Metoda dalam Biologi Molekuler. Erlia Narulita, PhD

Transkripsi

1 Metoda dalam Biologi Molekuler Erlia Narulita, PhD

2 Tahap isolasi gen Isolasi DNA total Memotong DNA Potongan DNAà ligasi (kloning) ke dalam vektor (misal: plasmid/bacteriophage) Isolasi DNA total Perbanyakan dg metoda PCR Fragmen hasil PCR à klon ke dalam plasmid Isolasi RNA total Reverse Transcriptase (RT) PCR Transfer vektor ke dalam sel inang (transformasi) Seleksi sel inang yang mempunyai vektor+ insert Identifikasi gen tertentu dg Southern blotting 1. Seleksi dengan antibiotik 2. Seleksi putih-biru 3. Analisis dengan enzim restriksi Sekuensing urutan DNA 2005-Biologi ITB

3 1. Isolasi DNA/RNA 2. PCR 3. Elektroforesis 4. Memotong & Menyambung DNA 5. Vektor, kloning ke dalam plasmid 6. Transformasi & seleksi 7. Southern/Northern blotting 8. Sekuensing urutan DNA

4 Istilah klon Greek: Klon = twig (ranting) à stek Kultur jaringan merupakan teknik kloning tumbuhan/hewan 1973 : Stanley Cohen dkk berhasil memperbanyak satu potong DNA dalam sel bakteri DNA dapat bereplikasi sama seperti aslinya dalam sel bakteri untuk kemudian dapat diisolasi dan digunakan sesuai kebutuhan

5 1. Isolasi genomik DNA/RNA Jaringan hewan/bakteri /tumbuhan Jaringan hewan/bakteri / tumbuhan Penghancuran membran dalam bufer ekstraksi+detergen Penghancuran membran dalam bufer ekstraksi+detergen Ekstraksi fenol-kloroform Ekstraksi fenol-kloroform Tambahkan oligo dt Pencucian pelet DNA dengan etanol 75% RNA & oligo dt ditransfer ke kolom Elusi RNA dgn bufer elusi Ekstraksi fenol-kloroform dan pencucian pelet mrna dgn etanol 75%

6 As. Nukleat terutama RNA dr organisma dapat dgn mudah terdegradasi selama isolasi à perlu mencegah degradasi oleh nuklease selama isolasi u/ RNA, misalnya dengan penambahan: Bufer mgdng protease u/ menghlgkan nuklease Inhibitor RNAse PVP u/ DNA digunakan 2-mercaptoetanol, SDS, DTT Menghilangkan RNA dr DNA hasil isolasi dgn RNAse atau centrifugasi pada gradien CsCl

7 Isolasi RNA spesifik dg metoda afinitas Populasi RNA dapat difraksionasi menjadi spesifik RNA misal : isolasi mrna dengan adanya ujung poly A Penambahan nukleotida analog sbg marker spesifik sblm ekstraksi: RNA disintesis in vitro dengan penambahan nukleotida analog (memiliki grup sulfidril dan biotin yg berikatan ke mercuri dan streptavidin pd kolom matrik/butiran magnet) utk membedakannya dg RNA lain

8 mrna dengan kolom kromatografi

9 2. PCR Biologi Molekuler 2005-Biologi ITB

10

11 A. Horisontal 3. Elektroforesis

12 Pemisahan DNA Pemisahan DNA untuk isolasi dan analisis dgn metoda elektroforesis DNA fragmen yang linier dipisahkan berdasarkan ukuran lewat gel agar agarorosa atau poliakrilamida Agarosa adalah polisakarida dari rumput laut dg konsentrasi 0.5% to 2% (mass/volume i.e. 0.5 to 2.0 g agarose/100 ml of aqueous buffer) biasa dipakai utk memisahkan DNA berbagai ukuran Pemisahan DNA dilakukan dari kutub positif à kutub negatif dengan voltage tertentu karena DNA bermuatan negatif DNA yg telah dielektroforesis dapat diwarnai dg metoda kimia ethidium bromide yang berikatan pada DNA (DNA chelator) Sinar UV yang berflouresence dpt digunakan utk deteksi DNA

13 B. Vertikal

14

15 4. Memotong DNA Endonuklease ditemukan pertama kali 1960, Stewart Linn dan Aber Werner pada E. coli. Berasal dari bakteri yang resisten terhadap bacteriophage Endonuclease : memotong di bagian dalam DNA

16 Sayangnya penemuan Linn & Arber tidak memenuhi harapan: endonuklease yang ditemukan tidak spesifik memotong DNA pada sekuense tertentu. Gunting molekuler pertama ditemukan adalah Hind diisolasi dari Haemophilus influenzae strain R d. Hind endonuklease dapat terdiri dari 3 macam masing masing memiliki spesifikasi pengenalan terhadap sekuens tertentu

17 Macam-macam endonuklease HindII (Py =TC; Pu=AG) HindIII GTPy PuAC A AGCTT MboI (frekuensi tinggi) SmaI dan XmaI (Isoschizomers) GATC CCC GGG

