Aplikasi Marka Molekuler Terpaut Gen-gen Ketahanan Penyakit Hawar Daun Bakteri dalam Seleksi Tetua Persilangan

Transkripsi

1 Aplikasi Marka Molekuler Terpaut Gen-gen Ketahanan Penyakit Hawar Daun Bakteri dalam Seleksi Tetua Persilangan Dwinita W.Utami 1, E.M Septiningsih 2, S Yuriyah 1, I Hanarida 1 1 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor, Jawa Barat 2 International Rice Research Institute DAPO Box 7777, Metro Manila, Philippines ABSTRACT. Use of Molecular Markers Linked to Genes for Bacterial Leaf Blight Resistance in Selections for Rice Breeding Parents. Bacterial leaf blight disease (BLB) caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is one of the most dynamic rice pathogens. Virulence of the Xoo isolates from different regions varied considerably, as a manifestation of the dynamic hostpathogen relationships. Multigenic rice lines with a broad spectrum of BLB resistance need to be developed to deal with the dynamic Xoo population in the field. In the previous studies, a number of molecular markers linked to several BLB resistance genes had been designed. The purpose of this study was to apply some molecular markers that were linked to BLB resistance genes Xa7, Xa21, Xa26 and Xa4, on survey of the polymorphism between parents of the crossing. The rice genetic materials used in this study were Ciherang as a recurrent parent and isogenic lines IRBB 10 and IRBB66 as parental donor for the target genes of Xa4/Xa26, Xa7 and Xa21. The molecular markers used for the target genes were from the previous research and basic information on nucleotide sequences of each target gene was derived from the Rice Genome Browser. The markers were applied for survey of polymorphism between the parents. The results showed that the molecular markers showed polymorphism between alleles of the donor parents (IRBB66 and IRBB10) and the recurrent parent (Ciherang). These markers were RM20589 and RM20590 for the Xa7 gene; Xa21-LD21 for the Xa21 gene, Xa26-LD36 for the Xa26 gene, and Xa4-LD15 for the Xa4 gene. All of these polymorphic molecular markers can be applied in selection process for BLB resistance among of rice progenies from crosses of the respective parents. Keywords: Molecular markers, BLB gene resistance, rice parental survey ABSTRAK. Bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), penyebab penyakit Hawar Daun Bakteri (HDB) termasuk salah satu patogen yang dinamis. Perbedaan virulensi antar solat yang berasal dari berbagai daerah terhadap varietas padi merupakan meanifestasi kedinamisan dari Xoo. Varietas padi yang memiliki ketahanan berspektrum luas, memiliki beberapa gen ketahanan, terhadap penyakit HDB, perlu dirakit untuk menghadapi kedinamisan Xoo.di lapangan. Pada penelitian sebelumnya telah didisain beberapa marka molekuler terpaut dengan gen-gen ketahanan terhadap HDB. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui peluang aplikasi marka molekuler yang yang telah didesain dari penelitian sebelumnya terhadap keterpautan dengan gen ketahanan terhadap HDB, Xa7, Xa21, Xa26, dan Xa4, dalam survei polimorfisme tetua persilangan. Material genetik yang digunakan adalah varietas Ciherang sebagai tetua penerima gen target dan galur isogenik IRBB 10 dan IRBB66 sebagai tetua donor atau sumber gen ketahanan HDB, Xa4/Xa26, Xa7, dan Xa21. Beberapa marka molekuler yang digunakan berasal dari penelitian terdahulu, sedangkan informasi sekuen basa nukleotida masing-masing gen target diperoleh dari rice genome browser. Marka-marka tersebut diaplikasikan untuk survei polimorfisme di antara tetua-tetua yang dianalisis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa beberapa marka penanda gen-gen ketahanan menunjukkan polimorfisme alel antara tetua donor (IRBB66 dan IRBB10) dengan varietas penerima (Ciherang). Markamarka molekuler tersebut adalah RM20589 dan RM20590 untuk gen Xa7; Xa21-LD21 untuk gen Xa21, Xa26-LD36 untuk gen Xa26, dan Xa4-LD15 untuk gen Xa4. Marka-marka molekuler ini dapat diaplikasikan dalam proses seleksi progeni hasil persilangan antar tetua tersebut. Kata kunci: Marka molekuler, gen tahan HDB, seleksi tetua padi Hawar Daun Bakteri (HDB) yang disebabkan oleh bakteri Xanthomonas campestris pv oryzae (Xoo) merupakan salah satu penyakit utama tanaman padi yang dapat menyebabkan kehilangan hasil dan bahkan menggagalkan panen. Di beberapa lokasi endemik HDB, penurunan produksi padi dapat mencapai 50%, sehingga perakitan padi tahan penyakit ini perlu terus diupayakan. Hasil pengujian pada tahuntahun sebelumnya menunjukkan bahwa gen ketahanan belum terpatahkan oleh patotipe Xoo yang dominan di daerah endemik HDB di Indonesia, terutama di Jawa dan Bali (Triny et al. 2009). Oleh karena itu, gen Xa7 potensial diaplikaskan sebagai salah satu gen target dalam pembentukan galur-galur tahan penyakit HDB. Namun Xoo merupakan patogen yang dinamis, mampu membentuk strain baru di lapangan sejalan dengan perkembangan penggunaan varietas unggul padi oleh petani. Perbedaan virulensi antarisolat HDB yang berasal dari berbagai daerah merupakan manifestasi dari kedinamisan interaksi antara inang dengan patogen (Martin et al. 2003). Untuk menghadapi kedinamisan populasi Xoo di lapangan perlu dirakit varietas padi yang memiliki ketahanan berspektrum luas. Pembentukan galur tahan HDB yang berspektrum luas dapat dilakukan dengan membentukan piramida gen (pyramiding gene) dalam satu genotipe (Huang et al. 1997). Beberapa galur piramida padi (galur-galur IRBB isolines) yang memiliki beberapa gen ketahanan terhadap penyakit HDB telah dirakit, antara lain IRBB66 yang memiliki gen-gen ketahanan Xa4, Xa5, Xa7, Xa13 dan Xa21. Gen-gen Xa tersebut telah banyak yang 152

2 PENELITIAN PERTANIAN TANAMAN PANGAN VOL. 29 NO dipetakan dan diketahui beberapa marka molekuler yang terpaut dan bersegregasi bersama dengan sifat ketahanan terhadap penyakit HDB. Banyak dari gen-gen ketahanan penyakit, termasuk gen tahan HDB terdapat pada kromosom 11 dari genom padi (TRC11-12 Sequencing Consortia 2005; Ghazi et al. 2003). Salah satu dari gen tersebut adalah Xa26 yang terpaut dekat dengan Xa4 pada kromosom 11. Xa26 terpetakan pada posisi Mb yang ditandai oleh marka RFLP Y6855R dan R1506 (Yang et al. 2005). Xa4 dipetakan pada posisi 28.5 Mb, juga pada kromosom 11, yang ditandai oleh marka RFLP L1044 dan Y2668LA (Wang et al. 2000). Hasil penelitian lain juga menunjukkan bahwa Xa26 juga terpaut dekat atau bahkan merupakan family gen Xa3 (Yang et al. 2003). Dari hasil penelitian