabil yang ditunjukkan dengan uji Southern blot, Western blot dan Black Plaque Assay (BPA) setelah pasase secara in vitro dan in vivo 7X. II.5 Kemungkinan terjadinya gen yang disisipkan pada jasad renik PRG untuk vaksin hewan dipindahkan ke organisme lain. Gen F yang disisipkan ke dalam virus rekombinan HVT-ND bersifat stabil sesuai dengan uraian pada butir II.2. Untuk mengetahui kemungkinan pemindahan gen donor (Gen F) ke organisme lain telah dilakukan analisis BLAST nukleotida dari gen F virus ND strain D-26 dengan nomor akses M Hasil analisis menunjukkan bahwa gen F tersebut tidak homolog dengan sekuen gen organisme lain, oleh karena itu pemindahan gen ke organisme lain tidak dimungkinkan. II.6 Kesimpulan Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa :

4 a. Gen interes (gen F dari virus ND) yang disisipkan dalam virus HVT dapat diekspresikan dengan baik. Ekspresi protein heterolog ini tidak merubah sifat virulensi HVT bahkan dapat memberikan perlindungan terhadap penyakit Marek dan ND. b. Virus rekombinan HVT-ND mengandung satu kopi gen F yang bersifat stabil secara genotipe dan fenotipe. c. Tidak ada kemungkinan penyebaran/pemindahan Gen F yang disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT-ND) ke organisme lain. III. Informasi Keamanan Lingkungan III.1 Kemampuan Penyebaran Jasad Renik Jasad renik PRG dalam Vectormune HVT-NDV&Rispens mempunyai sifat yang sama dengan virus HVT tetuanya yaitu tidak patogen dan tidak diekskresikan dalam ekskreta hewan sehingga tidak menimbulkan kemungkinan risiko terhadap lingkungan ( Zhang Y. et al., 2013; Lamp 11). III.2 Informasi Cakupan Inang OrganismeTetua Virus PRG untuk Vaksin. Tetua virus PRG HVT-ND adalah virus HVT strain FC-126 yang termasuk dalam family Herpesviridae dan subfamily Alphaherpesvirus. Inang alami tetua HVT adalah ayam, burung puyuh dan kalkun (Abdul-Careem MF, 2008; Lamp 1). III.3 Informasi Kajian Molekuler Sifat genetik yang direkayasa adalah penyisipan gen F virus ND ke dalam virus HVT pada posisi antara UL 45 dan UL46. Penyisipan ini tidak merubah sifat virulensi HVT bahkan dapat memberikanperlindungan terhadappenyakit Marek dan ND. Virus rekombinan HVT-ND mengandung satu kopi gen F yang bersifat stabil secara genotipe dan fenotipe, serta tidak ada kemungkinan penyebaran/pemindahan gen F yang disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT-ND) ke organisme lain sehingga aman terhadap lingkungan. Modifikasi genetik dapat dianalisis dengan salah satu dari metode PCR, sekuensing dan Southern blot. Sedangkan fenotipe dari rekombinan ini dapat dicirikan dengan Western Blot atau Black Plaque Assay. III.4 Kemungkinan dampak negative jasad renik PRG vaksin terhadap lingkungan Hasil analisis BLAST nukleotida dari gen F tidak ditemukan homologi sekuen genom organisme lain, sehingga tidak ada kemungkinan transfer gen ke organisme lain (Gen Bank, 2013; Lamp 5).

5 Vaksin PRG Vectormune HVT-NDV&Rispens tidak membentuk spora karena tetua dari vaksin ini adalah termasuk dalam golongan virus. Virus PRG HVT-ND tidak diekskresikan dari hewan yang divaksin sehingga tidak berpotensi menyebar ke hewan non target sehingga tidak ada kemungkinan risiko terhadap lingkungan. Kesimpulan Vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens bersifat aman terhadap lingkungan karena tidak berisiko menyebarkan jasad renik ke lingkungan. Hal ini karena jasad renik PRG dalam sediaan vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens tidak diekskresikan dari hewan yang divaksin ke lingkungan. Berdasarkan kajian stabilitas fenotipe dan genotype jasad renik PRG dalam vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens dinyatakan stabil. TTKH PRG Bidang Keamanan Lingkungan menilai bahwa vaksin Vectormune HVT- NDV&Rispens yang diajukan adalah aman terhadap lingkungan. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan lingkungan yang diperoleh hingga saat ini, maka status aman lingkungan terhadap vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens perlu dikaji ulang. Apabila setelah ditetapkan aman lingkungan, kemudian produk tersebut terbukti menimbulkan risiko terhadap kesehatan manusia dan hewan maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan serta memusnahkan vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens yang berada di wilayah teritori Indonesia. Vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens tidak boleh digunakan sebagai vaksin ayam sampai memperoleh ijin aman lingkungan. Pustaka 1 Abdul-Careem M.F. et al Cellular and Cytokine Responses in Feathers of Chickens Vaccinated Against Marek s Disease. Veterinary Immunology and Immunopathology. Elsevier Biomune Co. 2001j. Backpassage : Genetic Stability and Safety. Dossier of Vectormune HVT ND & Rispens. 3 Biomune Co. 2001k. Backpassage (Reversion to virulence) Study : MDV Serotype 1, in SPF Chickens. Dossier of Vectormune HVT ND & Rispens

6 4 Esaki and Yasuda, 2013, Construction of Marek s Disease-Newcastle Disease Vaccine, Serotype 3, Live Marek s Disease Vector. Ceva Japan KK. 5 Gen Bank Basic Local Alignment Search Tool. National Center for Biotechnology Information. US. National Library of Medicine. 6 Palya V New Perspectives Offered by a Recombinant HVT-NDV Vaccine for the Control of Newcastle Disease in Poultry. Ceva Phylaxia Veterinary Biologicals Co. Ltd. 7 Palya V. et al Advancement in Vaccination Against Newcastle Disease: Recombinant HVT- NDV Provides High Clinical Protection and Reduces Challenge Virus Shedding with the Absence of Vaccine Reactions. Avian Diseases 56: , Rauw et al Improved Vaccination Against Newcastle Disease by an In Ovo Recombinant HVT-ND Combined with an Adjuvanted Live Vaccine at Day Old. Elsevier. 9 Sato H. et al Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of P, M and F Genes of Newcastle Disease virus Avirulent Strain D26. Virus Research Elsevier. 10 Schat K.A. & Nair V Marek s disease. In: Diseases of Poultry, Twelfth Edition, Saif Y.M. et al., eds. Blackwell Publishing, Ames Iowa, USA, Zhang Y. et al., A Safety Assessment of a HVT-vectored Newcastle Disease Vaccine in Chickens and Duck.