KONSTRUKSI GEN STILBENA SINTASE PADA VEKTOR EKSPRESI DENGAN METODE GATEWAY DAN TRANSFORMASI PADA Agrobacterium sp.

Transkripsi

1 KONSTRUKSI GEN STILBENA SINTASE PADA VEKTOR EKSPRESI DENGAN METODE GATEWAY DAN TRANSFORMASI PADA Agrobacterium sp. IBRAHIM FEBRIZKY DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

2 ABSTRAK IBRAHIM FEBRIZKY. Konstruksi Gen Stilbena Sintase pada Vektor Ekspresi dengan Metode Gateway dan Transformasi pada Agrobacterium sp. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TETTY CHAIDAMSARI. Bioteknologi modern atau rekayasa genetika telah berkembang sangat pesat dalam dua dasawarsa terakhir dan telah banyak diaplikasikan dalam berbagai bidang, salah satunya dalam bidang rekayasa genetika tanaman. Penyakit busuk pangkal batang yang disebabkan oleh cendawan Ganoderma sp. sering menyerang tanaman kelapa sawit sehingga produksinya menurun. Teknik rekayasa genetika dapat digunakan untuk mengendalikan masalah tersebut, yaitu dengan menyisipkan gen yang dapat meningkatkan ketahanan kelapa sawit terhadap Ganoderma. Gen stilbena sintase (STS) yang diisolasi dari anggur (Vitis vinifera) telah diketahui sebagai gen penghasil senyawa yang berfungsi sebagai anti jamur. Penelitian ini bertujuan menyisipkan gen STS dengan metode yang lebih cepat dan terarah, yaitu metode Gateway. Gen STS kemudian ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens. Penyisipan gen STS ke dalam vektor donor, vektor destinasi, dan A. tumefaciens telah berhasil dilakukan dengan ditunjukkan hasil elektroforesis gel agarosa 1% berupa pita berukuran sekitar 1500 pb. Gen STS telah berhasil disisipkan pada vektor ekspresi dengan metode Gateway dan ditransformasikan ke dalam A. tumefaciens.

3 ABSTRACT IBRAHIM FEBRIZKY. Construction of Stilbene Synthase Gene in Expression Vector using The Gateway Method and Transformation to Agrobacterium sp. Under the direction of MARIA BINTANG and TETTY CHAIDAMSARI. The modern biotechnology also known as a genetic engineering has been grown so fast in last two decades and has been applied in many plantation fields. The Basal Stem Rot (BSR) disease which is caused by Ganoderma sp. attacks the oil palm crops frequently and reduces the level of oil palm productivities. The genetic engineering technique can be used to control it by gene cloning which can increases the oil palm resistances against Ganoderma. Stilbene synthase (STS) gene which is isolated from grapevines (Vitis vinifera) has been recognized as a gene producing anti-fungal substance. The objective of this research is to clone the STS gene by using faster and more directive Gateway method. The STS gene is transformed into Agrobacterium tumefaciens afterwards. The cloning of STS gene into a donor vector, destination vector, and A. tumefaciens was successfully carried out by resulting a DNA band of 1500 bp using 1% agarose gel electrophoresis. The conclusion of this research is that the STS gene has been successfully inserted into the expression vector by using the Gateway method and transformed into A. tumefaciens.

4 KONSTRUKSI GEN STILBENA SINTASE PADA VEKTOR EKSPRESI DENGAN METODE GATEWAY DAN TRANSFORMASI PADA Agrobacterium sp. IBRAHIM FEBRIZKY Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

5 Judul Skripsi : Konstruksi Gen Stilbena Sintase pada Vektor Ekspresi dengan Metode Gateway dan Transformasi pada Agrobacterium sp. Nama : Ibrahim Febrizky NIM : G Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si. Ketua Anggota Diketahui Dr. I Made Artika, M.App.Sc. Ketua Departemen Biokimia Tanggal Lulus:

6 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, yang telah melimpahkan karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Shalawat dan salam semoga tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW. Penelitian yang berjudul Konstruksi Gen Stilbena Sintase pada Vektor Eskpresi dengan Metode Gateway dan Transformasi pada Agrobacterium sp. ini dilaksanakan sejak bulan Februari 2011 sampai dengan Juni 2011 di Laboratorium Rekayasa Genetika dan Biologi Molekuler, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian penelitian ini, antara lain kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. selaku pembimbing utama dan Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si. selaku pembimbing lapangan yang telah memberikan saran dan kritik yang membangun serta kepada Mbak Nina Yuniar selaku asisten pembimbing yang sangat baik dan sabar mengajarkan banyak hal pada penulis. Ungkapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua penulis, Bpk. Abdul Chalik Roeslan dan Ibu Sri Retno Utami, serta kedua adik penulis, Muhammad Iqbal dan Muhammad Luthfi, atas segala doa, dukungan, dan kasih sayang yang telah diberikan. Tidak lupa untuk teman-teman Biokimia 44, khususnya Ismi Willysia Billirantau atas bantuan yang diberikan kepada penulis. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2011 Ibrahim Febrizky

7 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 6 Februari 1990 dari ayah Abdul Chalik Roeslan dan ibu Sri Retno Utami. Penulis merupakan putra pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 48 Jakarta Timur dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih mayor Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam kegiatan organisasi kemahasiswaan, yaitu di Himpunan Profesi Biokimia (CREBs) sebagai staf divisi Infokomtari pada tahun 2008/2009 dan staf divisi HRD pada tahun 2009/2010. Penulis juga aktif menjadi panitia dalam beberapa acara seperti Seminar Kanker (2008), Masa Perkenalan Departemen Biokimia (2009 & 2010), dan Lomba Karya Ilmiah Populer (2009). Penulis aktif dalam olahraga basket pada tingkat departemen dan fakultas serta pernah menjuarai beberapa turnamen (2008, 2009, 2010, & 2011). Tahun 2010 penulis memenangi juara 1 & 2 Lomba Cipta Produk (berupa poster) dalam acara Biochemistry Seminar & Expo. Pada tahun yang sama penulis juga pernah melakukan Praktik Lapang di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) dengan judul Penentuan Konsentrasi Antibiotik pada Eksplan Kelapa Sawit (Elaies guineensis Jacq.) untuk Bahan Transformasi. Pada tahun 2011 penulis membuat satu buah karya ilmiah dalam Program Kreativitas Mahasiswa bidang Penelitian yang berjudul Perbandingan Benalu Ceremai (Phyllantus acidus L.) dan Jeruk (Citrus sp.) sebagai Antikanker dan Antidiabetes Berbasis Uji Toksisitas.

8 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR... ix DAFTAR LAMPIRAN... ix PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA Stilbena Sintase... 1 Pengklonan & Metode Pengklonan Gateway... 2 Polymerase Chain Reaction (PCR)... 3 Elektroforesis Gel Agarosa... 4 Agrobacterium tumefaciens... 5 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat... 5 Metode HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Amplifikasi Gen STS dengan Primer Gateway... 8 Hasil Ekstraksi dan Purifikasi DNA dari Gel Agarosa... 9 Hasil Rekombinasi Gen STS pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi.. 9 Konfirmasi Koloni Transforman Reaksi BP dan Isolasi DNA Plasmid Konfirmasi Koloni Transforman Reaksi LR dan Isolasi DNA Plasmid Hasil Transformasi Klon Ekspresi ke dalam A. tumefaciens SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 16

9 ix DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Reaksi BP dalam metode Gateway Reaksi LR dalam metode Gateway Tahapan reaksi PCR Agrobacterium tumefaciens Elektroforegram amplikon gen STS dengan primer Gateway Elektroforegram hasil ekstraksi dan purifikasi gen STS dari gel Koloni yang tumbuh setelah reaksi BP pada metode Gateway Koloni yang tumbuh setelah reaksi LR pada metode Gateway Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada vektor donor Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada pgd Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada parc Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada pdest Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke A. tumefaciens Elektroforegram PCR koloni hasil transformasi ke A. tumefaciens DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan konstruksi gen STS pada vektor donor Tahapan konstruksi gen STS pada vektor destinasi dan transformasi ke Agrobacterium tumefaciens Primer yang dirancang berdasarkan metode Gateway Reaksi BP pada metode pengklonan Gateway Reaksi LR pada metode pengklonan Gateway Peta marka seleksi vektor donor (pdonr TM 221) Hasil analisis tingkat homologi sekuen gen menggunakan BLAST... 23

