APLIKASI DNA BARCODE UNTUK IDENTIFIKASI JENIS MERANTI DAN ROTAN AHMAD BAIQUNI RANGKUTI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

Transkripsi

1 i APLIKASI DNA BARCODE UNTUK IDENTIFIKASI JENIS MERANTI DAN ROTAN AHMAD BAIQUNI RANGKUTI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

2 ii

3 iii PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aplikasi DNA Barcode untuk Identifikasi Jenis Meranti dan Rotan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2016 Ahmad Baiquni Rangkuti NIM. E

4 ii RINGKASAN AHMAD BAIQUNI RANGKUTI. Aplikasi DNA Barcode untuk Identifikasi Jenis Meranti dan Rotan. Dibimbing oleh ISKANDAR Z. SIREGAR dan ULFAH J. SIREGAR. Meranti dan rotan merupakan jenis tanaman hutan yang memiliki nilai ekonomi dan ekologi yang tinggi. Keberadaan kedua spesies ini semakin terancam karena over-eksploitasi dan perusakan habitat. Upaya yang saat ini dilakukan untuk melestarikan sumber daya genetik meranti dan rotan sering mengalami kesulitan terkait dengan identifikasi spesies berdasarkan penanda morfologi. Oleh karena itu, kesalahan dalam mengidentifikasi spesies akan mempengaruhi pengadaan bibit berkualitas dalam program pemuliaan. Penanda molekuler, seperti DNA barcode dapat digunakan sebagai alat pelengkap untuk mengidentifikasi spesies secara akurat. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi calon barcode, yaitu matk, rbcl, trnh - psba, ITS1 dan kombinasi mereka untuk mengidentifikasi spesies meranti dan rotan dengan benar. Tiga kriteria yang digunakan untuk diskriminasi spesies, yaitu: i) perbandingan antara hasil identifikasi morfologi dan molekuler, ii) jarak intra dan interspesifik untuk mendeteksi barcoding gap, dan iii) pembentukan pohon filogeni. Lokus rbcl dan ITS1 memiliki tingkat keberhasilan tertinggi untuk amplifikasi dan sekuensing, diikuti oleh trnh-psba dan matk. Penelitian ini mengungkapkan bahwa setiap kandidat barcode menunjukkan perbedaan dalam mengidentifikasi jenis. Pada tanaman rotan berhasil diidentifikasi pada level genus dan famili, sedangkan pada meranti pada level genus dan spesies. Lokus ITS1 dan kombinasi dari matk + rbcl pada tanaman rotan mampu memisahkan jarak intra dan interspesifik, akan tetapi tidak membentuk gap. Pada tanaman meranti trnh psba mampu memisahkan jarak intra dan interspesifik akan tetapi tidak membentuk gap. Selanjutnya, pohon filogeni juga menunjukkan bahwa setiap calon barcode mampu mendiskriminasikan data sampel penelitian, data dari GenBank dan out group, kecuali rbcl. ITS1 adalah kandidat barcode terbaik dalam mengidentifikasi rotan serta trnh psba merupakan kandidat barcode terbaik dalam mengidentifikasi meranti. Keywords: DNA Barcode, ITS 1, Meranti, Rotan, trnh-psba

5 iii SUMMARY AHMAD BAIQUNI RANGKUTI. Application DNA Barcode to Identify Shorea and Rattan species. Supervised by Iskandar Z. Siregar and Ulfah J. Siregar. Shorea and rattan are forest plants, which have high economic and ecological values. The existence of these two taxa are threatened due to overexploitation and habitat destruction. The current efforts to preserve genetic resources of meranti and rattan often encounter difficulties with regards to species identification based on morphological characteristics. Hence, errors in identifying correct species will affect the quality of seedling procurement in the restoration program. Molecular markers, such as DNA barcodes, could be used as a complementary tool to identify species accurately. The objectives of this study were to characterize DNA barcode candidates, namely matk, rbcl, trnh - psba, ITS1 and their combinations for correct shorea and rattan species identification. Three criteria were used for species discrimination, namely: i) comparison between morphological and molecular identification results, ii) intra and interspecific distance for detecting barcode gap, and iii) formation of phylogeny tree. ITS1 and rbcl had the highest success rate for amplification and sequencing results, followed by trnh-psba and matk. This study revealed that each candidate barcode showed the accuracy differences in identifying rattan species at genus and family level, while shorea at genus and species level. The ITS1 locus and combination of matk+ rbcl were able to separate rattan using intra- and interspecific distance, but could not form barcode gap between them. In shorea plant trnh - psba were able to separate intra- and interspecific distance but could not form barcode gap. Furthermore, phylogeny tree also showed that every candidate barcode was able to discriminate the sample data, data from GenBank and the out group, except rbcl, suggesting ITS1 is the best candidate in identifying rattan and trnh -psba is the best candidate in identifying shorea. Keywords: DNA barcode, ITS 1, Rattan, Shorea, trnh-psba

