RESPON METABOLIT ANTI PATOGEN PADA AKAR TUSAM AKIBAT PENGIMBASAN INTERAKSI SIMBIOTIK MIKORISA. Fakultas Kehutanan Universitas Gadjah Mada

Transkripsi

1 RESPON METABOLIT ANTI PATOGEN PADA AKAR TUSAM AKIBAT PENGIMBASAN INTERAKSI SIMBIOTIK MIKORISA Fakultas Kehutanan Universitas Gadjah Mada

2 LATAR BELAKANG Sehat Masa sukulen panjang Peka terhadap patogen Tergantung pada mikorisa? Pinus merkusii Jungh. et de Vriese MEKANISME? Mikorisa Ekto

3 Landasan Teoritis T r i c h o d e r m a Antagonisme Kompetisi Antibiosis Parasitisme Sintesis hormon Patogenesis Inokulasi Inkubasi Infeksi Kompetisi/ antibiosis Kompetisi/ antibiosis Blocking Kimiawi Fisik M i k o r i z a

4 Tujuan 1. Isolasi fitoaleksin enzim β-1,3-glukanase dan kitinase sebagai respon infeksi jamur pembentuk mikorisa pada tusam. Aktifitas fitoaleksin enzim β-1,3-glukanase dan kitinase terhadap jamur penyebab rebah semai secara in vitro. Pengaruh inokulan mikorisa terhadap perkembangan Fusarium sp ; Rhizoctonia sp. dan pertumbuhan semai tusam. Pengaruh T. reesei sebagai biokontrol terhadap pembentukan mikorisa Pengaruh waktu inokulasi terhadap interaksi antagonistik antara T. reesei dengan jamur rebah semai (Fusarium sp. dan R. solani)

5 METODE Induksi Tanaman fitoaleksin kitinase β-1, 3-glukanase Trichoderma Interaksi Jamur mikorisa In vitro In vivo Pembentukan mikorisa Patogen Tahun I T-14 T T+14 Trc Trc Mi Trc

6 Tahun 2 Interaksi mikorisa Ekto Pembentukan mikorisa Induksi Tanaman * fitoaleksin Metabolit sekunder * Pathogenesis Related Protein ß- 1,3-glukanase

7 Tahun 3 Interaksi mikorisa Ekto Pembentukan mikorisa Induksi tanaman Trichoderma Patogen damping off Waktu Metabolit sekunder * Pathogenesis Related Protein kitinase

8 Metode Khusus fitoaleksin Ekstraksi menurut Keen et al. cit. Nonaka dan Matsuzaki (1976) Akar (1 gr) + etanol 7% (5ml), rendam 24 jam Saring Evaporasi (4 o ) sampai ¼ volum semula Ekstraksi dengan petrolium ether Evaporasi (4 o C) Materi kering + etanol Larutan fitoaleksin kasar dlm etanol

9 Metode Khusus 1-3 β glukanase Ekstraksi Pathogenesis-Related Protein Ekstraksi menggunakan metode Vannini et al. (1999). Dialisis menggunakan metode Colligan et al.(1996). Isolasi β-1,3-glukanase Kromatografi gel filtrasi mengacu pada metode Colligan et al. (1996) dan Harjono (2) dengan modifikasi Karakterisasi β-1,3-glukanase SDS-PAGE mengacu pada metode Laemli (197) Karakterisasi ph optimal aktifitas enzim mengacu pada metode Aono et al. (1995) dan Fontaine et al. (1997) dengan modifikasi. Karakterisasi suhu optimal aktifitas enzim.

10 Metode khusus kitinase Inokulasi mikorisa pd tusam Panen, 4,6,8, minggu Aktivitas kitinase. Deteksi isoform kitinase Akar dipotong, dimsukkan dlm 8 C Ekstraksi crude protein Pengendapan am. sulfat Karakterisasi, BM, ph, suhu optimum, aktifitas antifungal kitinase pada R. solani & Fusarium sp. Dialisis, pemekatan PEG Kromatografi gel filtrasi sephacril S-3 HR

11 Uji in vivo antara jamur patogen, agen biokontrol dan jamur pembentuk mikorisa a. Inokulasi R.solani dan Fusarium sp. 15 hari sebelum semai ditanam b. Perlakuan : Faktor A - Tanah tidak bermikorisa (M ) - Tanah bermikorisa (M 1 ) Faktor B - Tanpa patogen (P ) - Dengan inokulasi R. solani (P 1 ) - Dengan inokulasi Fusarium sp. (P 2 ) Faktor C - Tanpa T. reesei (T ) - T. reesei bersama waktu penanaman semai (T 1 ) - 7 hari setelah penanaman semai - 14 hari setelah penanaman semai c. Pengamatan - Persen kematian semai