10 PENDAHULUAN Bioteknologi merupakan suatu bidang ilmu dalam biologi terapan yang melibatkan penggunaan organisme hidup dan bioproses untuk menciptakan suatu produk demi kepentingan manusia. Bioteknologi modern, atau sering disebut juga rekayasa genetika, telah berkembang sangat pesat dalam dua dasawarsa terakhir ini. Teknik rekayasa genetika telah banyak diaplikasikan dalam berbagai bidang, misalnya penelitian, medis, rekayasa genetika hewan, dan rekayasa genetika tanaman (Smith 2004). Rekayasa genetika tanaman adalah suatu teknik untuk memindahkan gen spesies asing ke dalam suatu sel tanaman, yang diikuti dengan regenerasi dari sel-sel tanaman tersebut sehingga menjadi tanaman lengkap. Teknik ini telah diterapkan pada berbagai tanaman pangan dan nonpangan. Rekayasa genetika sebenarnya merupakan kelanjutan dari pemuliaan tanaman yang telah dilakukan oleh petani secara tradisional. Rekayasa genetika memungkinkan pemindahan satu atau beberapa gen yang dikehendaki dari satu tanaman ke tanaman lainnya yang tidak mungkin terjadi dalam pemuliaan tanaman secara tradisional. Prinsip rekayasa genetika sama dengan pemuliaan tanaman, yaitu memperbaiki sifatsifat tanaman dengan menambahkan sifat-sifat ketahanan terhadap gangguan hama maupun lingkungan yang kurang menguntungkan. Proses rekayasa genetika telah berhasil mengembangkan berbagai spesies tanaman baru dengan ketahanan terhadap organisme pengganggu, seperti serangga, penyakit, dan gulma yang sangat merugikan tanaman (Winarno & Agustinah 2007). Contoh tanaman yang telah berhasil direkayasa adalah jagung, kapas, kedelai, tomat, dan kelapa sawit. Kelapa sawit merupakan salah satu komoditas perkebunan yang sangat penting di Indonesia dan produksinya meningkat setiap tahun. Salah satu kendala yang cukup berarti dalam usaha peningkatan produksi kelapa sawit adalah penyakit busuk pangkal batang yang disebabkan oleh cendawan Ganoderma sp. Penyakit ini dapat merusak sangat banyak tanaman kelapa sawit dalam suatu area (PPKS 2009). Pengendalian terhadap penyakit ini telah dilakukan baik secara mekanis, kimiawi, maupun hayati (Lubis 1992), namun belum ada yang dapat dianggap efektif sehingga perlu dilakukan pengendalian yang tepat. Pengendalian yang paling tepat dilakukan untuk masalah Ganoderma pada tanaman kelapa sawit adalah melalui pemuliaan tanaman dengan rekayasa genetika, yaitu untuk menemukan gen yang dapat membuat kelapa sawit tahan terhadap Ganoderma. Gen tersebut dapat berasal dari spesies kelapa sawit sendiri maupun dari spesies lain. Gen stilbena sintase (STS) yang berasal dari anggur (Vitis vinifera) merupakan gen penghasil senyawa yang berfungsi sebagai anti jamur (SIB 2007), sehingga dapat dilakukan upaya penyisipian gen STS ke dalam kelapa sawit agar dapat meningkatkan ketahanan terhadap Ganoderma. Upaya konstruksi gen STS agar dapat disisipkan ke dalam kelapa sawit sebelumnya sudah pernah dilakukan dengan menggunakan metode pengklonan biasa dengan prosedur yang cukup rumit dan waktu yang cukup lama. Konstruksi gen pada penelitian ini menggunakan teknologi Gateway. Teknologi Gateway adalah suatu metode kloning universal yang berdasarkan rekombinasi situs spesifik pada bakteriofag lambda (Landy 1989). Teknologi Gateway memungkinkan pemindahan secara cepat dan efisien sekuen DNA ke dalam beberapa vektor untuk dilakukan analisis fungsional dan ekspresi protein (Hartley at al. 2000). Penelitian ini bertujuan mengonstruksi gen STS pada vektor ekspresi dengan metode yang lebih cepat dan terarah, yaitu metode Gateway. Gen STS yang telah tersisipkan dalam vektor ekspresi selanjutnya ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens. Hipotesis penelitian ini adalah gen STS yang telah dikonstruksi pada vektor ekspresi dengan metode Gateway bisa disisipkan ke dalam Agrobacterium tumefaciens agar dapat diekspresikan pada tanaman. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan Agrobacterium tumefaciens yang memiliki gen STS, serta memberikan informasi mengenai metode Gateway sebagai teknologi rekombinasi gen yang cepat dan mudah. TINJAUAN PUSTAKA Stilbena Sintase Stilbena sintase merupakan suatu protein yang memiliki panjang sekuen 392 asam amino yang berperan dalam proses pembentukan suatu senyawa yang disebut resveratrol. Protein ini berfungsi sebagai

11 2 katalis reaksi sintesis substrat malonil KoA dan p-koumaroil KoA (Rolfs & Kindl 1984) menjadi 3,5,4 -trihidroksistilbena atau resveratrol. Stilbena sintase terdapat secara spesifik pada daun, terekspresi di jaringan palisade dan parenkim. Stilbena sintase bukan merupakan bagian permanen dari suatu tanaman, protein ini terinduksi pada saat beberapa kondisi tertentu seperti saat stres, terpapar sinar ultraviolet (UV), atau saat kehadiran patogen seperti Botrytis cinerea (Schubert et al. 1997). Resveratrol merupakan suatu senyawa fitoaleksin polifenolik. Senyawa ini termasuk dalam golongan stilbenoid, yaitu derivat stilbena, yang diproduksi dalam beberapa tanaman dengan bantuan enzim stilbena sintase untuk melindungi tanaman tersebut dari infeksi jamur (Breuil et al. 1999). Anggur, kacang, dan beberapa spesies tanaman lainnya memiliki kandungan resveratrol yang terakumulasi di daun mencapai 400 µg/g berat segar. Konsentrasi sebesar itu menunjukkan korelasi dengan resistensi tanaman tersebut terhadap jamur (Sbaghi et al. 1995). Tanaman seperti tembakau, tomat, dan alfalfa yang sebelumnya rentan menunjukkan peningkatan resistensi terhadap jamur patogen setelah disisipkan gen stilbena sintase (Hain et al. 1993). Pengklonan & Metode Pengklonan Gateway Klon adalah sekumpulan individu atau bahan identik yang diperbanyak dari individu atau bahan yang sama, sedangkan pengklonan adalah proses perbanyakan bahan tersebut sehingga menghasilkan bahan yang identik dengan bahan asalnya (Triastuti 2007). Pengklonan gen, atau dapat disebut juga kloning gen dan teknologi DNA rekombinan, merujuk pada suatu proses yaitu pemindahan fragmen DNA yang diinginkan dari satu organisme ke dalam suatu vektor, misalnya plasmid. Fragmen DNA dan vektor yang telah bergabung disebut molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan tersebut kemudian dapat diperbanyak dalam suatu sel inang (HGP 2009). Tahap awal yang umum dilakukan dalam pengklonan gen adalah isolasi fragmen DNA dan vektor, misalnya dari bakteri, dan setelah diisolasi fragmen DNA dan vektor dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Tahap selanjutnya adalah menggabungkan fragmen DNA dengan vektor yang dibantu oleh enzim ligase, sehingga disebut juga tahap ligasi, menghasilkan molekul DNA rekombinan. Molekul DNA rekombinan kemudian ditransformasikan ke bakteri. Transformasi adalah proses memasukkan DNA asing (DNA rekombinan) ke dalam sel inang. Sel inang yang telah mengalami transformasi (mengandung DNA rekombinan) kemudian diseleksi berdasarkan gen penanda yang dibawa oleh plasmid. Gen penanda, atau selectable marker, biasanya berupa gen yang tahan terhadap suatu antibiotik. Sel inang yang telah diseleksi selanjutnya ditransformasi ke sel target. Tahap terakhir adalah meneliti gen yang diklon, yaitu dengan mendapatkan informasi mengenai lokasi gen, cara gen ditranskripsi, hasil translasi yang dikode oleh gen, dan struktur gen (Brown 1991). Metode pengklonan Gateway, yang ditemukan dan dikembangkan oleh Invitrogen sejak akhir tahun 1990-an, adalah suatu metode biologi molekular yang memungkinkan peneliti untuk memindahkan fragmen DNA dari suatu plasmid ke plasmid lain secara efisien dengan menggunakan suatu set sekuen rekombinasi yang disebut situs att Gateway, dan dua mix enzim yang disebut enzim BP klonase dan LR klonase. B merupakan singkatan dari bacterial dan P (phage), sedangkan L (left) dan R (right). Metode ini dapat secara efektif menggantikan fungsi dari enzim restriksi endonuklease dan ligase pada metode pengklonan biasa (Hartley et al. 2000). Metode pengklonan Gateway sebenarnya memanfaatkan reaksi rekombinasi situs spesifik yang memungkinkan bakteriofag lambda untuk berintegrasi ke dalam kromosom bakteri atau sebaliknya. Protokol Gambar 1 Reaksi BP dalam metode Gateway (Kolpack & Loschelder 2008).