6 iv Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7 i APLIKASI DNA BARCODE UNTUK IDENTIFIKASI JENIS MERANTI DAN ROTAN AHMAD BAIQUNI RANGKUTI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Silvikultur Tropika SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

8 ii Penguji Luar Komisi pada Ujian: Dr Ir Sri Rahayu, M Si

9 iii Judul Tesis : Aplikasi DNA Barcode untuk Identifikasi Jenis Meranti dan Rotan Nama : Ahmad Baiquni Rangkuti NIM : E Disetujui oleh Komisi Pembimbing Prof Dr Ir Iskandar Z.Siregar, MForSc Ketua Dr Ir Ulfah J.Siregar, MAgr Anggota Diketahui oleh Ketua Program Studi Silvikultur Tropika Dekan Sekolah Pascasarjana Prof Dr Ir Sri Wilarso Budi R, MS Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr Tanggal Ujian: 30 September 2016 Tanggal Lulus:

10 iv PRAKATA Puji dan syukur saya panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta ala atas segala karunia-nya sehingga tesis yang berjudul Aplikasi DNA Barcode untuk Identifikasi Jenis Rotan dan Meranti dapat diselesaikan. Shalawat dan salam semoga selalu tercurah kepada nabi besar Muhammad SAW. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih dan penghargaaan kepada Prof Dr Ir Iskandar Z. Siregar, MForSc dan Dr Ir Ulfah J. Siregar, MAgr selaku komisi pembimbing, atas arahan dan bimbingannya. Terimakasih yang terdalam kepada ibu dan ayah untuk kasih sayang, kepercayaan dan setiap doa yang selalu dipanjatkan untuk penulis. Ucapan terimakasih juga kami sampaikan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan dana kegiatan Penelitian Kerjasama Luar Negri dan Publikasi Internasional kepada pembimbing untuk tahun anggaran Kepada pihak pengelola Hutan Pendidikan Gunung Walat yang telah mengijinkan penulis untuk mengambil sampel daun dilokasi tersebut. Terimakasih penulis sampaikan kepada Laswi Irmayanti, S.Hut Msi, Fifi Gus Dwiyanti, S.Hut MAgr PhD, dan Asep Mulyadiana, S.Hut Msi yang telah memberikan ide, perbaikan dan masukan masukan di dalam penelitian maupun penulisan tesis ini. Kepada sahabat dan rekan-rekan di Laboratorium Genetik Hutan dan Kehutanan Molekuler, Departemen Silvikultur ( Faujiah Nur Hasanah Ritonga, S.Hut, Tryanto, S.Hut, Rajjitha Handayani, SP), teman- teman Silvikultur Tropika Kakak, adik dan keluarga atas dukungannya selama ini. Kepada semua pihak yang telah membantu baik secara langsung maupun tidak langsung dari memulai sampai menyelesaikan penelitian, sehingga penulisan tesis ini selesai, penulis mengucapkan terimakasih banyak. Semoga Allah memberi balasan yang berlipat. Amiin. Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna. Namun penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi penulis dan pihak-pihak yang memerlukan. Bogor, September 2016 Ahmad Baiquni Rangkuti

11 v DAFTAR ISI DAFTAR ISI i DAFTAR TABEL dan GAMBAR ii DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Tujuan Penelitian 2 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat 3 Alat dan Bahan 3 Prosedur penelitian 4 Analisis Data 9 HASIL DAN PEMBAHSAN HASIL 9 Karakteristik Morpologi Daun 10 Analisis PCA 10 Analisis BIPLOT 11 Analisis Manova 11 Identifikasi Jenis Menggunakan Penanda Molekuler 12 Meranti PT REKI 12 Meranti HPGW 16 Rotan HPGW 20 PEMBAHASAN 24 Karakteristik Morpologi Daun Meranti 24 Identifikasi Penanda Molekuler 25 Hasil Amplifikasi dan Sekuensing 25 Barcoding gap 26 Analisis Filogenetik 26 SIMPULAN DAN SARAN 27 DAFTAR PUSTAKA 27 LAMPIRAN 32 RIWAYAT HIDUP 49