18 5. Menyambung DNA Ligase Berasal dari Bacteriophage (T4) Membentuk 2 ikatan kovalen antara ujung 3 OH satu nukleotida dengan ujung 5 fosfat dari nukleotida lain ATP diperlukan u/ reaksi

19 6. Vector Ciri-ciri: DNA Dapat bereplikasi sendiri Dapat disisipi DNA asing Ada marker: mendeteksi adanya vektor mendeteksi adanya DNA asing Macam-macam marker gen resistensi antibiotik gen lacz (βgalaktosidase) gen untuk sintesis asam amino Macam-macam vektor Plasmid Virus Kombinasi plasmid dan virus

20 Vector λ phage Charon phage λ phage dapat melakukan klon DNA ukuran 12 Kb s/d 20 Kb ( pb), bandingkan dengan plasmid hanya Kb. Cosmid DNA insert dimasukkan pada Cos site dari λ phage DNA Dapat mengklon DNA dengan ukuran kb

21 Northern & Southern Blotting 21

22 Pendahuluan Blot/Blo'ng Pengertian Berdasarkan Tipenya, terdiri atas : Teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, protein ke lembaran tipis atau matriks membran. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel. 1 2 Southern Blo'ng (DNA) Northern Blo'ng (RNA) 3 Western Blo'ng (Protein) 22

23 Southern Blotting (DNA) Southern Blo'ng (DNA) Penger&an dan Sejarah Komponen-Komponen Tahapan dan Mekanisme Kerja 23

24 Keuntungan teknik blot : a) Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks. b) Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan. c) Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat lebih singkat. d) Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis. e) Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode analisis yang dipakai 24

25 Pengertian dan Sejarah Southern Blotting (DNA) Southern Blo'ng (DNA) Sejarah Pengertian Sebuah metode yang sering digunakan dalam bidang Biologi Molekular untuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA. Metode ini ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris y a n g bernama Edward M. Southern, y a n g mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh Edward M. Southern Southern Blo'ng (DNA) 25

26 Komponen-Komponen utama pada Southern Blotting (DNA) Membran Nitroselulosa Membran Nitroselulosa digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen DNA dari gel agarosa DNA probe Ø Merupakan sutau fragmen dna yang berfungsi sebagai pelacak target gen Ø Harus bersifat spesifik dan komplemen terhadap DNA target 26

27 Lanjutan... Larutan Buffer Larutan buffer berfungsi untuk membawa DNA dari gel dan mengimobilisasi DNA pada membran (Larutan akan bergerak dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah) DNA Merupakan materi atau molekul yang akan diidentifikasi pada tekhnik Southern Blotting Enzim Retriksi Berfungsi untuk memotong DNA menjadi suatu fragmen tertentu 27

28 Tahap- tahap Southern Blotting (DNA) 1 Isolasi DNA dan Pemotongan DNA 2 Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis 3 Transfer DNA ke Membran (Blot) 4 5 Hibridisasi DNA Deteksi DNA 28

29 1 Tahap 1 Isolasi DNA dan Pemotongan DNA Tahap untuk memperoleh DNA yang akan dideteksi. Pemotongan DNA yang ingin diperoleh dilakukan dengan menggunakan enzim retriksi (endonuklease retriksi) yang bersifat spesifik terhadap DNA 29

30 Tahap 2 2 Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis gel Ø Merupakan tahap dimana Fragmen-fragmen dari DNA akan terpisah berdasarkan ukuran berat molekulnya. Ø Berdasarkan prinsip elektroforesis, Fragmen DNA yang ukuran berat molekulnya lebih kecil akan lebih cepat bergerak dari kutub negatif kekutub positif dibandingkan dengan fragmen DNA dengan berat molekul lebih besar. 30

31 Denaturasi DNA Ø Proses denaturasi DNA dilakukan dengan merendam gel dalam larutan denaturan (NaOH ) Ø NaOH bersifat basa sehingga dapat menyebabkan rusaknya ikatan hidrogen antar untai DNA Ø Ikatan hidrogen antar untai DNA yang putus menyebabkan struktur DNA yang semula double heliks menjadi DNA single strand 31

32 Tahap 3 Transfer DNA ke Membran nitroselulosa DNA yang telah diperoleh kemudian ditransfer ke membran nitroseluloasa, tahap inilah yang disebut dengan blotting. Tahap ini dapat dilakukan dengan 2 pilihan metode, yaitu: Berdasarkan prinsip Kapilaritas Berdasarkan prinsip elektroforesis 32

33 Gel agarosa dijiplak pada membran nitroselulosa Ø Merupakan salah satu metode tahapan transfer DNA ke membran nitroselulosa yang berdasarkan pada prinsip Kapilaritas Ø Kapilaritas adalah peristiwa naiknya zat cair pada pembuluh, celah atau pori-pori kecil 33

34 Tahap 4 4 Hibridisasi DNA Ø Hibridisasi DNA adalah proses pembentukan molekul double helix dari single strand DNA probe dan single strand DNA target Ø Tahap ini terjadi ketika membran nitroselulosa direndam dalam larutan yang berisi probe DNA Ss* (diberi radioisotop) 34

35 Tahap 5 5 Deteksi DNA Ø Merupakan tahap lanjutan dari proses hibridisasi DNA yang menggunakan pelacak/probe Ø Probe biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Ø Pada tahap deteksi DNA digunakan Autoradiogram untuk melihat lokasi sinyal DNA 35

36 Southern Blotting (DNA) Northern Blo'ng (RNA) Penger&an dan Sejarah Komponen-Komponen Tahapan dan Mekanisme Kerja 36

37 Pengertian dan Sejarah Northern Blotting (RNA) Northern Blo'ng (RNA) Pengertian Ø Secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot, akan tetapi sampel yang digunakan, yaitu RNA. Sejarah Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali oleh Alwin pada tahun 1977 Ø Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua, atau sebagian, dari urutan mrna target

38 Komponen-Komponen utama Membran Ø Membran digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen RNA dari gel agarosa formaldehid Ø Membran yang digunakan pada Northern blooting adalah nilon Formaldehid Probe Nilon Ø Probe atau RNA probe adalah fragmen yang digunakan untuk hibridisasi asam nukleat Ø Probe dilengkapi semua, atau sebagian, urutan basa komplementer dari urutan mrna target.

39 Tahap- tahap Northern Blotting 1 2 Isolasi RNA Elektroforesis 3 Transfer ke membran dan imobilisasi 4 Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe 5 6 Pencucian Deteksi

40 1 Isolasi RNA Isolasi RNA dapat dilakukan dengan beberapa tahap berikut, yaitu : Penghancuran dinding sel Ø Lisis dilakukan menggunakan detergen Ø Pengotor akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi Ø Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) dipisahkan dari protein menggunakan fenol Penghilangan protein dan DNA Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNA sehingga RNA diisolasi secara utuh Pemurnian RNA Purifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan.

41 2 Elektroforesis Merupakan tahap dimana RNA dielektroforesis menggunakan gel agarosa formaldehida Formaldehida Gel dapat diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan dilihat di bawah sinar UV untuk mengamati kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.

42 3 Transfer ke membran dan imobilisasi q Tahap dimana RNA yang sebelumnya telah berhasil diisolasi kemudian ditransfer ke membran nilon q Membran nilon dengan muatan positif paling efektif untuk digunakan dalam northern blot karena asam nukleat bermuatan negatif sehingga memiliki afinitas tinggi. Setelah RNA ditransfer ke membran, maka membran harus segera disiapkan untuk crosslink RNA dengan sinar UV Tujuan crosslink RNA adalah untuk membuat RNA terikat kuat di membran q Transfer buffer yang digunakan mengandung formamida karena menurunkan suhu dari interaksi probe-rna yang dapat menyebabkan degradasi RNA. Nilon Formamida

43 4 Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe q Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe ini melengkapi semua atau sebagian, dari urutan mrna target Tujuan dilakukannya prehibridisasi sebelum hibridisasi adalah memblok bagian nonspecific untuk mencegah probe yang single strand dari mengikat sembarang bagian pada membran. q Probe harus diberi label baik dengan isotop radioaktif (32P) atau dengan chemiluminescence di mana alkali fosfatase atau horseradish peroxidase (HRP) memecah chemiluminescent substrat menghasilkan emisi terdeteksi cahaya

44 5 Pencucian q Tujuan dari pencucian membran adalah untuk memastikan bahwa probe telah terikat secara khusus dan untuk mencegah sinyal balik yang timbul q Hal ini juga dilakukan untuk menghilangkan unhibridisasi probe, dengan larutan buffer misalnya dengan Sodium Citrate

45 6 Deteksi Tahapan deteksi dalam Northern Blot dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu : RadioakMvi tas Non-radioakMf Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot disimpan dalam bungkus pastik agar tidak kering kemudian membran di autoradiografi dengan X-ray Probe ditandai dengan 32P (atau 33p) Deteksi dilakukan dengan pewarnaan, misalnya dengan teknik chemiluminescence

46 Perbedaan Tekhnik Southern dan Northern Blotting Southern Blo'ng Northern Blo'ng Deteksi molekul DNA (ds) mrna (ss) Membran Nitroselulosa Nilon Elektroforesis gel Gel agarosa Gel agarosa formaldehid Perawatan gel Pemurnian, denaturasi dan netralisasi - Metode blofng Transfer melalui kapiler Transfer melalui kapiler Probes Sistem deteksi DNA (radioak&f dan nonradioak&f) Autoradiography, Chemiluminescent Colorimetric cdna, crna (radioak&f dan nonradioak&f) Autoradiography Chemiluminescent Colorimetric

47 Summary Southern DNA on membrane. Digest DNA. Convert dsdna to ssdna. Probe with DNA or RNA. Northern RNA on membrane. No need to digest DNA. Denature folded RNA with formaldehyde. Probe with DNA or RNA. 47