12 3 Gateway sangat bergantung pada reaksi BP dan LR klonase. Reaksi BP (Gambar 1) dikatalisis oleh mix enzim BP klonase yang terdiri atas enzim integrase fage (Int) dan protein IHF (Integration Host Factor). Enzim BP klonase memindahkan suatu fragmen DNA yang diinginkan, misalnya produk PCR, yang diapit oleh dua situs bacterial attachment (attb) ke dalam vektor donor (pdonr) yang membawa dua situs phage attachment (attp). Rekombinasi terjadi antara situs attb dan attp yang cocok, selanjutnya fragmen DNA disisipkan ke dalam vektor donor, menghasilkan suatu klon entri (pentr) yang diapit oleh dua situs left attachment (attl). Klon entri juga dapat dirakit oleh restriksi dan ligasi fragmen DNA dalam vektor yang mana situs pengklonan jamaknya diapit oleh situs attl (Karimi et al. 2007). Klon entri merupakan substrat kunci dalam reaksi LR (Gambar 2) yang dikatalisis oleh mix enzim LR klonase yang terdiri atas enzim integrase (Int), exsisionase fage (Xis), dan protein IHF. Enzim LR klonase memindahkan fragmen DNA yang diinginkan yang diapit oleh dua situs attl (di dalam klon entri) ke dalam vektor destinasi (pdest) yang membawa dua situs right attachment (attr). Rekombinasi terjadi antara situs attl dan attr yang cocok, selanjutnya fragmen DNA disisipkan ke dalam klon ekspresi (pexpr) dan diapit lagi oleh situs attb (Karimi et al. 2007). Hasil rekombinasi dapat diseleksi dengan kombinasi seleksi positif (resisten terhadap antibiotik) dan seleksi negatif (gen sitotoksik ccdb). Gen sitotoksik ccdb (Control of Cell Death B) terdapat pada vektor donor dan vektor destinasi. Saat rekombinasi pada reaksi Gambar 2 Reaksi LR dalam metode Gateway (Kolpack & Loschelder 2008). BP terjadi, gen ccdb akan bertukar dengan fragmen DNA yang diinginkan sehingga vektor yang tidak disisipi DNA tersebut akan mati karena gen ccdb. Begitu juga pada reaksi LR, fragmen DNA yang telah diapit oleh situs attl akan bertukar dengan gen ccdb yang telah diapit oleh situs attr pada vektor destinasi (Bernard & Couturier 1992). Polymerase Chain Reaction (PCR) Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu teknik yang digunakan secara luas dalam bidang biologi molekular dan dikembangkan pertama kali oleh Kary Mullis pada tahun Teknik ini disebut polymerase chain reaction karena mengacu pada enzim DNA polimerase yang digunakan untuk mengamplifikasi (replikasi berulang kali) suatu DNA secara in vitro. Instrumen PCR dapat mereplikasi molekul DNA yang asli dengan bantuan enzim DNA polimerase sehingga jumlahnya menjadi dua kali lipat. Molekul-molekul DNA tersebut kemudian direplikasi lagi pada replikasi siklus kedua, sehingga jumlahnya menjadi empat kali lipat. DNA direplikasi lagi pada siklus ketiga dan seterusnya, proses ini yang disebut reaksi berantai (chain reaction) dimana DNA cetakan diamplifikasi secara eksponensial. Proses PCR memungkinkan amplifikasi satu utas DNA menjadi beberapa juta kopi melalui beberapa siklus, sehingga dapat digunakan dalam manipulasi genetik atau penggunaan yang lain (Kennedy & Oswald 2011). Proses PCR membutuhkan empat komponen utama agar dapat berjalan, yaitu (1) DNA cetakan, adalah fragmen DNA yang akan diamplifikasi, (2) oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA, (3) deoksiribonukleotida trifosfat (dntp), terdiri atas datp, dctp, dgtp, dttp, dan (4) enzim DNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa buffer (Yuwono 2006). PCR pada prinsipnya adalah menggunakan perbedaan temperatur untuk tiga tahap reaksi (Gambar 3), yaitu denaturasi (denaturation), penempelan (annealing), dan pemanjangan (extension). Suhu yang tinggi, biasanya o C, digunakan untuk mendenaturasi (memisahkan) utas ganda DNA cetakan. Suhu kemudian diturunkan untuk menempelkan

13 4 primer kepada sekuen basa yang komplementer pada utas cetakan, suhu annealing tersebut berbeda-beda bergantung pada primer yang digunakan. Suhu annealing memegang peranan penting untuk memastikan tingkat spesifitas reaksi, biasanya semakin tinggi suhu annealing maka reaksi akan semakin spesifik. Suhu annealing yang digunakan umumnya 55 o C. Akhirnya, untuk sintesis DNA yang efisien, suhu diatur agar optimal untuk aktivitas DNA polimerase, yaitu sekitar 72 o C. Ketiga siklus tahap reaksi tersebut biasanya dilalui berulang kali untuk mendapatkan hasil amplifikasi DNA yang baik (biasanya sekitar siklus) atau agar hasilnya dapat dilihat secara langsung melalui elektroforesis gel agarosa (McPherson & Moller 2006). Keberhasilan PCR sangat bergantung pada penggunaan primer yang didesain dengan benar. Sepasang primer yang didesain dengan benar dapat mengamplifikasi suatu fragmen DNA yang cocok dengan daerah target dari molekul DNA tersebut. Primer didesain agar tepat komplementer dengan DNA cetakan. Syarat-syarat desain primer yang baik secara ringkas adalah: (1) Panjang primer, memegang peranan penting karena suhu annealing bergantung kepada panjang primer. Panjang primer yang ideal berkisar antara basa; (2) Komposisi primer, komposisi basa primer sebaiknya sekitar 45-60% terdiri atas G+C; (3) Primer sebaiknya tidak memiliki struktur sekunder; (4) Primer yang ideal tidak mengandung sekuen yang saling komplementer satu sama lain; (5) Sekuen palindrom harus dihindari; (6) Suhu melting (T m ) primer yang optimum berkisar antara o C, dapat dihitung dengan rumus T m = 2(A+T) + 4(G+C); dan (7) Posisi produk, Gambar 3 Tahapan reaksi PCR. lokasi primer bisa di dekat ujung 5, ujung 3, atau dimana saja selama tidak melebihi panjang yang ditetapkan. Posisi ujung 3 telah diketahui dapat menghindari mispriming atau kesalahan peng-awal-an (Donepudi 2011). Elektroforesis Gel Agarosa Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Molekul yang bermuatan negatif jika dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut bergantung pada rasio muatan terhadap massanya, serta bergantung juga pada bentuk molekulnya (Yuwono 2005). Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein. Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa, yaitu suatu bahan semipadat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut atau alga yang ditemukan di California dan Asia bagian timur (Rothman 2011). Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer, dan dicetak sehingga membentuk sumur-sumur saat kondisinya masih panas (cair). Larutan buffer yang dapat digunakan misalnya trisasetat-edta (TAE) dan tris-borat-edta (TBE). Teknik elektroforesis DNA juga memerlukan loading buffer selain larutan buffer elektroforesis, yang berfungsi meningkatkan densitas sampel sehingga fragmen sampel tersebut berada di dasar sumur gel dan tidak menyebar (Sambrook & Russell 2001). Elektroforesis pada dasarnya adalah proses penyaringan. Fragmen DNA yang semakin besar akan semakin mudah terjerat oleh matriks gel, sehingga migrasinya akan semakin lambat. Kepadatan matriks dapat diatur dengan meningkatkan konsentrasi agarosa (kepadatan meningkat) atau