12 vi DAFTAR TABEL 1 Alat dan bahan penelitian 3 2 Daftar jenis 4 3 Komponen yang digunakan dalam proses PCR 8 4 Urutan nukleotida primer yang digunakan 8 5 Hasil uji Duncan 12 6 Rekapitulasi hasil PCR meranti PT REKI 12 7 Panjang sekuen meranti PT REKI 13 8 Rata rata jarak intra dan interspesifik meranti PT REKI 13 9 Akurasi identifikasi menggunakan BLAST pada meranti PT REKI Rekapitulasi hasil PCR meranti HPGW Panjang sekuen meranti HPGW Rata-rata jarak intra dan interspesifik meranti HPGW Akurasi identifikasi pada meranti HPGW Rekapitulasi hasil PCR rotan Panjang sekuen rotan Rata-rata jarak intra dan interspesifik pada rotan Akurasi identifikasi pada tanaman rotan 22 DAFTAR GAMBAR 1 Peta lokasi penelitian 3 2 Bagan prosedur penelitian 5 3 Pengukuran karakteristik morpologi pada daun 6 4 Bentuk ujung daun dan pangkal daun 6 5 Hubungan antara variabel 10 6 Hubungan variabel dengan obyek penelitian 11 7 Distribusi intra dan interspesifik pada meranti PT REKI 14 8 Pohon filogeni meranti PT REKI 15 9 Distribusi intra dan interspesifik meranti HPGW Pohon filogeni meranti HPGW Distribusi intra dan interspesifik pada rotan Pohon filogeni rotan 23 DAFTAR LAMPIRAN 1 Dokumentasi morfologi daun 32 2 Hasil pengurutan basa nukleotida 33 3 Data hasil analisis morfologi 48

13 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Pentingnya menjaga keanekaragaman alam hayati (biodiversitas) merupakan suatu langkah yang tepat dalam mengamankan sumber kekayaan suatu negara. Adanya deforestasi dan degradasi hutan telah mengakibatkan laju penurunan populasi yang berdampak terhadap berkurangnya biodiversitas hutan dan meningkatnya emisi karbon. Berkurangnya biodiversitas mengakibatkan jumlah jenis tanaman yang ada di hutan semakin terancam. IUCN (2009) melaporkan jumlah jenis tanaman yang terancam punah yang ada di Indonesia sebanyak 386 jenis dengan komposisi yaitu 204 jenis termasuk ke dalam kategori rentan (Vulnerable), 69 dalam kategori genting (Endangered) dan 113 kritis (Critically Endangered). Oleh karenanya, perlu dilakukan upaya konservasi yang tepat terhadap jenis-jenis tersebut. Jenis yang banyak di eksploitasi diantaranya adalah dipterokarpa dan rotan karena bernilai ekonomi tinggi. Dipterocarpaceae merupakan famili pohon yang mendominasi hutan-hutan dataran rendah khususnya di Indonesia. Famili tersebut juga memiliki peran penting di dalam memenuhi pasokan kayu, baik dalam negeri maupun luar negeri (Tsumura et al 2011). Shorea merupakan salah satu genus yang terbesar dari famili Dipterocarpaceae, dimana ada 196 jenis yang telah ditemukan di Indonesia dan umumnya berada di Pulau Kalimantan dan Sumatera, serta baru 138 jenis yang telah terdokumentasikan (Ashton 1982). Berdasarkan data dari International Union Conservation Nature (IUCN) Red list (1998) lebih dari 100 jenis Shorea masuk dalam kategori kritis (Critically Endangered). Selain dipterokarpa, tumbuhan rotan juga memegang peranan penting dimana di Asia Tenggara dijumpai lebih dari 516 jenis, yang berasal dari 8 genus, yaitu untuk genus Calamus 333 jenis, Daemonorops 124 jenis, Khorthalsia 30 jenis, Plectocomia 10 jenis, Plectocomiopsis 10 jenis, Calopspatha 2 jenis, Bejaudia 1 jenis dan Ceratolobus 6 jenis. Dari 8 genus tersebut, dua genus rotan bernilai ekonomi tinggi yaitu Calamus dan Daemonorops (Herliyana 2009). Pemanfaatan rotan yang terjadi sejauh ini mengarah pada eksploitasi berlebih sehingga upaya untuk melestarikan rotan dianggap penting. Oleh karena itu perlu dilakukan upaya untuk melestarikan kedua tumbuhan tersebut, di antaranya dapat dilakukan melalui konservasi in-situ (di dalam habitatnya) maupun ex-situ (di luar habitatnya). Konservasi ex-situ dan in-situ sekarang dianggap sebagai solusi untuk menjaga hilangnya sumber genetik tanaman (Vivekanandan et al. 1998). Informasi genetik merupakan informasi yang diperlukan dalam pemuliaan tanaman yang merupakan salah satu upaya di dalam konservasi. Kegiatan pemuliaan memerlukan identitas tumbuhan yang tepat dan jelas. Aspek taksonomi serta informasi mengenai karakteristik biologis merupakan salah satu dasar penting dari aktivitas konservasi (Schmeller et al. 2008). Kesalahan identifikasi jenis cukup sering terjadi yang berakibat kurang baik jika dikaitkan dengan kegiatan pemuliaan pohon dan pengadaan bibit berkualitas dalam rangka program restorasi (Soberon & Medellin 2007). Setidaknya ada tiga masalah dalam mengidentifikasi spesies tumbuhan menggunakan praktek taksonomi konvensional: (1) kurangnya literatur dan akses data herbarium (Meyer & Paulay 2005) (2) kesalahan identifikasi pada taksa karena sifat resiliensi pada karakter taksonomi dan (3) memerlukan waktu yang cukup lama. Proses pengambilan sampel tanaman hutan pada fase anakan di