12 Hasil tahun pertama 6 6 Jumlah ujung akar W-14 Jumlah ujung akar Waktu (hari) Kontrol T1 T13 T Waktu (hari) W+14 Kontrol T1 T13 T27 Jumlah ujung akar W Waktu (hari) Kontrol T1 T13 T27 Perkembangan jumlah ujung akar semai tusam pada media tanpa inokulasi jamur mikorisa ekto W-14 : Introduksi Trichoderma 14 hari sebelum penambahan tanah steril. W : Introduksi Trichoderma bersama-sama dengan penambahan tanah steril. W+14 : Introduksi Trichoderma 14 hari setelah penambahan tanah steril.

13 Jumlah ujung akar Waktu (hari) W-14 Kontrol T1 T13 T27 Jumlah ujung akar Waktu (hari) W Kontrol T1 T13 T27 Jumlah ujung akar Waktu (hari) W+14 Kontrol T1 T13 T27 Perkembangan jumlah ujung akar semai tusam pada media yang diinokulasi jamur mikorisa ekto W-14 : Introduksi Trichoderma 14 hari sebelum penambahan tanah steril. W : Introduksi Trichoderma bersama-sama dengan penambahan tanah steril. W+14 : Introduksi Trichoderma 14 hari setelah penambahan tanah steril.

14 Aktifitas fitoaleksin thd persentase perkecambahan spora Fusarium sp Tusam Konsentrasi (%) Akar tidak bermikorisa Akar bermikorisa Pohon 63,67 71, 2 49, 46,7 1 32,33 26,67 4 2,67 17,33 8,67 1, 1 2,67, 4 minggu 85, 84, , 56, 1 51,33 66, ,67 5,33 8,,67 1,, 6 minggu 77,33 86, , 46,67 1 5, 56, ,66 26,33 8 2, 1, 1,, 8 minggu 88,33 94, 2 74,33 71, ,67 93, ,33 56, ,66 43,33 1 Keterangan : a) tiap perlakuan sumber ekstrak dan konsentrasi diukur 3 spora b) konsentrasi 2 % hanya dari etanol,,

15 Aktifitas fitoaleksin thd panjang buluh kecambah Fusarium sp. Tusam Konsentrasi (%) Akar tidak bermikorisa Akar bermikorisa Pohon 3,38 3,12 2 1,55 1,75 1,95,9 4,34,48 8,3,34 1,, 4 minggu 3,47 3,71 2 1,79 1,71 1 2,4 2,79 4 1,96,35 8,,34 1,, 6 minggu 3,42 3,62 2 1,77 1,66 1 2,9 1,6 4,71,99 8,61,39 1,, 8 minggu 3,51 3,73 2 1,65 1,63 1,5 4,49 4 2,8 1,65 8 1,91 1,5 1,, Keterangan : a) tiap perlakuan sumber ekstrak dan konsentrasi diukur 2 spora b) konsentrasi 2 % hanya dari etanol

16 Aktivitas β-1,3-glukanase dari crude protein No. Sampel Kadar Protein (µg/µ l) Aktivitas Enzim (µu) Aktivitas spesifik (µu/µg) 1 TM ,422 55, M4M, ,882 93, M6M, , , M8M, ,547 17, EP, , ,238 Keterangan : TM : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam tanpa mikorisa ; M4M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 4 minggu; M6M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 6 minggu; M8M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 8 minggu; EP : crude protein hasil ekstraksi dari akar tusam dewasa bermikorisa.

17 Isolasi β-1,3-glukanase OD 28 nm fraksi Aktivitas enzim pada tiap fraksi

18 Aktivitas β-1,3-glukanase dari hasil kromatografi 35 3, Aktivitas Enzim (µ U) ,5283 9, GFCA I GFCA II GFCA III Hasil Kromatografi Aktivitas b-1,3-glukanase Keterangan : GFCA I = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak pertama aktivitas enzim; GFCA II = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak kedua aktivitas enzim; GFCA III = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak ketiga aktivitas enzim.

19 Aktivitas β-1,3-glukanase dari hasil kromatografi,2,18,1818, , 3, 31,8119 Kadar Protein (µ g/µ l),16,14,12,1,8,6,551 Aktivitas spesifik (µ g/µ U) 25, 2, 15, 1, 16,711 6,1587,4,2, GFCA I GFCA II GFCA III 5,, GFCA I GFCA II GFCA III Keterangan : GFCA I = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak pertama aktivitas enzim; GFCA II = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak kedua aktivitas enzim; GFCA III = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak ketiga aktivitas enzim.