14 sebaliknya. Standar konsentrasi gel agarosa 1% dapat memisahkan DNA yang memiliki panjang antara Kb (Rothman 2011). Pengamatan hasil elektroforesis dapat dilakukan secara visual dengan menambahkan etidium bromida (EtBr) pada gel. EtBr akan menyisip ke dalam DNA sehingga dapat berpendar jika dipaparkan sinar UV. Citra berupa pita-pita pada gel akan tampak jika gel disinari dengan sinar UV dari bawah. Pita-pita tersebut adalah molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis (Yuwono 2005). Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri golongan Gram negatif yang memiliki sifat aerob dan mampu hidup dengan baik sebagai saprofit maupun parasit. A. tumefaciens berbentuk batang, berukuran µm sampai µm dalam bentuk tunggal atau berpasangan (Gambar 6). Bakteri ini mudah bergerak (motil), tidak berspora, tidak memiliki pigmen, dan tumbuh optimal pada suhu o C (Biotek UnUd 2008). Sebagian besar genus Agrobacterium bertanggung jawab terhadap penyakit tumor pada tanaman dikotil dan beberapa tanaman monokotil yang disebut penyakit Crown Gall (McCullen & Binns 2006). Penyakit tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang pertumbuhannya terdiferensiasi akibat adanya interaksi antar tanaman yang rentan dengan galur virulen A. tumefaciens. Galur AGL0 yang digunakan dalam penelitian ini telah terbukti sebagai galur yang virulen (Jones et al. 2005). Karakterisasi molekular dari induksi Crown Gall ini menunjukkan bahwa Agrobacterium bisa dipakai untuk mengantarkan materi genetik ke dalam tanaman (Deacon 2002). Materi genetik tersebut berupa potongan DNA yang disebut sebagai T-DNA (DNA transfer). Bakteri ini dikenal sebagai parasit genetik karena memindahkan materi genetiknya ke dalam mekanisme genetik sel inang. Sistem transfer DNA dari Agrobacterium ke tanaman dimanfaatkan secara meluas untuk penelitian biologi molekular dan rekayasa genetika pada tanaman (Nester 2008). Pembentukan tumor pada tanaman melibatkan tiga komponen genetik. Pertama, gen virulen kromosom (chromosomal virulence atau chv) yang terdapat pada kromosom A. tumefaciens. Gen ini berfungsi dalam pelekatan bakteri pada sel tanaman. Kedua, sekelompok gen virulen (vir). Gen vir terdapat dalam plasmid Ti dan berperan dalam menginduksi transfer dan integrasi T-DNA. Ketiga, daerah T-DNA yang mengandung gen penting bagi A. tumefaciens. Daerah ini dibatasi oleh LB (Left border) dan RB (Right Border). Proses pembentukan tumor inilah yang mendasari konsep transformasi genetik atau penyisipan gen ke dalam tanaman menggunakan A. tumefaciens (Escobar & Dandekar 2003). Gambar 4 Agrobacterium tumefaciens. BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam proses amplifikasi menggunakan kit Platinum dari Invitrogen adalah gen stilbena sintase (STS), primer spesifik Gateway STS-For, primer spesifik Gateway STS-Rev, larutan bufer PCR 10x, MgCl 2, dntps, Taq polimerase, dan molecular water (MW). Bahan yang digunakan dalam elektroforesis yaitu gel agarosa (Fermentas), larutan bufer Tris-Borat- EDTA (TBE) 0.5x, etidium bromida (EtBr) 5 µl/100 ml, loading buffer (bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Ekstraksi dan purifikasi gel menggunakan kit dari Invitrogen (PureLink TM Quick Gel Extraction). Bahan yang digunakan dalam proses rekombinasi adalah kit Gateway Technology dari Invitrogen (vektor pdonr TM, vektor destinasi, enzim BP Clonase TM, enzim proteinase K, enzim LR Clonase TM ). Tahap transformasi ke dalam sel kompeten menggunakan sel kompeten Escherichia coli XL1-Blue dan media Luria Agar (LA). Isolasi DNA plasmid menggunakan kit dari Fermentas (GeneJET TM Plasmid MiniPrep Kit). Tahap transformasi ke dalam Agrobacterium menggunakan sel kompeten A. tumefaciens galur AGL0 dan media Yeast Extract Pepton (YEP). Bahan lainnya yang digunakan adalah primer M 13 -F, primer M 13 - R, larutan bufer 10x dream Taq, larutan bufer

15 6 TE, kanamisin ppm, rifampisin ppm, media Luria Bertani (LB) cair + glukosa 20 mm, nitrogen cair, dan gliserol. Alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah sisir, cetakan agar, bak elektroforesis (BioRad), pipet mikro, tabung mikro, microwave, adaptor 100 volt (Sigma), dan transluminator UV T2201 (Sigma). Alat lainnya yang digunakan adalah DNA speed vacuum 110 savant, mesin PCR (ESCO Swift Maxi), Eppendorf Cenrifuge 5417R, inkubator Certomat HK, inkubator Thermolyne type 41900, shaker incubator (Environmental Shaker-Incubator ES-20 BIOSAN), shaker water bath (Techne SB-16), laminar air flow cabinet, neraca analitik, tusuk gigi, alumunium foil, scalpel, dan peralatan gelas seperti segitiga penyebar, cawan Petri, gelas piala, labu Erlenmeyer, dan gelas ukur. Metode Amplifikasi Gen Stilbena Sintase dengan Primer Gateway (Invitrogen 2010) Gen STS yang telah diisolasi dari tanaman anggur (Vitis vinifera) pada penelitian sebelumnya diamplifikasi dengan menggunakan kit dari Invitrogen. Amplifikasi tersebut menggunakan sepasang primer spesifik Gateway, yaitu Gateway STS- Forward dan Gateway STS-Reverse. Amplifikasi dimulai dengan menyiapkan campuran reaksi (reaction mix) yang terdiri atas 2.5 µl larutan bufer PCR 10x, 1 µl MgCl 2, 1 µl dntps, 0.2 µl Taq polimerase 5 unit, dan 14.3 µl molecular water (MW). DNA cetakan (template) dimasukkan ke dalam tabung mikro sebanyak 1 µl, selanjutnya primer F (STS-Forward) dan primer R (STS-Reverse) ditambahkan ke dalam tabung sebanyak masing-masing 1 µl lalu ditambahkan juga 3 µl MW. Reaction mix yang telah dipersiapkan sebelumnya kemudian ditambahkan ke dalam tabung mikro. Gen STS diamplifikasi dengan mesin PCR sebanyak 35 siklus dengan program PCR: predenaturasi pada suhu 94 o C selama 7 menit, denaturasi pada suhu 94 o C selama 45 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 55 o C selama 45 detik, pemanjangan primer (extension) pada suhu 70 o C selama 2 menit, dan pascapemanjangan pada suhu 70 o C selama 5 menit. Elektroforesis DNA Serbuk agarosa ditimbang sebanyak 0.3 g, lalu dilarutkan dalam 30 ml larutan TBE 0.5x. Larutan tersebut dipanaskan dengan microwave selama ± 60 detik sampai larut. Larutan didiamkan sampai cukup hangat (± 50 o C), lalu ditambahkan EtBr sebanyak 1.5 µl. Larutan agarosa kemudian dituang ke dalam cetakan dan sisir yang telah dipersiapkan sebelumnya, lalu dibiarkan hingga mengeras membentuk agar atau gel. Gel agarosa tersebut digunakan untuk elektroforesis hasil amplifikasi. Gen yang telah diamplifikasi dengan PCR selanjutnya dielektroforesis untuk identifikasi gen. Gel agarosa yang sudah dibuat diletakkan di dalam bak elektroforesis, kemudian ditambahkan larutan bufer TBE 0.5x sampai gel terendam. Hasil amplifikasi diambil sebanyak 5 µl, kemudian dicampurkan dengan loading buffer sebanyak 1 µl. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa, sebanyak 0.8 µl marker 1 Kb Plus juga ditambahkan ke dalam salah satu sumur. Elektroforesis dijalankan pada tegangan 75 volt selama ± 1 jam. Pita DNA visualisasi hasil elektroforesis kemudian ditentukan dengan tiga cara, yaitu dibandingkan ukuran pita tersebut dengan marker, dihitung dengan menggunakan rumus log (M) = log (M o ) K R T (Ferguson 1964), dan dianalisis dengan software Photo- CaptMw. Ekstraksi dan Purifikasi DNA dari Gel Agarosa (Invitrogen 2010) Gel agarosa hasil elektroforesis diletakkan di atas transluminator UV. Gen STS yang telah berhasil diamplifikasi ditunjukkan dengan adanya pita yang kemudian diekstraksi dan dimurnikan. Pita yang terlihat pada gel dipotong menggunakan alat pemotong (scalpel). Gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro, kemudian ditambahkan larutan bufer pelarut (L3) sebanyak 3x volume. Larutan tersebut diinkubasi menggunakan water bath pada suhu 50 o C selama 10 menit, kemudian diinkubasi lagi pada suhu ruang selama 5 menit. Gel yang telah larut dipindahkan ke dalam Quick Gel Extraction Column (kolom) yang berada di atas tabung pencuci (wash tube), kemudian disentrifus pada kecepatan rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dibuang, lalu sebanyak 500 µl larutan bufer pencuci (wash buffer) ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifus lagi pada kecepatan rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk kembali dibuang, kolom beserta wash tube kosong disentrifus

16 7 pada kecepatan rpm selama 1 menit pada suhu ruang. Wash tube dibuang dan kolom dipindahkan ke tabung pemulih (recovery tube), selanjutnya ditambahkan 30 µl larutan bufer elusi tepat di tengah kolom lalu diinkubasi selama 1 menit. Kolom beserta recovery tube disentrifus pada kecepatan rpm selama 2 menit pada suhu ruang, kemudian buang kolom. Supernatan dalam recovery tube disimpan dan diberi label. Rekombinasi Gen STS pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi (Invitrogen 2003) Gen STS yang telah diekstraksi dan dipurifikasi selanjutnya direkombinasikan ke vektor donor dan vektor destinasi secara berurutan dengan metode Gateway. Rekombinasi STS pada vektor donor dimulai dengan menyiapkan sebanyak 2 µl DNA hasil purifikasi, 1 µl vektor donor (pdonr TM 221), dan ditambahkan larutan bufer TE sampai volumenya menjadi 8 µl. Enzim BP Clonase TM ditambahkan terakhir sebanyak 2 µl, kemudian diinkubasi pada suhu 25 o C selama 2 jam. Setelah inkubasi selesai ditambahkan enzim proteinase K sebanyak 1 µl, lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 15 menit. Hasil rekombinasi pada vektor donor tersebut diambil sebanyak 5 µl kemudian ditransformasikan ke E. coli untuk menggandakan plasmid yang telah membawa gen STS. Koloni bakteri E. coli yang tumbuh pada media LA dikonfirmasi dengan metode PCR koloni. DNA plasmid koloni bakteri rekombinan tersebut selanjutnya diisolasi untuk direkombinasikan ke vektor destinasi. Plasmid rekombinan sebanyak 2 µl dimasukkan ke dalam tabung mikro dan ditambahkan 1 µl vektor destinasi (pgd625, parc983, dan pdest), kemudian larutan bufer TE ditambahkan sampai volume menjadi 8 µl. Enzim LR Clonase TM ditambahkan terakhir sebanyak 2 µl, kemudian diinkubasi pada suhu 25 o C selama 2 jam. Setelah inkubasi selesai ditambahkan enzim proteinase K sebanyak 1 µl, lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 15 menit. Hasil rekombinasi pada vektor destinasi tersebut diambil sebanyak 5 µl untuk kemudian ditransformasikan ke E. coli. DNA plasmid koloni bakteri yang tumbuh kemudian diisolasi lalu dikonfirmasi dengan metode PCR. Plasmid rekombinan selanjutnya ditransformasikan ke A. tumefaciens. Transformasi Gen Stilbena Sintase Escherichia coli ke Gen STS yang telah direkombinasikan ke vektor donor maupun vektor destinasi ditransformasi ke E. coli untuk menggandakan sel yang membawa plasmid rekombinan. Hasil rekombinasi sebanyak 5 µl dicampurkan ke dalam 200 µl sel kompeten E. coli XL1-Blue kemudian diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Campuran tersebut kemudian diberi perlakuan kejut panas (heat shock) pada suhu 42 o C selama 50 detik menggunakan water bath, kemudian segera dimasukkan lagi ke dalam es selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan 800 µl LB cair + glukosa 20 mm dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 90 menit menggunakan shaker incubator pada kecepatan 150 rpm. Setelah dikocok dengan shaker incubator, sebanyak 100 µl hasil kultur dituang ke media LA yang telah ditambahkan kanamisin 50 ppm dan disebar dengan segitiga penyebar. Sisa kultur sebanyak 900 µl disentrifus pada kecepatan 3500 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dibuang sebanyak ± 800 µl, sedangkan sisa supernatan sebanyak 100 µl dan pelet diresuspensi kemudian disebar ke media LA yang lain. Media diinkubasi selama jam pada suhu 37 o C kemudian koloni yang tumbuh diamati. Konfirmasi Koloni Transforman dengan Metode PCR Koloni Koloni yang tumbuh dipindahkan ke media LA yang baru untuk membuat duplikat koloni. Koloni tersebut setelah diduplikasi juga dipindahkan ke dalam tabung mikro yang berisi 10 µl MW dengan menggunakan tusuk gigi untuk persiapan PCR koloni. Pemindahan koloni harus dilakukan secara steril di dalam laminar air flow cabinet. PCR koloni dimulai dengan menyiapkan reaction mix yang terdiri atas 1.5 µl larutan bufer 10x dream Taq (Fermentas), 0.3 µl dntps, 0.15 µl primer F, 0.15 µl primer R, 0.15 µl Taq polimerase, dan 2.75 µl MW. Konfirmasi koloni pada vektor donor menggunakan primer M 13 -F dan M 13 -R, sedangkan pada vektor destinasi menggunakan primer Gateway STS-For dan Gateway STS-Rev. PCR koloni dilakukan dalam 30 siklus. Tahap pertama PCR koloni adalah melisis dinding sel koloni, yaitu dengan program lisis koloni PCR: 96 o C selama 5 menit, 50 o C selama 90 detik, 96 o C selama 90 detik, 45 o C selama 90 detik, 96 o C selama 1 menit, dan 40 o C selama 1 menit. Program dihentikan sejenak untuk dilakukan penambahan 5 µl

