BAHAN DAN METODE. Pembiakan P. fluorescens dari Kultur Penyimpanan

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor mulai bulan Februari hingga November Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang digunakan adalah limbah air kelapa, limbah air tahu, ekstrak limbah pengolahan ikan, P. fluorescens, S. rolfsii, Escherichia coli (DHα5), benih cabai varietas TM99, media King s B Agar, media PDA (Potatoes Dextrose Agar) dan Luria Broth (LB). Alat yang digunakan adalah cawan petri, laminar flow, tabung reaksi, micropipet, erlenmeyer dan rak penanaman untuk pembenihan cabai. Metode Penelitian Kegiatan yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi pembiakan P. fluorescens dari kultur penyimpanan, pembiakan P. fluorescens pada beberapa formulasi organik, uji keefektifan P. fluorescens sebagai pestisida hayati dan uji formulasi P. fluorescens dalam limbah organik terhadap pertumbuhan cabai. Pembiakan P. fluorescens dari Kultur Penyimpanan Penelitian ini menggunakan P. fluorescens sebagai bakteri terpilih untuk pengembangan probiotik tanaman. Isolat ini merupakan kultur stok yang dimiliki laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Dapartemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian IPB sebagai hasil penelitian sebelumnya (Giyanto et al. 1998). P. fluorescens dibiakkan pada medium King`s B Agar ( 20 g protease peptone, 1,5 g K 2 HPO 4, 1,5 g MgSO 4.7H 2 O, 15 ml Gliserol, 15 g Agar dan 1 liter aquades) dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 24 jam. Kemurnian isolat bakteri ditandai dengan koloni yang menghasilkan pigmen hijau kekuningan sebagai indikasi penghasil senyawa antibiotika dan siderofor. Koloni murni akan digunakan pada uji selanjutnya.

2 12 Pembiakan P. fluorescens pada Beberapa Formulasi Limbah Organik Formulasi limbah organik yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari tiga jenis limbah yaitu limbah air kelapa (AK), limbah air tahu (TH), dan limbah pengolahan ikan (LI). Limbah air kelapa diperoleh dari tempat penggilingan kelapa yang terdapat di pasar-pasar tradisional, limbah tahu diperoleh dari pabrik tahu yang terletak di daerah Cibanteng, Bogor. Sedangkan, limbah pengolahan ikan diperoleh dari pasar ikan desa Gebang, Cirebon. AK dan TH yang diambil dari lokasi segera diproses dengan penyaringan menggunakan kertas wattman no. 3, sedangkan limbah pengolahan ikan yang berupa campuran antara organ dalam ikan, sisik dan bagian ikan yang lain disiapkan dengan cara menghancurkan limbah pengolahan ikan tersebut menggunakan blender yang sebelumnya telah ditambahkan air dengan perbandingan LI : air (1:1). Campuran LI dan air tersebut selanjutnya direbus hingga mendidih selama 20 menit, kemudian disaring dengan kertas saring untuk memisahkan bagian padatan dan cairan. Bagian padatan dibuang sedangkan bagian cairan disimpan sebagai stok limbah LI dan stok tersebut dianggap 100% LI. Ketiga jenis limbah tersebut diformulasikan menjadi media untuk pertumbuhan bakteri P. fluorescens. Terdapat sembilan formulasi media pertumbuhan bakteri yang diuji pada penelitian ini (Tabel 1).