20 Karakterisasi β-1,3-glukanase hasil isolasi 5,5 log 1 Berat molekul protein standa 5, 4,5 4, y = -,274x + 5,132 R 2 =,9418 Marker GFC Results peak 2 Linear (Marker) 3, Mobilitas Relatif (mm) Hasil interpolasi kurva berat molekul protein standart menunjukkan bahwa β-1,3- glukanase hasil isolasi memiliki berat molekul 15 kd. GFCA II hasil isolasi kemudian disebut sebagai GLUC15

21 Karakterisasi β-1,3-glukanase hasil isolasi 8 7 Enzyme Activity ( µ U) Temperature Poly. (Temperature) Temperature ( o C ) Hasil karakterisasi pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa β-1,3- glukanase hasil isolasi memiliki kisaran suhu yang sempit untuk aktivitasnya. Suhu optimal untuk aktivitas enzim tersebut adalah 4 o C.

22 Karakterisasi β-1,3-glukanase hasil isolasi Enzyme Activity (µ U) ph Poly. (ph) ph Hasil karakterisasi pengaruh ph terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa β-1,3- glukanase hasil isolasi memiliki aktivitas optimal pada ph cenderung asam. ph optimal untuk aktivitas enzim tersebut adalah 6.

23 Karakterisasi β-1,3-glukanase hasil isolasi No. Sampel Persentase perkecambahan Fusariumsp. 1 Kontrol 68% 2 GLUC15 14,54% 3 M6M 17,32% 4 EP 12,86% Persentase perkecambahan konidia Fusarium sp. yang diinkubasikan dalam protein dari akar semai tusam (P. merkusii) yang berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto. GLUC15 = β-1,3- glukanase hasil isolasi dari akar semai tusam (P. merkusii); M6M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 6 minggu; EP : crude protein hasil ekstraksi dari akar tusam dewasa bermikorisa. Penghitungan persentase dilakukan dengan menjumlah konidia yang berkecambah dan tidak berkecambah dari tiga bidang pandang mikroskop dan dilakukan dengan dua kali perulangan.

24 Rerata persentase infeksi jamur mikorisa semai tusam (P. merkusii) umur 8 minggu setelah diinokulasi jamur mikorisa dan patogen Sumber variasi Tanah tidak bermikorisa Tanah bermikorisa Ulangan Rerata P 6,67 4,76, 3,81 P 1 4,7 9,9, 4,6 P 2 9,9, 7,14 5,41 P 5, 21,74 11,11 27,62 P 1 33,33 31,25 9,52 24,7 P 2 18,18 23,53 17,86 19,86 Keterangan : P : tanpa patogen P 1 : patogen Fusarium sp. P 2 : patogen Rhizoctonia sp.

25 Hasil tahun ketiga Aktivitas spesifik kitinase 1,8 Aktivitas spesifik (unit/mg),6,4,2 mikorisa tidak bermikorisa 4 M : 4 minggu 6 M : 6 minggu 8 M : 8 minggu 4M 6M 8M Sampel Aktivitas spesifik kitinase dari crude protein semai tusam bermikorisa dan tidak bermikorisa umur 4, 6 dan 8 minggu. Aktivitas kitinase diukur dengan menginkubasikan substrat enzim selama 3 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan DNS dan direbus selama 15 menit. Aktivitas kitinase diukur pada absorbansi 54, visibel.

26 Persentasi tingkat kejenuhan Ammonium Sulfat Aktivits spesifik kitin (Unit/mg) 1,2 1,8,6,4, Tingkat kejenuhan ammonium sulfat (%) Perbandingan aktivitas spesifik kitinase dengan tingkat kejenuhan 3, 5, 7 %.

27 Rekapitulasi pemisahan kitinase dari 5 g akar semai tusam Langkah pemurnian Protein total (µ g) Aktivitas kitinase (unit) Aktivitas spesifik (unit.mg -1 ) Tingkat pemurnian Recovery (%) Crude protein 1,293,16, Pengendapan amonium sulfat dan dialisis,777,96 1,166 1,422 85,47 Sephacril S-3 HR, 155,553 3,568 4,35 52,158

28 Suhu optimal Suhu Optimal Aktivitas spesifik kitina (Unit),1,9,8,7,6,5,4,3, Suhu C Nilai suhu optimal dicapai pada suhu 3 C. Konsentrasi protein yang digunakan untuk masing masing pengamatan adalah,156 µg ml -1. Data merupakan hasil rata rata dua ulangan percobaan

29 ph optimal ph Optimum Akltivitas spesifik kitinas (Unit), 9, 8, 7, 6, 5, 4, ph Nilai ph optimal dicapai pada ph 5. Konsentrasi protein yang digunakan untuk masing masing pengamatan adalah,156 µg ml -1. Data merupakan hasil rata rata dua ulangan percobaan.