17 reaction mix pada tabung mikro, kemudian program PCR dilanjutkan kembali dengan program PCR biasa: 94 o C selama 30 detik, 55 o C selama 1 menit, dan 72 o C selama 2 menit. Hasil konfirmasi dicek dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan (Fermentas 2006) Isolasi DNA plasmid menggunakan GeneJET TM Plasmid MiniPrep Kit dari Fermentas. Koloni bakteri yang tumbuh pada media LA dikulturkan ke media LB cair yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm. Kultur diinkubasi dengan menggunakan shaker incubator pada suhu 37 o C selama semalam dengan kecepatan 220 rpm. Kultur bakteri yang telah tumbuh kemudian dipindahkan ke tabung mikro sebanyak 2 ml, dan disentrifus pada 8000 rpm, 25 o C, selama 3 menit. Pelet yang terbentuk diambil dan dilarutkan dengan penambahan 250 µl larutan resuspensi. Pelet yang telah larut kemudian ditambahkan 250 µl larutan lisis, lalu tabung dibolak-balik sebanyak 6 kali. Sebanyak 350 µl larutan netralisasi kemudian ditambahkan ke dalam larutan tersebut dan tabung dibolak-balik lagi 6 kali, lalu disentrifus pada rpm, 25 o C, selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke GeneJET YM Spin Column (kolom) dan disentrifus pada rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 µl larutan pencuci ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifus pada rpm selama 1 menit (dilakukan dua kali). Tabung beserta kolom dalam keadaan kosong kemudian disentrifus lagi pada rpm selama 1 menit. Kolom dipindahkan ke dalam tabung baru, kemudian ditambahkan 30 µl larutan bufer elusi tepat di tengah kolom, lalu diinkubasi selama 2 menit dan disentrifus pada rpm selama 2 menit. Hasil isolasi dicek dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens galur AGL0 Transformasi ke A. tumefaciens dilakukan dengan sebanyak 10 µl hasil rekombinasi pada vektor destinasi dimasukkan ke dalam 500 µl sel kompeten A. tumefaciens galur AGL0 lalu didiamkan di dalam es selama 15 menit. Campuran tersebut kemudian diinkubasi di dalam nitrogen cair selama 5 menit, dilanjutkan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 5 menit di dalam water bath. Sebanyak 1 ml media Yeast Extract Pepton (YEP) ditambahkan ke dalamnya kemudian dibungkus dengan koran sampai tidak terpapar cahaya. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 28 o C selama 3 jam di dalam shaker incubator. Hasil inkubasi kemudian disentrifus pada kecepatan 6000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang sebagian, dan sebanyak ± 100 µl supernatan yang tersisa diresuspensikan dengan pelet lalu disebar ke media LA yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm dan rifampisin 50 ppm. Media diinkubasi selama 2 hari pada suhu 28 o C dalam kondisi gelap. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Amplifikasi Gen Stilbena Sintase dengan Primer Gateway Langkah awal yang dilakukan dalam konstruksi gen STS pada vektor ekspresi adalah mendesain primer Gateway yang spesifik. Primer tersebut dirancang berdasarkan sekuen gen STS yang telah diperoleh pada penelitian sebelumnya. Primer yang digunakan, yaitu Gateway STS-Forward dan Gateway STS-Reverse, dirancang khusus untuk metode Gateway (Lampiran 3). Rancangan tersebut adalah empat basa nukleotida guanin (GGGG), diikuti situs attb (pada ujung Forward dan Reverse), kemudian ditambahkan urutan basa nukleotida spesifik gen STS (Invitrogen 2003). Situs attb disebut sebagai tempat pengikatan lambda (lambda attachment site), yaitu tempat integrasi DNA lambda ke dalam kromosom E. coli (Yuwono 2005). Amplifikasi gen STS dengan proses PCR dilakukan untuk menggandakan gen tersebut secara in vitro. Hasil amplifikasi kemudian dielektroforesis pada gel agarosa dengan konsentrasi 1% untuk mengetahui apakah gen tersebut berhasil teramplifikasi. Hasil elektroforesis menunjukkan pita berukuran sekitar 1500 pb (Gambar 5). Berdasarkan ukuran pita yang dihasilkan dan dengan membandingkan tingkat homologi ukuran pita dengan menggunakan situs NCBI, gen tersebut merupakan gen STS (Lampiran 7). Salah satu hasil perbandingannya adalah dengan gen STS dari tanaman Vitis vinifera kultivar Carignane yang memiliki ukuran 1535 pb (Xu et al. 2011). Hasil ini juga memperkuat simpulan Lilis (2009) yang menyatakan ukuran gen STS sebesar 1500 pb. Gen STS yang telah teramplifikasi selanjutnya diekstraksi dan dimurnikan.

18 9 M a Gambar 5 Elektroforegram amplikon gen STS dengan primer Gateway; (M) marker 1 Kb Plus DNA Ladder, (a) gen STS berukuran 1500 pb. Hasil Ekstraksi dan Purifikasi DNA dari Gel Agarosa (Elusi Gel) Ekstraksi dan purifikasii DNA dari gel menggunakan kit PureLink TM Quick Gel Extraction dari Invitrogen. Gel agarosa yang mengandung hasil elektroforesis dari tahap sebelumnya diletakkan di atas transluminator UV untuk melihat pita yang akan dipotong. Pita DNA yang terlihat dipotong dengan scalpel kemudian diekstraksii dan dimurnikan. Gel agarosa mengandung berbagai pengotor yang dapat menghambat reaksi dalam perlakuan selanjutnya terhadap DNA jika tidak dihilangkan. Ekstraksi dan purifikasi bertujuan memurnikan DNA dari gel dan pengotor lain yang tidak diinginkan seperti komponen PCR, sehingga efisiensi perlakuan terhadap DNA selanjutnya dapat meningkat (Lewis 2001). Ukuran pita DNA hasil ekstraksi dan purifikasi seharusnya tidakk berbeda jauh dengan ukuran pita hasil amplifikasi karena hanya menghilangkan pengotor dari DNA. Hasil ekstraksi dan purifikasi dielektroforesis dengan gel agarosa 1% dan menghasilkan pita berukuran sekitar 1500 pb (Gambar 6). Hasil ekstraksi dan purifikasi kemudian direkombinasikan ke dalam vektor donor dengan menggunakan metodee Gateway. Hasil Rekombinasi Gen Stilbena Sintase pada Vektor Donor dan Vektor Destinasi Rekombinasi gen STS pada vektor donor dan vektor destinasi pada prinsipnya merupakan teknik pengklonan. Pengklonan bertujuan memperbanyak dan mengisolasi DNA yang diklon. Pengklonan dengan metode Gateway terdiri atas dua tahapan, yaitu rekombinasi BP dan rekombinasi LR. Hasil elusi gel disisipkan ke dalam vektor donor pada tahap rekombinasi BP. Gen STS hasil amplifikasi yang telah memiliki situs attb1 (pada bagian forward) dan situs attb2 (pada bagian reverse) direaksikan dengan vektor donor yang memiliki situs attp1 dan situs attp2 sebagai tempat rekombinasi. Situs rekombinasi tersebut memungkinkan tidak adanya kesalahan orientasi gen yang direkombinasikan. Reaksi rekombinasi ini dikatalisis oleh enzim BP Clonase TM sehingga dalam metode Gateway reaksi rekombinasi pada donor vektor disebut juga reaksi BP (BP reaction). Reaksi BP menghasilkan suatu klon entri (pentr) yang diapit oleh dua situs attl (Lampiran 4). Hasil rekombinasi gen STS pada vektor donor kemudian ditransformasikan ke sel kompeten Escherichia coli galur XL1-Blue dengan perlakuan kejut panas (heat shock). Sel kompeten adalah sel yang telah mengalami perlakuan fisik atau kimiawi sedemikian rupa sehingga meningkatkan kemampuannya untuk mengambil DNA. Sel dapat dibuat kompeten biasanya dengan perlakuan garam CaCl 2 atau RbCl. Garam CaCl 2 menyebabkan presipitasi DNA pada permukaan luar sel dan menyebabkan perubahan tertentu pada dinding sel yang meningkatkan pengikatan DNA. Gerakan DNA menuju ke dalam sel distimulasi dengan menaikkan temperatur sampai 42 o C dalam waktu singkat atau kejut panas (Brown 1991). M a Gambar 6 Elektroforegram hasil ekstraksi dan purifikasi gen STS dari gel; (M) marker 1 Kb Plus DNA Ladder, (a) gen STSS berukuran 1500 pb.