sebelumnya telah diperoleh beberapa marka spesifik penanda gen-gen Xa7, Xa21, Xa26 dan Xa4. Di antara marka tersebut, marka spesifik untuk gen Xa7 telah divalidasi untuk seleksi padi lokal sebagai tetua persilangan (Utami et al. 2010). Penelitian ini bertujuan untuk mengaplikasikan beberapa marka molekuler yang terpaut dengan gen-gen ketahanan terhadap HDB, yaitu Xa4, Xa7, Xa21, dan Xa26. Markamarka terpilih diharapkan dapat digunakan pada proses seleksi dalam perakitan galur tahan HDB berspektrum luas berbasis MAS (Molecular Assisted Selection). BAHAN DAN METODE Materi genetik yang digunakan dalam penelitian ini adalah padi varietas Ciherang sebagai tetua penerima serta varietas IRBB 10 dan IRBB66 sebagai tetua donor atau sumber gen ketahanan HDB (Xa4/Xa26, Xa7, dan Xa21). Marka Molekuler Beberapa marka yang terpaut dan bersegregasi bersama dengan gen Xa7 adalah marka SNP (Single Nucleotide Polymorphism), Xa7-SNP8, dan Xa7-SNP11 (Utami et al. 2010) dan marka SSR (Simple Sequence Repeat), RM20589, RM20590, dan RM20591 (Chen et al. 2008). Untuk gen target lainnya didesain beberapa marka molekuler berdasarkan posisi fisik dari gen tersebut dan informasi sekuen basa nukleotida yang diperoleh dari beberapa Rice Genome Browser, seperti Gramene ( TIGR ( dan NCBI ( Sekuen basa nukleotida marka untuk masing-masing gen target tersebut dapat dilihat pada Tabel 1. Metode Komposisi reaksi PCR yang digunakan dari marka molekuler di atas adalah MQ dh2o ull, 10 x buffer PCR 2.0 ul, 25 mm MgCl2 1.2 ul, 10 mm dntps 0.6 ul, Primer (F) 0.6 ul, Primer(R) 1.0 ul, Taq DNA pol ul, dan 50 ng DNA 2 ul. Profil PCR yang digunakan adalah pre denaturasi 95 o C selama 3 menit, denaturasi 94 o C 1 menit, anneling 50 o C 1 menit, pemanjangan primer 72 o C, 2 menit, diulang 35 kali dan pemanjangan akhir 72 o C 5 menit. Hasil analisis PCR divisualisasi dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 1-2%. HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi marka molekuler untuk beberapa gen ketahanan terhadap HDB, yaitu Xa4, Xa7, Xa2, dan Xa26, dilakukan berdasarkan posisi fisik dari gen tersebut berdasarkan informasi sekuen dari genome padi. Identifikasi Marka Gen Xa7 dan Aplikasinya untuk Seleksi Tetua Gen ketahanan Xa7 pada genom padi terdapat pada kromosom 6 dengan ukuran ~ Kb. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya diketahui bahwa dengan ukuran sebesar itu gen Xa7 terpetakan pada beberapa fragmen (fragmen). Berdasarkan analisis LD mapping diketahui bahwa fragmen AP dan AP memiliki signifikansi posisi yang tinggi untuk gen Xa7. Pada kedua fragmen ini terdapat dua marka SNP yang Tabel 1. Sekuen marka molekuler penanda gen-gen ketahanan terhadap HDB. Primer Squence (5-3 ) Gen RM20589 F-CATGTATTTGTGTGCACGTACCG Xa7 R-ACCTTTCTTGGGCCTTTCTTGG RM20590 F-TTCGATGAGCACCTTTCCTTGTCC Xa7 R-GCCTCGCCGATTCACTTATGC RM20591 F-TCGTCTGCGCGAATATTTAGAGAGG Xa7 R-ATCTGCATCGGAGTCAGCAACG Xa21-LD17 F-GAGCAAAATTCGTGTGCTGA Xa21 R-GTACGCACTTTTTCCGCAAT Xa21-RT1 F-GGATCCGTCGACCACAAGAG AACTAAAAAGGGAGC R-GGATCCGTCGACCCCGGGCAG AAGTCGATCTGAAGTGTGGCA Xa21 Xa26-LDex1 F-TGACCTCACTGCACTTCTGG Xa26 R-TGGAGAGGTTCCCTATGGTG Xa26-LDex2 F-GTAAAGCGTCACGGAAGAGC Xa26 R-TTCTTCAACGTCACAACAACATC Xa4-LD8 F-CTGGCGGAAATTGAAAAAGA Xa4 R-GCTCACCGGGGTATAATCCT Xa4-RT1 F-ATCGATCGATCTTCACGAGG Xa4 R-TGCTATAAAAGGCATTCGGG 153

