DNA BARCODE KERAGAMAN GENETIK, DAN KONSERVASI FAUNA INDONESIA

Transkripsi

1 DNA BARCODE KERAGAMAN GENETIK, DAN KONSERVASI FAUNA INDONESIA Oleh M. Syamsul Arifin Zein Peneliti Madya Bidang Genetika Molekuler Laboratorium Genetika Bidang Zoologi Pusat Penelitian Biologi LIPI

2

3 All Birds DNA barcoding Initiative (ABBI) of Inaugural Workshop (USA, 2005)

4 Second International Barcode of Life Conference (Taiwan, 2007)

5 Zein MSA et al Initiative DNA Barcoding Research in Indonesia. Second International Barcode of Life Conference, Taipei, Taiwan.

6 Sutrisno H Molecular Phylogeny of Indo-Australian Glyphodes and its Allied Genera (Lepidoptera: Crambidae) Inferred from Mitochondrial COI and COII and Nuclear EF-Iα Gene Sequences. Second International Barcode of Life Conference.Taipei, Taiwan.

7 ILUSTRASI DNA BARCODE Dasar pemikiran, Tujuan, dan Hasil

8 Apa yang disebut DNA Barcode??? Barcoding: adalah pendekatan standar untuk mengidentifikasi tumbuhan dan hewan dengan urutan minimal sekuen DNA, yang disebut barcode DNA. (Barcoding is a standardized approach to identifying plants and animals by minimal sequences of DNA, called DNA barcodes) Barcode DNA: Sebuah urutan DNA pendek, dari sebuah wilayah yang seragam pada genom, yang digunakan untuk mengidentifikasi spesies. (A short DNA sequence, from a uniform locality on the genome, used for identifying species).

9 DASAR PEMIKIRAN STANDARISASI DNA BARCODE Mempercepat pembangunan perpustakaan referensi urutan DNA yang konsisten dan komprehensif Mempercepat pengembangan teknologi yang ekonomis untuk identifikasi spesies

10 TUJUAN AGAR SIAPAPUN, DIMANAPUN, KAPANPUN DAPAT MENGIDENTIFIKASI DENGAN CEPAT DAN AKURAT SPESIES DARI SPESIMEN APAPUN KONDISINYA

11 DNA BARCODE FAUNA...????? DNA GENOME INTI DNA MITOKONDRIA

12

13 DNA INTI: Exon dan intron Exon adalah sekuens DNA yang ditranskripsi menjadi RNA dan ditranslasi menjadi polypeptida (coding region) Intron adalah sekuens DNA yang tidak diubah menjadi RNA dan protein (Non coding region)

14

15 DNA MITOKONDRIA Genom DNA mitokondria berbentuk sirkuler, berisi 13 gen penyandi protein, 22 gen transfer RNA (trna), 2 gen ribosoma (rrna), dan daerah kontrol (control region/d- Loop) dengan panjang sekitar pasang basa (DESJARDIN dan MORAIS, 1990).

16 Mengapa barcode DNA Fauna dengan DNA mitokondria????? Mitokondria: Merupakan organel yang memproduksi energi dalam sel tumbuhan dan hewan, Dua puluh tahun penelitian telah menetapkan utilitas urutan DNA mitokondria dalam membedakan antara spesies hewan yang berhubungan erat.

17 Perbedaan antara spesies lebih besar Jumlah copy: Ada ,000 lebih banyak salinan mitokondria dibandingkan DNA inti per sel, membuat pemulihan, terutama dari sampel kecil atau sebagian rusak, lebih mudahdan lebih murah Relatif sedikit perbedaan dalam spesies Dalam kebanyakan kasus, kecilnya perbedaan intraspesifik dan besarnya perbedaan interspesifik merupakan sinyal batas genetik yang berbeda antara sebagian besar spesies, memungkinkan identifikasi yang tepat dengan barcode DNA mitokondria Gen di DNA mitokondria Semua merupakan daerah coding ( tidak diselingi intron dan extron seperti pada gen inti), sehingga dapat amplifikasi langsung. Sedangkan pada gen inti sering terganggu dengan daerah non coding (intron) yang sering amplifikasi sulit dan tak terduga.

18 Results so far suggest that a mitochondrial gene will enable identification of most animal species.

19 Mengapa Standarisasi DNA Barcode Fauna menggunakan COI? Menggunakan Gen Protein DNA Mitokondria: Mendefinisikan wilayah standar dan membuat perbandingan antara urutan gen penyandi protein yang mudah, karena gen protein umumnya tidak memiliki insersi dan delesi seperti yang ada di dalam gen ribosom. Mitokondria Gen penyandi protein pada DNA mitokondria umumnya mengandung perbedaan lebih tinggi dari gen ribosom dan dengan demikian lebih mungkin untuk membedakan antara spesies yang berhubungan erat.