19 10 E. coli merupakan mikroorganisme yang paling umum digunakan dalam industri bioteknologi dan dalam sebagian besar eksperimen kloning gen. E. coli dipilih karena beberapa alasan, yaitu memiliki ukuran genom yang relatif kecil, pertumbuhannya sangat cepat, relatif aman, sifat genetiknya telah banyak diketahui, dan mampu menjadi inang bagi DNA asing (Weaver & Hedrick 1989). Hasil transformasi ditumbuhkan pada media LA (Luria Agar) yang telah ditambahkan antibiotik kanamisin 50 ppm. Penambahan kanamisin dilakukan karena vektor donor yang digunakan (pdonr TM 221) memiliki marka seleksi resisten terhadap antibiotik tersebut (Lampiran 6). Seleksi transforman dilakukan dengan mengamati koloni yang tahan terhadap kanamisin sehingga tumbuh pada media LA yang telah ditambahkan kanamisin 50 ppm setelah diinkubasi. Koloni yang tumbuh semuanya berwarna putih (Gambar 7) dan hampir dipastikan merupakan klon entri yang membawa gen STS, sedangkan hasil samping (by product) tidak akan tumbuh sebagai koloni putih. Hal tersebut disebabkan oleh gen ccdb yang mengganggu kerja enzim DNA gyrase pada E. coli sehingga pertumbuhannya terhambat (Bernard & Couturier 1992). Koloni yang tumbuh diduplikasi dan dikultur untuk memperbanyak jumlah plasmid rekombinan. Hasil duplikasi kemudian diuji dengan metode PCR koloni untuk membuktikan plasmid rekombinan telah tersisipi gen STS. Koloni yang terbukti membawa plasmid rekombinan kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk direkombinasikan ke dalam vektor destinasi melalui tahap rekombinasi LR. Plasmid rekombinan (pentr) yang telah diapit oleh situs attl1 dan situs attl2 direaksikan dengan vektor destinasi yang memiliki situs attr1 dan situs attr2. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim LR Clonase TM yang Gambar 7 Koloni yang tumbuh setelah reaksi BP pada metode Gateway. disebut juga reaksi LR (LR reaction). Reaksi LR menghasilkan suatu klon ekspresi (pexpr) yang diapit oleh dua situs attb (Lampiran 5). Hasil rekombinasi gen STS pada vektor destinasi kemudian ditransformasikan juga kekanamisin sehingga seleksi transforman juga dilakukan dengan melihat koloni putih yang dapat tumbuh pada media tersebut (Gambar 8). Koloni yang tumbuh relatif sedikit disebabkan oleh sel kompeten yang digunakan telah berkurang keefektifannya. Koloni yang tumbuh diduplikasi untuk menyimpan koloni yang membawa gen sisipan agar tidak terkontaminasi, selanjutnya juga dilakukan pengujian plasmid rekombinan dengan metode PCR koloni. Gambar 8 Koloni yang tumbuh setelah reaksi LR pada metode Gateway. Hasil Konfirmasi Koloni Transforman Reaksi BP dengan Metode PCR Koloni dan Isolasi DNA Plasmid Rekombinan PCR koloni dilakukan untuk memastikan bahwa koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam E. coli mengandung plasmid rekombinan. Metode PCR koloni yang dilakukan setelah reaksi BP menggunakan sepasang primer universal M 13 karena peta vektor donor (pdonr TM 221) menunjukkan bahwa amplifikasi dengan PCR koloni memerlukan primer M 13 -Forward dan primer M 13 -Reverse (Lampiran 6). Elektroforegram PCR koloni setelah reaksi BP menunjukkan bahwa ada 7 dari 14 koloni yang diujikan mengandung gen STS. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita berukuran sekitar 1500 pb setelah elektroforesis. Namun dari 7 koloni hanya 2 koloni sajaa yang benarkoloni nomor benar bersih dari pengotor, yaitu 2 dan nomor 14 (Gambar 9). Koloni bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan selanjutnyaa dikulturkan ke dalam media Luria Bertani (LB) cair yang berisi sumber nutrisi untuk membantu pertumbuhan bakteri. Media LB merupakan

20 pb 1650 pb 1000 pb pada tahap rekombinasi LR ini ada tiga, yaitu pgd625, parc983, dan pdest. Tahapan PCR koloni ini memungkinkann konfirmasi koloni bakteri yang tumbuh sekaligus amplifikasi gen STS yang disisipkan dalam vektor destinasi dengan primer spesifik. Elektroforegram PCR koloni setelah reaksi LR pada gen STS yang disisipkan dalam pgd625 menunjukkan bahwa 3 dari 3 koloni 100 pb M Gambar 9 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada vektor donor; (M) marker 1 Kb Plus DNA Ladder, (1-14) koloni bakteri. media kompleks karena terdiri atas tripton, ekstrak yeast (ragi), dan NaCl. Tripton berfungsi sebagai sumber asam amino dan peptida, sedangkan ekstrak yeast menyediakan kebutuhan nitrogen, gula, serta nutrien organik dan anorganik (Brown 1991). Hasil kultur koloni dalam media LB kemudian diisolasi DNA plasmidnya untuk direkombinasikan pada vektor destinasi. Isolasi DNA plasmid, yang dilakukan dengan kit GeneJET TM Plasmid MiniPrep dari Fermentas, pada prinsipnya hampir sama dengan isolasi DNA kromosom. Perbedaannya adalah ukuran DNA plasmid lebih kecil dari DNA kromosom, dan konformasi keduanya berbeda. Hasil elektroforesis isolat DNA plasmid menghasilkan suatu pita, yang menunjukkan bahwa DNA plasmid telah berhasil diisolasi. Elektroforesis hasil isolasi plasmid sebenarnya bertujuan untuk mengecek secara kualitatif keberhasilan isolasi plasmid. DNA plasmid yang telah diisolasi selanjutnya direkombinasikan ke dalam vektor destinasi. Hasil Konfirmasi Koloni Transforman Reaksi LR dengan Metode PCR Koloni dan Isolasi DNA Plasmid Rekombinan Metode PCR koloni juga dilakukan untuk mengecek koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam E. coli pada tahap rekombinasi LR. Metode PCR koloni yang dilakukan setelah reaksi LR menggunakan sepasang primer spesifik Gateway, yaitu Gateway STS-Forward dan Gateway STSyang Reverse. Vektor destinasi digunakan M Gambar 10 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada vektor destinasi pgd625; (M) marker 1 Kb Plus, (1-3) koloni bakteri. M Gambar 11 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada vektor destinasi parc983; (M) marker 1 Kb Plus, (1-4) koloni bakteri.

21 pb M Gambar 12 Elektroforegram PCR koloni rekombinasi gen STS pada vektor destinasi pdest; (1-5) koloni bakteri, (M) marker 1 Kb Plus. yang diujikan semuanya mengandung gen STS. Hal ini ditunjukkan dengan pita yang berukuran sekitar 1500 pb pada elektroforegram (Gambar 10). Ukuran pita sekitar 1500 pb tersebut juga digunakan sebagai acuan untuk konfirmasi koloni bakteri yang mengandung gen STS pada vektor destinasi parc983 dan pdest. Elektroforegram menunjukkan bahwa 3 dari 4 koloni yang diujikan pada vektor destinasi parc983 (Gambar 11) dan 5 dari 5 koloni yang diujikan pada vektor destinasi pdest (Gambar 12) positif mengandung gen STS. Isolasi DNA plasmid kemudian dilakukan terhadap koloni bakteri yang positif mengandung gen STS. Hasil elektroforesis isolat DNA plasmid menunjukkan bahwa DNA plasmid telah berhasil diisolasi. DNA plasmid yang telah diisolasi selanjutnya ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens. Hasil Transformasi Klon Ekspresi ke dalam Agrobacterium tumefaciens galur AGL0 Transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens dilakukan untuk menguji ekspresi pengaruh gen sisipan pada tanaman. Sel Agrobacterium digunakan sebagai wahana yang membawa plasmid rekombinan untuk menginfeksi sel tanaman. Agrobacterium yang digunakan adalah galur AGL0 karena memiliki virulensi yang tinggi dibandingkan galur Agrobacterium lainnya. Transformasi klon ekspresi ke dalam A. tumefaciens menggunakan metode kejut dingin (cool shock) lalu dilanjutkan dengan metode kejut panas (heat shock). Lonjakan suhu dari sekitar -196 o C (inkubasi dalam N 2 cair) ke suhu 37 o C (inkubasi dalam water bath) menyebabkan membran sel Agrobacterium menjadi tidak selektif terhadap molekul asing sehingga plasmid rekombinan yang berisi gen sisipan dapat masuk. Campuran sel kompeten AGL0 dan klon ekspresi kemudian disebar ke media LA yang mengandung antibiotik kanamisin dan rifampisin lalu diinkubasi dalam kondisi gelap. Kanamisin digunakan karena vektor destinasi yang digunakan memiliki marka seleksi berupa resistensi terhadap antibiotik kanamisin, sedangkan rifampisin digunakan untuk membunuh E. coli. Inkubasi dalam keadaan gelap dilakukan karena A. tumefaciens merupakan bakteri tanah yang sensitif terhadap cahaya, sehingga perlu dikondisikan seperti habitat aslinya. Hasil transformasi menunjukkan terbentuknya koloni berwarna putih pada media LA yang mengandung kanamisin 50 ppm dan rifampisin 50 ppm (Gambar 13). Koloni yang tumbuh berjumlah masingmasing 1 koloni untuk setiap vektor destinasi yang digunakan. Koloni yang tumbuh merupakan koloni yang mengandung klon ekspresi, yaitu klon yang membawa gen STS. Jumlah koloni yang tumbuh di media saat transformasi ke A. tumefaciens lebih sedikit dibandingkan saat transformasi ke E. coli. Hal ini terjadi karena A. tumefaciens memiliki jumlah salinan (copy number) yang lebih sedikit dibandingkan dengan E. coli (Brown 1991). Koloni bakteri yang tumbuh kemudian diuji dengan metode PCR koloni untuk memastikan bahwa koloni tersebut mengandung klon ekspresi. Primer yang digunakan adalah primer spesifik Gateway. Gambar 13 Koloni bakteri yang tumbuh setelah transformasi ke dalam Agrobacterium tumefaciens.

