Pengambilan sampel tanah dari lahan tambang timah di Belitung. Isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur. Pemurnian isolat bakteri

Transkripsi

1 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Pengambilan sampel tanah dari lahan tambang timah di Belitung Isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur Pemurnian isolat bakteri Karakteriasi isolat bakteri pengoksidasi besi dan sulfur Pengamatan makro morfologi Pengamatan mikro morfologi Pewarnaan Gram Seleksi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur Berdasarkan Kemampuan Tumbuh pada Medium Yang Mengandung Fe dan S Identifikasi Isolat Bakteri Terpilih Secara Molekuler Sekuensing Analisis urutan sekuen gen 16S rrna 25

2 Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan No. Nama Alat Merk/Type Kegunaan Tempat 1. Autoklaf HL36AE (Hirayama Sterilisasi alat dan bahan Lab. Mikrobiologi Manufacturing Corp.) 2. ph meter Thermo Electron Mengukur ph medium Lab. Mikrobiologi Corporation (RL060P) 3. Shaker Inkucator Lab Companion SI-600 Menginkubasi biakan bakteri Lab. Mikrobiologi 4. Alat elektroforesis CBS Scientific EPS 300X Memisahkan DNA berdasarkan berat molekul Lab. Genetika dan Molekuler 5. Nanophotometer Implen Mengukur kemurnian DNA Lab. Riset 6. Alat PCR Thermal Cycler Techne Perbanyakan DNA tempat Lab. Riset (TC-5000) 7. Gel Doc UVP MultiDoc-It Visualisasi DNA Lab. Genetika dan Molekuler 8. Mikroskop Olympus CO11 Mengamati sel bakteri Lab. Mikrobiologi 9. UV-Vis Spektrophotometer Shimadzu UV mini 1240 Mengukur nilai OD Lab. Lingkungan 10. Sentrifuge Eppendorf Centrifuge 5415R Memisahkan supernatan Lab. Genetika dan Molekuler No. Nama Bahan Spesifikasi Kegunaan 1. Alkohol 70% Sterilisasi permukaan 2. SDS 10% Lisis sel bakteri 3. Tenderizer 30% Lisis sel bakteri 4. Alkohol absolut 99% Pencuci DNA 5. TE 1x Larutan Buffer 6. TAE 1x Larutan Buffer 7. Primer 27F dan 1540R 100 pm Templat replikasi DNA genom 8. Agarose 1,5% Running DNA saat elektroforesis 9. HCl 10 M Menurunkan ph medium 26

3 Lampiran 3. Gambar Hasil Isolasi dan Pemurnian Isolat Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur Hasil isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur Hasil pemurnian isolat bakteri pengoksidasi besi dan sulfur 27

4 Lampiran 4. Gambar Hasil Pewarnaan Gram 28

5 Lampiran 5. Komposisi dan Pembuatan Medium Pertumbuhan Bakteri a. Medium Cair dari Dunger and Fielder (1989) dengan garam ferro Komposisi : K 2HPO 4 0,05 gram (NH 4) 2SO 4 0,15 gram Ca(NO 3) 2 0,01 gram MgSO 4. 7H 2O 0,50 gram KCl 0,05 gram FeSO 4. 7H 2O 1,00 gram Akuades 1000 ml ph 3,5 Cara Pembuatan Medium : Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam akuades sebanyak 800 ml kecuali FeSO 4.7H 2O, diaduk dan disterilkan pada suhu 121 C dan didinginkan. FeSO 4. 7H 2O, dilarutkan dalam 200 ml akuades yang telah steril dan telah ditetapkan phnya, sebesar 3,5 dan dipanaskan sampai suhu 50 C, lalu didinginkan. Kedua larutan tersebut kemudian dicampur secara apsetik. Media ini kemudian dibagi ke dalam tabung yang telah steril. 29

6 b. Medium Padat 9K (Silverman and Lundgreen, 1959) Komposisi : K 2HPO 4 0,05 gram (NH 4) 2SO 4 0,15 gram Ca(NO 3) 2 0,01 gram MgSO 4. 7H2O 0,50 gram KCl 0,05 gram FeSO 4. 7H 2O 1,00 gram Agar 15 gram H 2SO 4 1 N 10 ml Akuades 1000 ml ph 3,5 Cara Pembuatan Medium : Semua bahan tersebut dicampurkan ke dalam akuades sebanyak 800 ml kecuali FeSO 4.7H2O, diaduk dan disterilkan pada suhu 121 C kemudian didinginkan. FeSO 4. 7H2O dilarutkan dalam 200 ml akuades yang telah steril dan telah ditetapkan phnya sebesar 3,5 dengan H 2SO 4 1 N, dan dipanaskan sampai suhu 50 C, lalu didinginkan. Kedua larutan tersebut kemudian dicampur secara apsetik. Media ini kemudian dibagi ke dalam cawan petri yang telah steril. 30

7 Lampiran 6. Kromatogram Urutan Basa Gen 16S rrna a. Isolat L2K5 b. Isolat L2K3 31

8 c. Isolat L1K1 32

9 Lampiran 7. Hasil Alignment Sekuen Forward dan Reverse Urutan Basa Gen 16S rrna dengan Program BioEdit a. Isolat L2K5 AATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAG TAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG ATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGA CCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGAC CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG GCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACC TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG GTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGAT GTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAG AGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGG CGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCC TTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAAC TCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGA GCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGC CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGC TACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCA TAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGT AATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAC CACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCTAAGGT GGGACAGATGA b. Isolat L2K3 GTCGAGCGAACAGATGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACG TGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATT TTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTATAGATGGACCCGCGCC GTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGA TCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAATTTGTTAGTAACTGAACAAGTCTTGACGGTAC CTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCG TTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCC ACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGG AATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGC TCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCA GCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTAC CAAATCTTGACATCCTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGAC AGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAA CCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTG CTACAATGGATAATACAAAGGGCAGCGAATCCGCGAGGCCAAGCAAATCCCATAAAATTATTC TCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATC AGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT 33

10 GTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAATGA T c. Isolat L1K1 GAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTA ACCTGCCCTTAACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGAGCGTCCAC CGCATGGTGGGTGTTGGAAAGATTTATCGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTG GTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATG GGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTT TCAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCG TAGGCGGTTTGTCGCGTCTGTCGTGAAAGTCCGGGGCTTAACCCCGGATCTGCGGTGGGTAC GGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGA TATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCG AAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACT AGGTGTGGGGACCATTCCACGGTTTCCGCGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGG GAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGC ATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTTCTCGATCGCCG TAGAGATACGGTTTCCCCTTTGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCCATGTTGCCAGCACGTC GTGGTGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGAGGACGACGTCAA ATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAATGGGTTGCG ATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTTAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCG ACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAAC CCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACCAGCGATT 34

11 Lampiran 8. Hasil Analisis Sekuen 16S rrna dengan Program BLASTN NCBI a. Isolat L2K5 d. Isolat L2K3 35

12 e. Isolat L1K1 36