20 KESEPAKATAN INTERNASIONAL DNA BARCODE FAUNA Menggunakan Gen COI DNA Mitokondria: Gen Cytochrome c oxidase subunit I (COI) merupakan reprensentatif dari semua gen penyandi protein DNA mitokondria Segmen dekat terminus 5 dari COI sepanjang sekitar 650 pasang basa merupakan daerah yang digunakan sebagai barcode DNA untuk fauna (Herbert et al. 2003)

21 COI terbukti memiliki variasi intraspesifik rendah, tetapi interspesifik divergensinya tinggi antara taksa yang berdekatan (closely allied taxa) (Ward et al. 2005; Hajbabaei et al. 2006a). Primer Universal Standard: (amplifikasi muda dan hasil sekuen baik).

22 An Internal ID System for All Animals DNA The Mitochondrial Genome D-Loop Small ribosomal RNA Cytochrome b ND6 ND1 Typical Animal Cell ND5 COI ND2 mtdna H-strand ND4 L-strand Mitochondrion ND4L ND3 COIII COII ATPase subunit 8 ATPase subunit 6

23

24 DNA BARCODE PADA MAMALIA

25 Universal Primer Mamalia: FORWARD: LepF1-tl: 5 TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATATTG G3 VF1-tl: 5 TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA3 VF1d-tl: 5 TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA TYG G3 VFli-tl: 5 TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC AAA GAA TGG3 REVERSE: LepR1-tl: 5 cag gaa aca gct atg cta aac ttc tgg atg tcc aaa aaa tca3 VR1-tl: 5 cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc cra ara ayc a3 VR1d-tl: 5 cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc caa aga atc a3 VRli-tl: 5 cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt gcc aaa ac3 (Ivanova et al. 2006). Mix 1:1:1:3 Primer untuk sekuensing: (Messing 1983) M13F: 5 tgt aaa acg acg gcc agt3 M13R:5 cag gaa aca gct atg ac3

26 Hasil amplifikasi primer universal

27 Capillary Sequence Read

28 Barcode menegaskan kesatuan dari spesies Homo sapiens Perbandingan menunjukkan bahwa kita berbeda satu sama lain dengan hanya 1 atau 2 nukleotida dari 648, sementara kita berbeda dari simpanse pada 60 lokasi dan gorila di 70 lokasi.

29 Teknik Molekuler untuk Identifikasi Spesies Ordo Cetartiodactyla Menggunakan DNA Barcode (Zein MSA&Fitriana YS,2012) ZooIndonesia:21(02): spesimen, 4 famili, 10 marga and 15 spesies Jarak genetik: intraspesies : 0-0,7% (0,13±0,05%) interspesies : 2-28% intragenera : 8,8-27,4 (1,36±0,037%) intergenera : 8,8-27,4% intrafamily : 5,8-11,9% (7,8±2,85) interfamili : 18,6-26,3% Hasil rekonstruksi pohon filogeni Cetartiodactyla menunjukkan semua spesies membentuk sebuah cluster kohesif yang jelas berbeda.

30

31 BARCODING DNA PADA SURVEI KOMUNITAS KELELAWAR PEMAKAN SERANGGA DI INDONESIA (DNA Barcoding in Surveys Microbat Communities in Indonesia) (Zein and Fitriana) Evaluasi pada 136 individu 6 Famili 45 spesies Sekuen divergensi intraspesifik gen CO ,260.