3 Tabel 1 Daftar formulasi media pertumbuhan bakteri yang digunakan dalam penelitian Formulasi Persentase Komposisi Limbah Organik (%) Keterangan AK TH LI F1 (LB) 0,0 0,0 0,0 Kontrol F2 100,0 0,0 0,0 Kontrol F3 0,0 100,0 0,0 Kontrol F4 50,0 50,0 0,0 Perlakuan F5 32,5 65,0 2,5 Perlakuan F6 25,0 73,0 2,0 Perlakuan F7 20,0 78,5 1,5 Perlakuan F8 15,0 84,0 1,0 Perlakuan F9 10,0 90,5 0,5 Perlakuan 13 Semua formulasi disesuaikan ph 7.0 dengan penambahan larutan NaOH 1 M. Pengujian formulasi limbah organik sebagai media biakan P. fluorescens dilakukan pada volume 50 ml pada erlenmeyer 250 ml yang sebelumnya telah disiapkan secara steril dengan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Formulasi diinokulasi P. fluorescens sebanyak 0.5 ml yang telah dikulturkan semalam pada 20 ml LB yang diinkubasikan pada inkubator bergoyang selama 12 jam dengan kecepatan 100 rpm. Kemudian setiap formulasi dilakukan penghitungan populasi P. fluorescens dengan teknik pengenceran berseri dan pencawanan pada media King s B 10 % pada jam ke-0, 2, 4, 6, 8 dan 10 dengan tiga kali ulangan dan masing-masing ulangan dilakukan secara duplo. Uji Keefektifan P. fluorescens sebagai Pestisida Hayati Uji penekanan S. rolfsii secara in-vitro. Formulasi P. fluorescens dalam beberapa komposisi limbah organik yang telah berhasil dirancang seperti terlihat dari hasil langkah kedua dari penelitian ini selanjutnya diuji keefektifannya dalam menekan perkembangan patogen S. rolfsii. Isolat S. rolfsii disiapkan dengan menumbuhkan sklerotia cendawan tersebut pada media Potato Dextrose Agar (PDA) lalu diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang untuk mempersiapkan isolat S. rolfsii. Isolat S. rolfsii yang siap pakai ditandai dengan adanya hifa yang tumbuh merata dan memenuhi cawan petri.

4 14 Formulasi P. fluorescens pada beberapa jenis kombinasi limbah organik disiapkan seperti pada langkah 2 tersebut di atas. Formulasi limbah organik yang telah disiapkan sebanyak 50 ml dalam 250 ml labu erlenmeyer dengan perbandingan PDB : formulasi media (1:1). Pada masing-masing formulasi limbah organik disiapkan 3 erlenmeyer yang akan digunakan sebagai satu unit perlakuan. Erlenmeyer pertama berisi formulasi media ditambah S. rolfsii, sedangkan pada erlenmeyer ke-dua sebelum diinokulasi S. rolfsii formulasi media tersebut diinokulasi dengan 0,5 ml biakan P. fluorescens yang telah dikulturkan semalam pada 20 ml media LB. Sebagai perbandingan digunakan E. coli DHα5 yang telah dikulturkan selama semalam pada 20 ml media LB kemudian diinokulasikan sebanyak 0,5 ml pada erlenmeyer ke-tiga sebelum diinokulasi S. rolfsii. Biakan S. rolfsii yang telah disiapkan selanjutnya diinokulasikan pada formulasi media yang telah disiapkan dan selanjutnya diinokulasikan pada formulasi media limbah organik tersebut dengan memasukkan inokulum S. rolfsii (diameter 0,5 cm) yang telah dibuat dengan pelubang gabus (cork borer). Media biakan yang telah diberi perlakuan tersebut selanjutnya diinkubasikan pada suhu ruang selama 1 minggu. Pengamatan dilakukan terhadap pertumbuhan miselium S. rolfsii pada setiap perlakuan. Pemanenan S. rolfsii dilakukan dengan penyaringan menggunakan kertas saring dan biomassa miselium cendawan ditimbang. Persen penghambatan pertumbuhan S. rolfsii dihitung berdasarkan rumus P = (M2-M1)/M2 x 100% (P: persen penghambatan pertumbuhan S. rolfsii; M2: bobot biomassa S. rolfsii pada media tanpa inokulasi P. fluorescens; dan M1: bobot biomassa S. rolfsii pada media dengan inokulasi P. fluorescens). Percobaan diulang sebanyak 3 kali. Uji penekanan rebah kecambah oleh S. rolfsii secara in-vivo. Percobaan dilakukan dengan menggunakan media tumbuh steril yang terdiri dari campuran tanah dan pupuk kandang (1:1). Media tumbuh steril diinokuasi dengan miselium cendawan S. rolfsii umur 7 hari dengan mencampurkan secara merata 3 cawan petri (diameter 9 cm) biakan S. rolfsii pada setiap 2 kg media tumbuh yang sebelumnya biakan cendawan patogen tersebut telah dihaluskan dengan blender (ditambahkan 10 ml air steril) selama 2 menit. Media yang telah diinokulasi dengan cendawan patogen ditempatkan pada baki plastik (ukuran 36 x 27 x 5 cm) yang telah dilubangi bagian bawahnya untuk drainase air. Benih cabai merah