22 DAFTAR PUSTAKA Bernard P, Couturier M Cell killing by the F plasmid ccdb protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. J. Mol. Biol. 226: [Biotek UnUd] Bioteknologi Universitas Udayana Mekanisme molekuler induksi tumor crown gall oleh Agrobacterium tumefaciens. [terhubung berkala]. [4 April 2011]. M Gambar 14 Elektroforegram PCR koloni hasil transformasi gen STS ke dalam Agrobacterium tumefaciens; (M) marker 1 Kb Plus, (1) koloni pgd625, (2) koloni parc983, (3) koloni pdest. Elektroforegram PCR koloni menunjukkan bahwa setiap koloni yang diujikan mengandung gen STS yang disisipkan karena pita yang dihasilkan berada pada kisaran 1500 pb (Gambar 14). A. tumefaciens yang telah mengandung gen STS selanjutnya disimpan dalam stok gliserol pada suhu sekitar -70 o C untuk kemudian ditransfer ke dalam tanaman pada penelitian selanjutnya. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Gen stilbena sintase (STS) telah berhasil disisipkan pada vektor ekspresi dengan menggunakan metode Gateway. Hal tersebut ditunjukkan oleh hasil konfirmasi gen STS setelah reaksi BP maupun reaksi LR yang menunjukkan hasil sekitar 1500 pb. DNA plasmid dalam vektor ekspresi juga telah berhasil ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens sehingga siap ditransfer ke dalam tanaman. Saran Penelitian lebih lanjut tentang transformasi Agrobacterium tumefaciens ke dalam tanaman perlu dilakukan untuk mengetahui keberhasilan ekspresi gen stilbena sintase (STS) dalam hal membuat tanaman resisten terhadap penyakit busuk pangkal batang. Breuil AC et al Characterization of a pterostilbene dehydrodimer produced by laccase of Botrytis cinerea. Phytopathology 89: Brown TA Pengantar Kloning Gena. Muhammad SA, penerjemah; Praseno, editor. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica. Terjemahan dari: Gene Cloning an Introduction. Deacon J Biology and control of crown gall (Agrobacterium tumefaciens). [terhubung berkala]. [4 April 2011]. Donepudi A What is a PCR? [terhubung berkala]. [2 April 2011]. Escobar MA, Dandekar AM Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Plant Scie. 8: Ferguson KA Starch-gel electrophoresis-application to the classification of pituitary proteins and polypeptides. Metabolism 13(10): Fermentas GeneJET TM Plasmid MiniPrep Kit. Canada: Life Science. Hain R et al Disease resistance results from foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature 361: Hartley JL, Temple GF, Brasch MA DNA cloning using in vitro site-spesific recombination. Genome Research 10: [HGP] Human Genome Project Cloning fact sheet. [terhubung berkala]. [31 Maret 2011].

23 14 Invitrogen Gateway Technology: A universal technology to clone DNA sequence for functional analysis and expression in multiple systems. California: Life Technologies. Invitrogen Platinum Taq DNA Polymerase. California: Life Technologies. Invitrogen PureLink TM Quick Gel Extraction Kit. California: Life Technologies. Jones HD, Doherty A, Wu H Review of methodologies and a protocol for the Agrobacterium-mediated transformation of wheat. Plant Methods. 1:5-14. Karimi M, Depicker A, Hilson P Recombinational cloning with plant gateway vectors. Plant Physiol. 145: Kennedy S, Oswald N PCR Troubleshooting and Optimization: The essential guide. Norwich: Caister Academic Pr. Kolpack A, Loschelder H Gateway- Technologie: potenzial und anwendungen in der molekularen pflanzenforschung. [terhubung berkala]. [14 April 2011]. Landy A Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-spesific recombination. Ann. Rev. Biochem. 58: Lewis M DNA extraction from agarose gels (basic method). [terhubung berkala]. [14 Agustus 2011]. Lilis E Konstruksi DNA rekombinan pcambia 1303-stilbena sintase pencegah busuk akar kelapa sawit [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Lubis AU Kelapa Sawit di Indonesia. Sumatera Utara: Pusat Penelitian Perkebunan Marihat. McCullen CA, Binns AN Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22: McPherson M, Moller S PCR. Second Edition. Abingdon: Taylor & Francis Group. Nester E Agrobacterium: the natural genetic engineer 100 years later. [terhubung berkala]. [4 April 2011]. [PPKS] Pusat Penelitian Kelapa Sawit Penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit (Ganoderma boninense) dan pengendaliannya. [terhubung berkala]. [24 Desember 2010]. Rolfs C, Kindl H Stilbene synthase and chalcone synthase. Plant Physiol. 75: Rothman B Agarose gel electrophoresis. [terhubung berkala]. [3 April 2011]. Sambrook J, Russell DW Molecular Cloning: A laboratory manual. Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Sbaghi M, Jeandet P, Faivre B, Bessis R, Fournioux JC Development of methods using phytoalexin (resveratrol) assessment as a selection criterion to screen grapevine in vitro cultures for resistance to grey mould (Bortrytis cinerea). Euphytica 86: Schubert R et al An ozone-responsive region of the grapevine resveratrol synthase promoter differs from the basal pathogen-responsive sequence. Plant. Mol. Biol. 34: [SIB] Swiss Institute of Bioinformatics Stilbene synthase. [terhubung berkala]. [25 Januari 2011]. Smith JE Biotechnology. Fourth Edition. Inggris: Cambridge University Pr. Triastuti J Pengklonan gen. [terhubung berkala]. [31 Maret 2011]. Weaver R, Hedrick P Genetics. Iowa: Wm. C. Brown Publishers.

24 15 Winarno FG, Agustinah W Pengantar Bioteknologi. Edisi Revisi. Bogor: M- BRIO Pr. Xu W et al Expression pattern, genomic structure, and promoter analysis of the gene encoding stilbene synthase from Chinese wild Vitis pseudoreticulata. J. Exp. Bot. 62(8): Yuwono T Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga. Yuwono T Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: Penerbit ANDI.

25 LAMPIRAN

26 17 Lampiran 1 Tahapan konstruksi gen stilbena sintase (STS) pada vektor donor Gen STS dari tanaman anggur (Vitis vinifera) Desain primer spesifik Gateway untuk gen STS Amplifikasi gen STS dengan primer spesifik Gateway Pengujian hasil amplifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% Ekstraksi dan purifikasi (elusi) gen STS dari gel agarosa Rekombinasi hasil elusi ke dalam vektor donor (pdonr TM 221) melalui reaksi BP Transformasi klon entri ke dalam sel kompeten Escherichia coli galur XL1-Blue Konfirmasi koloni transforman dengan metode PCR koloni Isolasi DNA plasmid Pengujian DNA plasmid dengan elektroforesis gel agarosa 1% Analisis sekuen DNA

27 18 Lampiran 2 Tahapan konstruksi gen stilbena sintase (STS) pada vektor destinasi dan transformasi ke Agrobacterium tumefaciens Rekombinasi klon entri ke dalam vektor destinasi (pgd625, parc983, dan pdest) melalui reaksi LR Transformasi klon ekspresi ke dalam sel kompeten Escherichia coli galur XL1-Blue Konfirmasi koloni transforman dengan metode PCR koloni Isolasi DNA plasmid Pengujian DNA plasmid dengan elektroforesis gel agarosa 1% DNA plasmid ditransformasikan ke dalam sel kompeten Agrobacterium tumefaciens galur AGL0 Konfirmasi koloni transforman dengan metode PCR koloni

28 19 Lampiran 3 Primer yang dirancang berdasarkan metode Gateway Primer Forward : GGGG CCA ACT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T pb dari gen----- attb1 Primer Reverse : GGGG CC AAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT pb dari gen----- attb2 Primer GTW STS Forward : GGGG CCA ACT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T ATGGCTTCAGTGGAGGAGTT Primer GTW STS Reverse : GGGG CCA ACT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T ATTAGGAATAAATGTTTGGG

29 20 Lampiran 4 Reaksi BP pada metode pengklonan Gateway atau ilustrasi lainnya:

30 21 Lampiran 5 Reaksi LR pada metode pengklonan Gateway atau ilustrasi lainnya:

31 Lampiran 6 Peta marka seleksi vektor donor (pdonr TM 221) 22

32 Lampiran 7 Hasil analisis tingkat homologi sekuen gen menggunakan BLAST 23