32 Hipposideros papua.mg Hipposideros papua.mg 3542 Hipposideros papua.mg 3539 Hipposideros papua.mg 3538 Hipposideros papua.mg Hipposideros muscinus.mg Hipposideros muscinus.mg 2968 Hipposideros sabanus.mg 2745 Hipposideros cervinus.mg Hipposideros ater.mg Hipposideros ater.mg 1685 Hipposideros Hipposideros ater.mg Hipposideros diadema.mg 1237 Hipposideros diadema.mg 1556 Hipposideros diadema.mg Hipposideros diadema.mg 3650 Hipposideros larvatus.mg 2839 Hipposideros larvatus.mg Hipposideros larvatus.mg 2847 Hipposideros larvatus.mg 3299 Pipistrellus javanicus.mg 113 Pipistrellus Asseliscus tricuspidatus.mg 3551 Asseliscus tricuspidatus.mg 3547 Asseliscus tricuspidatus.mg 3529 Asseliscus 100 Asseliscus tricuspidatus.mg Megaderma spasma.mg 2793 Megaderma spasma.mg Megaderma spasma.mg 106 Megaderma Megaderma spasma.mg 2897 Megaderma spasma.mg Miniopterus pusillus.mg Miniopterus pusillus.mg 3379 Miniopterus schreibersi.mg 3367 Miniopterus Miniopterus australis.mg Miniopterus australis.mg Miniopterus australis.mg Miniopterus australis.mg 3711 Miniopterus australis.mg 3532 Miniopterus Miniopterus australis.mg Miniopterus schreibersi.mg Miniopterus schreibersi.mg 3699 Miniopterus Miniopterus schreibersi.mg Pipistrellus javanicus.mg 152 Miniopterus schreibersi.mg 90 Pipistrellus Miniopterus Miniopterus schreibersi.mg Miniopterus schreibersi.mg Miniopterus magnater.mg 3247 Miniopterus medius.mg Miniopterus medius.mg Miniopterus medius.mg 2842 Miniopterus 51 Mosia nigrescens.mg 3681 Scotophilus kuhlii.mg 761 Scotophilus kuhlii.mg Scotophilus kuhlii.mg Scotophilus kuhlii.mg 796 Scotophilus kuhlii.mg 805 Mosia Scotophilus 100 Mops sarasinorum.mg Mops sarasinorum.mg Mops sarasinorum.mg Mops sarasinorum.mg Mops sarasinorum.mg 1511 Hipposideros diadema.mg 543 Chaerephon plicata.mg 2851 Mops Hipposideros 70 Chaerephon plicata.mg Chaerephon plicata.mg Chaerephon plicata.mg 2853 Otomops formosus.mg 2539 Chaerephon Otomops 76 Emballonura alecto.mg Emballonura alecto.mg Emballonura alecto.mg Emballonura alecto.mg 2498 Emballonura alecto.mg 2521 Emballonura Emballonura alecto.mg Emballonura alecto.mg 2801 Taphozous melanopogon.mg 2368 Taphozous 2 Phoniscus atrox.mg Phoniscus atrox.mg 3788 Kerivoula hardwickei.mg 3759 Phoniscus Harpiocephalus Kerivoula intermedia.mg 3798 Kerivoula hardwickei.mg 4127 Kerivoula papillosa.mg 3797 Kerivoula 96 Pipistrellus javanicus.mg 2469 Pipistrellus 6 99 Tylonycteris robustula.mg 1081 Tylonycteris Pipistrellus javanicus.mg 3295 Pipistrellus 100 Pipistrellus javanicus.mg 3301 Nyctophilus sp.mg 2671 Nyctophilus Tylonycteris robustula.mg 1653 Tylonycteris Harpiocephalus harpia.mg 3767 Myotis muricola.mg 3290 Harpiocephalus 100 Myotis muricola.mg Myotis muricola.mg 1712 Myotis muricola.mg Myotis muricola.mg Myotis muricola.mg Myotis muricola.mg Myotis muricola.mg Myotis muricola.mg Myotis muricola.mg 471 Myotis 0.02

33 Hasil Koreksi Identifikasi Lapangan dengan DNA Barcode No. Spesimen Identifikasi lapangan Blast DNA barcode Kofirmasi MG 3786 Rhinolophus philippinensis Rhinolophus trifoliatus R. trifoliatus MG 3367 Miniopterus scheibersi Minioterus australis M. australis MG 3379 Miniopterus pussilus Miniopterus australis M. australis MG 3378 Miniopterus pussilus Miniopterus australis M. australis MG 472 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola MG 474 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola MG 464 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola MG 464 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola MG 2747 Myotis ater Myotis muricola M. muricola MG 2748 Myotis ater Myotis muricola M. muricola MG 2895 Emballonura monticola Emballonura alecto M. alecto MG 2894 Emballonura monticola Emballonura alecto M. alecto

34

35 Barcoding DNA Kelelawar Pemakan Buah (Chiroptera: Pteropodidae) Berdasarkan Sekuen Gen COI DNA Mitokondria (Zein MSA & Fitriana YS) Evaluasi pada: 120 spesimen, 17 genera, 43 species Hasil menunjukkan intraspesific divergensi sekuen gen CO %. Ada 3 spesies menunjukkan divergensi sekuen yang tinggi : Rousettus celebensis (13.4%), Chironax melanocephalus (7.9%), dan Thoopterus nigrescens (2.9%), Yang lain sekuen divergensinya rendah Spesies pada genus Dobsonia (Dobsonia viridis, Dobsonia moluccensis, Dobsonia crenulata); Cynopterus (Cynopterus minutus, Cynopterus brachyotis, Cynopterus titthaecheilus, Cynopterus sphinx), dan genera Rousettus (Rousettus celebensis Rousettus amplexicaudatus) menunjukkan closely allied taxa/kesalahan identifikasi spesies. Harus ada konfirmasi ulang diskripsi spesies yang telah dilakukan

36

37

38

39

40 DNA BARCODE PADA BURUNG

41

42

43

44

45 Interspesifik Lebih rendah dari 1% Anas puna and Anas versicolor. Distance: % Anas cyanoptera 1 Anas cyanoptera 2 Anas platalea Anas puna 1 Anas puna % Anas versicolor 1 Anas versicolor 2

46 Intraspesifik lebih besar dari 2% Upucerthia dumetaria (up to 5%) Troglodytes aedon (up to 4,5%) Myophobus fasciatus (up to 4,35%)

47 COI Criptic also discriminates species between closely related cryptic species. E.g. Myarchus spp. M. tuberculifer M. ferox M. tyrannulus M. swainsoni 1% M. tuberculifer 1 M. tuberculifer 2 M. tuberculifer 3 M. swainsoni 1 M. swainsoni 2 M. tyrannulus 1 M. tyrannulus 2 M. tyrannulus 3 M. tyrannulus 4

48 Lessonia rufa Urutan sekuen COI pada geografis terpisah, membenarkan perlakuan sebagai spesies yang berbeda. Misalnya Lessonia spp. Lessonia oreas 1% L. oreas 1 L. oreas 2 L. oreas 3 L. oreas 4 L. oreas 5 L. oreas 6 L. rufa 1 L. rufa 2 L. rufa 3 L. rufa 4

49 Genus Cinclodes C. fuscus 1% C. fuscus 1 C. fuscus 2 C. fuscus 3 C. fuscus 4 C. fuscus 5 C. atacamensis 1 C. atacamensis 2 C. atacamensis 3 C. patagonicus 1 C. patagonicus 2

50 Genus Leptasthenura L. platensis L. fuliginiceps L. aegithaloides L. aegithaloides 1% L. fuliginiceps 1 L. fuliginiceps 2 L. fuliginiceps 3 L. aegithaloides 1 L. aegithaloides 2 L. aegithaloides 3 L. aegithaloides 4 L. aegithaloides 5

51 Serpophaga munda Straneck 1993 Serpophaga subcristata Serpophaga griseiceps 1% Serpophaga subcristata S. subcristata 1 S. subcristata 2 S. griseiceps 1 S. griseiceps 2

52 The Data Barcode Standard 1. Minimum 500 bp, <1% ambiguous base calls 2. Double stranded sequence 3. Trace files and associated quality scores 4. Primers used to generate sequence 5. Linkages to: A morphological voucher specimen Structured reference to collections Geospatial reference information Valid species name Who performed the identification Literature citations

53

54 How Barcoding is Done From specimen to sequence to species C NO DI 3 I I N DN 1 D 2 Collecting DNA extraction CO1 gene DNA sequencing Trace file Voucher Specimen Database of Barcode Records

55 Membangun perpustakaan referensi barcode : Spesimen voucher diidentifikasi dengan baik Sampel Jaringan Ekstrak DNA Amplifikasi PCR Sekuensing DNA Data submission to GenBank

56 Pengawetan Jaringan Sampel: 1. Nitrogen cair (paling baik) 2. DMSO 3. Alkohol absolut (pure grade)

57

58

59

60 Ekstraksi DNA PCR Sekuensing

61 Mamalia Burung Insekta Fauna Lainnya

62

63 Kekuatan Penawaran alternatif alat identifikasi taksonomi untuk situasi di mana morfologi tidak meyakinkan. Fokus pada satu atau sejumlah kecil gen memberikan efisiensi yang lebih besar Biaya sekuensing DNA juga menurun karena kemajuan teknis. Potensi kapasitas yang tinggi dan dapat memproses sampel dalam jumlah besar. Setelah database referensi didirikan, dapat diterapkan oleh non-spesialis Beberapa aspek yang paling menarik mengandalkan teknologi masa depan, misalnya, sequencer genggam

64 What barcode users would do with the reference libraries Inspection stations at every port and international airport for: Agricultural pest control Illegal trade in endangered species Violations of trade quotas Water quality surveys Food inspection Public health monitoring and diagnoses

65 Beberapa Hasil Penelitian Menggunakan DNA Barcode

66

67

68

69 Peta lokasi koleksi material DNA diberbagai tempat di Indonesia

70 Terima Kasih