3 termasuk ke dalam posisi peta gen Xa7, yaitu Xa7-SNP5 pada AP dan Xa7SNP11 pada AP (Utami et al. 2010). Hasil penelitian lain juga menyebutkan adanya tiga marka yang bersifat co-segregation dengan gen Xa7, yaitu RM20589, RM20590, dan RM20591, ketiganya terdapat pada fragmen AP (Chen et al. 2008). Berdasarkan beberapa hasil penelitian tersebut maka marka-marka penanda untuk gen Xa7 diaplikasikan untuk seleksi tetua persilangan. Seperti telah disebutkan di depan bahwa beberapa tetua persilangan yang telah disurvei polimorfismenya adalah antara IRBB66 dengan Ciherang dan IRBB10 dengan Ciherang. Beberapa marka yang polimorfis untuk pasangan tetuatetua tersebut selanjutnya akan digunakan untuk membantu seleksi progeni-progeni dari populasi hasil persilangan. Hasil survei polimorfisme menggunakan marka penanda gen Xa7 pada tetua-tetua tersebut disajikan pada Gambar 1. Hasil analisis PCR pada Gambar 2 menunjukkan adanya polimorfisme pada marka RM20589, antara tetua donor IRBB10 (nomor 1) dengan tetua Ciherang (nomor 2); pada marka RM20590, antara tetua donor IRBB10 (nomor 1) dengan Ciherang (nomor 2), antara tetua IRBB66 (nomor 3) dengan tetua Ciherang (nomor 4). Polimorfisme ini ditunjukkan oleh pita DNA yang berukuran sekitar 300pb dan 600pb. Pada marka RM20591 tidak diperoleh polimorfisme antara tiga tetua donor, IRBB10, dan IRBB66 dengan tetua Ciherang. Dengan demikian, marka RM20589 dan RM20590 dapat digunakan untuk membantu seleksi progeni hasil persilangan antara IRBB10 dengan Ciherang dan antara IRBB66 dengan Ciherang, untuk gen target Xa7. Identifikasi Marka Gen Xa21 dan Aplikasinya untuk Seleksi Tetua Gen Xa21 merupakan multigen yang terdiri atas delapan gen penyusun. Sebagian besar dari anggota gen-gen ini terpetakan dalam satu lokus pada kromosom 11 (Song et al. 1995). Total ukuran gen Xa21 kurang lebih pasang basa yang terpetakan pada lokus LOC- Os , memanjang pada region antara 20,336,827 sampai 20,340,422 (Gramene Annotated Nipponbare Sequence 2009). Dari total ukuran gen Xa21, didesain 30 marka molekuler yang masing-masing menandai region pasang basa dari total ukuran gen Xa21. Di antara 30 marka molekuler penanda gen Xa21 yang didesain, dua marka (Xa21-LD17 dan Xa21-LD21) telah digunakan dalam analisis survei polimorfis antara varietas IRBB66-Ciherang dan IRBB10-Ciherang. Hasil survei polimorfisme menggunakan marka penanda gen Xa21 pada tetua-tetua tersebut dapat dilihat pada Gambar 2. Pada Gambar 2 terlihat bahwa marka Xa21-LD17 bersifat monomorfis, sedangkan marka Xa21-LD21 bersifat polimorfis. Marka Xa21-LD17 menandai region antara 1981 sampai 2041, sedangkan marka Xa21-LD21 menandai region antara 2461 sampai 2581 pasang basa dari total gen Xa21. Polimorfisme pada marka Xa21-LD21 terlihat pada posisi pita DNA yang berukuran sekitar 800 pb. Adanya polimorfisme marka Xa21-LD21 ditunjukkan antara varietas IRBB66 dengan Ciherang dan juga antara varietas IRBB10 dengan Ciherang. Identifikasi Marka Gen Xa4/Xa26 dan Aplikasinya untuk Seleksi Tetua Pendesainan primer untuk gen Xa4 didasarkan pada hasil penelitian (Zhai et al. 1999) yang menyebutkan bahwa Xa4 adalah gen ketahanan HDB yang berukuran 90 kb, yang