30 Ringkasan hasil Akar tusam mengeluarkan senyawa fitoaleksin, β-1,3- glukanase dan kitinase dengan aktivitas yang lebih tinggi pada akar bermikorisa dibandingkan dengan akar tidak bermikorisa. Isolat enzim β-1,3-glukanase memiliki berat molekul 15 kd, kurang tahan terhadap pemanasan dan bekerja optimal pada ph cenderung asam. Sedangkan enzim kitinase memiliki berat molekul 52 kda, aktivitas optimum kitinase pada ph 5 dan suhu 3 C. Senyawa fitoaleksin, β-1,3-glukanase dan kitinase yang berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto memiliki aktivitas antifungal. Inokulasi jamur mikorisa dan introduksi T.reesei kedalam perakaran semai tusam dapat menghambat perkembangan patogen penyebab rebah semai (R. solani dan Fusarium sp.). Perlakuan ini tidak menimbulkan hambatan pembentukan dan perkembangan mikorisa apabila waktu aplikasi Trichoderma tepat. Pengendalian patogen penyebab penyakit rebah semai diperoleh dari inokulasi T.reesei pra tanam dan selanjutnya dapat meningkatkan perkembangan mikorisa.

31 Kesimpulan Inokulasi jamur pembentuk mikorisa ekto sangat berpotensi untuk meningkatkan ekspresi enzim yang berperan pada ketahanan semai tusam terhadap patogen.

32 Publikasi Naemah, D., S. M. Widyastuti dan Sumardi. 24. Pengaruh waktu aplikasi Trichoderma terhadap perkembangan mikoriza pada akar Pinus merkusii Jungh. et de Vriese. Agrosains BPPS. 16(2): Tektonia, R., S. M. Widyastuti dan Sumardi. 24. Pengaruh inokulasi mikoriza terhadap perkembangan penyakit rebah semai (Fusarium sp.) pada semai Pinus merkusii Jung. et de Vriese. Jurnal Fitopatologi.(accepted) Anggoro, M.D., S.M. Widyastuti dan S. Margino. 25. Isolasi dan karakterisasi β-1,3-glukanase akar semai tusam (Pinus merkusii jungh. et de vriese) yang berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia.(accepted) Handayani, A., S.M. Widyastuti dan S. Margino. 25. Isolasi dan karakterisasi kitinase akar tusam (Pinus merkusii Jungh. et de Vriese) yang bersimbiosis dengan jamur mikoriza-ekto. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia.(accepted) Suryantini, R., SM. Widyastuti dan Sumardi. 25. Pengaruh Waktu Inokulasi Trichoderma reesei terhadap Patogenisitas Jamur Lanas (damping-off) dan Perkembangan Mikorisa pada Semai Tusam (Pinus merkusii Jungh. et de Vries).Buletin Kehutanan.(accepted)

33 Publikasi... Widyaningsih, S., S.M. Widyastuti dan Sumardi. 25. Produksi fitoaleksin pada tusam (pinus merkusii jungh. et de vriese) sebagai respon infeksi jamur mikoriza. BIOTA. (submitted) Widyastuti, S.M., A. Handayani, Harjono dan Sumardi. 25. Aktivitas Anti Jamur Kitinase dan β-1,3-glukanase Akar Semai Tusam (Pinus merkusii Jungh. et de Vriese) yang Berasosiasi dengan Jamur Pembentuk Mikorisa Ekto. Jurnal Perlindungan Tanaman. (submitted) Widyastuti, S. M., Sumardi, Harjono dan D. Naemah. 25. Uji aktivitas biokontrol Trichoderma formulasi hasil reisolasi dari media semai tusam setelah 5 bulan aplikasi secara in vitro. Agr UMY. (submitted) Widyastuti, S. M., Sumardi dan R. Tektonia. 25. Uji awal aktivitas senyawa metabolit anti patogen akar tusam (Pinus merkusii Jung. et de Vriese.) akibat pengimbasan interaksi mikoriza ekto terhadap Fusarium sp. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia.(submitted)