14 2 lapangan umumnya mengalami kesulitan dalam proses pengenalan jenis. Identifikasi jenis umumnya mengandalkan pengenal pohon yang terlatih dimana sering juga menghadapi kesulitan dalam hal pengenalan secara tepat (Lahaye et al. 2008). Identifikasi berdasarkan penanda molekuler perlu dilakukan, mengingat penanda molekuler menghasilkan data yang lebih akurat, cepat dan lebih bersifat stabil (Hajibabaei et al. 2007; Lahaye et al. 2008; Zhang & Hanner 2011; Kress WJ & Erickson DL 2012). Selain itu, DNA menyimpan informasi suatu spesies lebih banyak. Metode yang dikenal dengan DNA barcode merupakan teknik analisis identifikasi yang menggunakan standarisasi universal pada suatu fragmen genomik untuk mewadahi pencarian dan identifikasi jenis (Hajibabaei et al. 2006; Hebert et al. 2003). Idealnya, sekuen DNA (barcode) dari wilayah genomik, dapat diambil dari jaringan yang kecil serta bisa mengidentifikasi organisme (Kress & Erickson 2007). Sekuen yang diperoleh, kemudian dibandingkan dalam database yang terdapat pada Gen Bank salah satunya adalah National Center for Biotechnology Information (NCBI), yang mengarah ke identifikasi atau rekor, kemudian bisa menetapkan barcode baru untuk spesies tertentu (Hajibabaei et al. 2007). Apabila sekuen DNA sample tidak cocok dengan data yang ada di dalam database, maka dapat dikatakan bahwa hasil perbandingan ini menunjukkan adanya spesies baru (Hebert et al. 2004). Selain itu, data filogeny bisa menjadi acuan yang baik untuk mengkonfirmasi jenis yang diperoleh dari proses blast. Analisis molekuler telah dilakukan untuk memperjelas hubungan filogenetik antara spesies Dipterocarpaceae (Kajita et al, 1998; Morton 1999; Kamiya et al, 2005; Ishiyama et al, 2003; Yulita et al, 2005; Indrioko et al, 2006). Beberapa barcode pada tanaman umumnya menggunakan region rbcl (ribulase 1,3 biphosphate carboxylase Oxygenase), matk (maturase K), trnh- psba dan khususnya ITS 1 (internal transcribed spacer) karena memiliki tingkat evolusi yang lebih tinggi, terdapat pada semua gen rrna eukariotik dan memiliki salinan yang banyak di dalam genom inti dan berukuran pendek (Kress et al. 2007). Oleh karena itu pada penelitian ini DNA Barcode rbcl, matk, trnh- psba dan ITS 1 digunakan untuk mengidentifikasi tumbuhan shorea dan rotan. Perumusan Masalah Identifikasi tumbuhan rotan dan meranti dapat dilakukan dengan bantuan metode identifikasi molekuler berdasarkan potongan DNA pendek yang dikenal dengan istilah DNA barcode untuk melengkapi keahlian taksonomi konvensional dalam upaya konservasi tumbuhan di Indonesia. Penelitian ini dilakukan untuk menjawab beberapa pertanyaan berikut: 1. Jenis tanaman rotan maupun meranti apa yang dijumpai di Hutan Pendidikan Gunung Walat? 2. Bagaimanakah membedakan jenis - jenis anakan meranti yang ada di PT REKI secara morfologi? 3. Kandidat barcode potensial manakah yang memiliki kualitas yang terbaik di dalam mengidentifikasi jenis rotan maupun meranti? Tujuan penelitian ini adalah untuk: Tujuan Penelitian