terpetakan di antara marka 56M22F dan 36D24R. Yang et al menyebutkan bahwa Xa4 terpaut dekat dengan Xa26 pada kromosom 11. Xa26 terpetakan pada posisi Mb yang ditandai oleh marka RFLP Y6855R dan R1506, sedangkan Xa4 dipetakan pada posisi 28.5 Mb juga pada kromosom 11 yang ditandai oleh marka RFLP L1044 dan Y2668LA RM20589 Xa21-LD17 Xa21-LD21 RM20590 RM pb Xa21-LD pb Xa21-LD pb 300 pb Gambar 1. Hasil analisis PCR DNA tetua-tetua menggunakan marka SSR yang bersifat co-segregation dengan gen Xa7, yaitu RM20589, RM20590 dan RM Urutan sampel: 1. IRBB10, 2. Ciherang, 3. IRBB66, dan 4. Ciherang. Gambar 2. Hasil analisis PCR DNA tetua-tetua menggunakan marka spesifik untuk gen Xa21, yaitu Xa21-LD17 dan Xa21- LD21. Urutan sampel: 1. IRBB10, 2. Ciherang, 3. IRBB66, dan 4. Ciherang. 154

4 PENELITIAN PERTANIAN TANAMAN PANGAN VOL. 29 NO Dist cm Gambar 3. Sebagian dari peta fisik kromosom 11 beserta marka molekuler yang terpaut pada posisi kromosom 2.5cM sampai 12.5cM. Gambar 4. Hasil analisis PCR DNA tetua-tetua menggunakan marka spesifik untuk gen Xa26, yaitu Xa26-LD36 dan Xa26- LD48. Urutan sampel: 1. IRBB10, 2. Ciherang, 3. IRBB66, dan 4. Ciherang. (Wang et al. 2000). Posisi beberapa marka ini dapat dilihat pada bagian peta fisik kromosom 11 (Gambar 3). Penelitian lain juga menyebutkan bahwa Xa26 terpaut dekat atau bahkan merupakan family gen Xa3 (Yang et al. 2005). Hasil analisis gabungan (association test) antara data sekuensing dengan fenotipe, yang merupakan data tingkat ketahanan terhadap tiga ras utama (ras III, IV dan VIII), menunjukkan bahwa region dari gen Xa26 pada posisi Xa26-LD9 (27,626,581-27,768,402) memiliki tingkat signifikansi paling tinggi (Utami et al. unpublished). Kedua marka penanda gen ketahanan terhadap patogen HDB tersebut telah diaplikasikan untuk survei polimorfisme tetua-tetua persilangan antara IRBB10 dengan Ciherang dan antara IRBB66 dengan Ciherang. Hasil survei polimorfisme tersebut disajikan pada Gambar 4. Gambar 4 menunjukkan bahwa marka penanda gen ketahanan Xa26, yaitu Xa26-LD36, bersifat polimorfis untuk tetua-tetua persilangan antara IRBB10 dengan Ciherang dan antara IRBB66 dengan Ciherang. Polimorfis ini ditunjukkan oleh pita DNA yang berukuran kurang lebih 300 pb dan 400 pb. Namun marka Xa26- LD48 bersifat monomorfis, sehingga hanya marka Xa26- LD36 yang dapat digunakan dalam membantu seleksi progeni-progeni hasil persilangan kedua tetua di atas. Untuk marka molekuler penanda gen ketahanan terhadap penyakit HDB, Xa4 juga telah diaplikasikan untuk analisis polimorfisme antara tetua-tetua persilangan. Hasil analisis polimorfisme pada Gambar 5 menunjukkan bahwa marka Xa4-LD15 bersifat polimorfis sebagai penanda gen ketahanan Xa4, untuk tetua-tetua yang digunakan. Polimorfisme ini ditunjukkan oleh pita DNA yang berukuran kurang lebih 150 pb. Namun marka pada Xa4-LD8 tidak terlihat adanya polimorfisme antara tetua-tetua yang dianalisis. Dengan demikian hanya marka Xa4-LD15 yang dapat digunakan untuk membantu seleksi progeni-progeni hasil Xa4-LD8 150 pb Gambar 5. Hasil analisis PCR DNA tetua-tetua menggunakan marka spesifik untuk gen Xa4, yaitu Xa4-LD8 dan Xa4-LD15. Urutan sampel: 1. IRBB10, 2. Ciherang, 3. IRBB66, dan 4. Ciherang. Xa26-LD36 Xa26-LD48 persilangan antara IRBB10 dengan Ciherang dan antara 400 pb IRBB66 dengan Ciherang. 