5 15 Varietas TM 99 direndam semalam dalam biakan P. fluorescens pada berbagai formulasi limbah organik (F1 F9) yang telah disiapkan sebelumnya. Benih selanjutnya ditiriskan dan ditanam pada media tumbuh yang telah diinokulasi dengan patogen S. rolfsii. Setiap baki ditanam 100 benih cabai sebagai satu unit perlakuan. Perlakuan diulang 3 kali dan disusun dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Parameter yang diamati adalah persentasi kemunculan benih cabai pada media tumbuh dari benih cabai yang telah diberi perlakuan dengan P. fluorescens yang dibiakan pada berbagai jenis komposisi limbah organik. Uji Formulasi P. fluorescens dalam Limbah Organik Terhadap Pertumbuhan Cabai Uji pengaruh formulasi P. fluorescens terhadap kemunculan bibit (seed emergence) cabai. Pengujian pengaruh P. fluorescens pada beberapa formulasi limbah organik (F1-F9) terhadap perkecambahan benih cabai diuji dengan menggunakan media steril yang merupakan campuran antara pupuk kandang dan tanah dengan perbandingan 1:1 pada rak pembibitan. Penyiapan formulasi P. fluorescens dilakukan seperti pada pengujian sebelumnya. Benih cabai varietas TM 99 direndam semalam dengan formulasi P. fluorescens. Benih ditiriskan pada kertas tissue steril dan ditanam pada rak pembenihan yang sebelumnya telah diisi dengan media tanam steril. Jumlah benih cabai yang berkecambah diamati setiap hari hingga tanaman berumur 2 MST. Uji pengaruh formulasi terpilih P. fluorescens terhadap vigor bibit cabai. Formulasi terpilih dengan potensi terbaik selanjutnya dimodifikasi dengan penambahan 1% filtrat orok-orok (Crotalaria sp.) kemudian dilakukan pengujian lanjutan tentang aspek pengaruhnya terhadap vigor benih cabai. Penambahan filtrat orok-orok ini diharapkan mampu memberi nutrisi tambahan bagi P. fluorescens. Ada tiga perlakuan dalam penelitian ini yaitu: K : benih cabai direndam dengan formulasi terpilih tanpa P. fluorescens, kemudian disemai dalam pot dan disiram seminggu sekali dengan 5% formulasi yang sama untuk perendaman benih. S : benih cabai direndam dalam formulasi terpilih dengan P. fluorescens, kemudian disemai dalam pot dan seminggu sekali disiram dengan 5% formulasi F8 tanpa P. fluorescens.

6 S1 : benih cabai direndam dalam formulasi terpilih dengan P. fluorescens, kemudian disemai dalam pot dan disiram seminggu sekali dengan 5% formulasi yang sama untuk perendaman benih. Perlakuan disusun dalam rancangan acak lengkap dengan tiga ulangan. Masing-masing unit perlakuan terdiri dari 50 bibit cabai. Bibit cabai dipelihara secara baik dari serangan gulma, hama maupun patogen lain. Penyiraman dilakukan secara teratur untuk mencegah kekeringan. Setelah tanaman berumur 6 MST dilakukan pengamatan terhadap tinggi tanaman dan jumlah daun yang terbentuk. 16 Analisis Data Kurva pertumbuhan koloni P. fluorescens pada beberapa formulasi limbah organik dan data perkecambahan benih dapat dilihat dengan menggunakan program Microsoft Excel Sedangkan, data pertumbuhan koloni bakteri P. fluorescens pada limbah organik dan modifikasinya, pengujian antagonisme secara in-vitro maupun in-vivo pada media cair, pengujian formulasi P. fluorescens terhadap kemunculan benih dan pengujian formulasi termodifikasi terhadap vigor tanaman cabai dilakukan dengan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari tiga ulangan diolah dengan menggunakan Analisis Ragam (Anova). Apabila terdapat perlakuan yang berbeda nyata dilakukan uji lanjutan dengan uji Tukey pada taraf nyata α= 0.05.