300 pb KESIMPULAN Lima marka molekuler yang terpaut dengan gen-gen ketahanan terhadap penyakit HDB telah diperoleh dan menunjukkan data alel polimorfis antara varietasvarietas tetua donor (IRBB66 dan IRBB10) dengan varietas penerima (Ciherang). Marka-marka molekuler tersebut adalah RM20589 dan RM20590 untuk gen Xa7, Xa21-LD21 untuk gen gen Xa21, Xa26-LD36 untuk gen Xa26, dan Xa4-LD15 untuk gen Xa4. Marka-marka tersebut diharapkan dapat diaplikasikan dalam proses seleksi progeni hasil persilangan kedua tetua tersebut. UCAPAN TERIMAKASIH Xa4-LD15 Penelitian ini sebagian didanai oleh Konsorsium Padi Nasional pada tahun 2010, dengan judul proposal Perakitan Galur Tahan HDB Berspektrum Luas (No. 155

5 06.06.PR.220). Untuk itu diucapkan terima kasih kepada penyandang dana penelitian. DAFTAR PUSTAKA Chen, S., Z. Huang, L. Zeng, J. Yang, Q. Liu, and X. Zhu High resolution mapping and gene prediction of Xanthomonas oryzae pv. oryzae resistance gene Xa7. Mol. Breeding Ghazi, I.A., P.S. Srivastava, V. Dalal, K. Gaikwad, A.K. Singh, T.R. Sharma, N.K. Singh, and T. Mohapatra Physical mapping, expression analysis and polymorphic survey of resistance gene analogues on chromosome 11 of rice. J Biosci, 34(2): Martin, G.B., A.J. Bogdonove, and G. Sessa Understanding the functions of plant disease resistance protein, Annu. Rev. Plant Biol. 54: Song, W.Y., G.L. Wang, L.L. Chen, H.S. Kim, L.Y. Pi, T. Holsten, J. Gardner, B. Wang, W.X. Zhai, L.H. Zhu A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science, 270(5243): The Rice Chromosome 11 and 12 Sequencing Consortia (TRC11-12 SC) The sequence of rice chromosome 11 and 12, rich in disease resistance genes and repeat gene duplications. Walksman Institute, Rutgers University, Pascataway, New Jersey Utami, D.W., E.M. Septiningsih, T.S. Kadir, Fatimah, dan S. Yuriyah Allele mining untuk identifikasi gen ketahanan penyakit hawar daun bakteri, Xa7 pada plasma nutfah padi lokal Indonesia. Jurnal Agrobiogen 6(1):1-9. Yang, Z., X. Sun, S. Wang, and Q. Zhang Genetic and physical mapping of a new gene for bacterial blight resistance in rice. TAG, 106(8): Yang, B, A. Sugio, and F.F. White Avoidance of host recognition by alterations in the repetitive and C-terminal regions of AvrXa7, a type III effector of Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Mol. Plant Microbe Interact. 18(2): Huang, N., E.R. Anggeles, J. Domingo, G. Magpantay, G.S. Singh, Z. Zhang, N. Kumaravadivel, J. Bennett, and G.S. Khush Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice makerassisted selection using RFLP and PCR. Theor. Appl. Genet. 95: Triny, S.K., I. Hanarida, D.W. Utami, S. Koerniati, A.D. Ambarwati, A. Apriana, dan S. Sisharmini Evaluasi ketahanan populasi haploid ganda silangan IR64 dan Oryza rufipogon terhadap hawar daun bakteri pada stadia bibit. J. Plasma Nutfah 15(1): Wang, W., Y. Zhou, G. Jiang, B.J. Ma, X. Chen, Q. Zhang, L. Zhu, and W. Zhai Fine mapping of the rice bacterial blight resistance gene Xa4 and its co-segregation marker. China Sci.Bull. 45(19): Zhai, W.X. and L.H. Zhu Rice bacterial blight resistance genes and their utilization in molecular breeding. Adv. Biotech. 19: