APLIKASI MARKA MOLEKULER UNTUK SELEKSI GALUR-GALUR PUP1 HASIL PERSILANGAN SITU BAGENDIT DAN BATUR. Abstrak

Transkripsi

1 35 APLIKASI MARKA MOLEKULER UNTUK SELEKSI GALUR-GALUR PUP1 HASIL PERSILANGAN SITU BAGENDIT DAN BATUR Abstrak Indonesia memiliki potensi lahan kering masam yang cukup besar, dimana lahan tersebut memiliki kadar hara yang rendah, khususnya unsur P. Introgresi segmen Pup1 ke dalam genom padi modern Indonesia diharapkan bisa meningkatkan penangkapan P yang ada di larutan tanah, sehingga meningkatkan hasil pada kondisi kurang P. Untuk mencapai hal tersebut telah dilakukan kegiatan introgresi Pup1 dari tetua donor yang berasal dari IRRI (Kasalath dan NIL-C443) ke dalam varietas modern Indonesia (Situ Bagendit dan Batur) di rumah kaca dan Lab. Biologi Molekuler, BB-Biogen, dan sebagian di Molecular Breeding Laboratory, IRRI, pada tahun Metode yang digunakan adalah silang balik sampai generasi BC 2 F 3. Seleksi individu hasil persilangan menggunakan marka foreground, recombinant, dan background. Marka-marka tersebut diaplikasikan sejak tanaman F 1, BC 1 F 1, BC 2 F 1, dan BC 2 F 2. Seleksi dengan marka foreground dan recombinant menunjukkan seluruh tanaman BC 2 F 2 telah mengandung segmen Pup1 dengan keadaan homozigot. Hasil analisis molekuler menggunakan marka background pada individu terbaik BC 2 F 2 menunjukkan lokus-lokus homozigot yang dideteksi lebih banyak didapatkan pada persilangan dengan NIL-C443, dibandingkan dengan Kasalath. Segmen Kasalath yang masih tertinggal pada individu BC 2 F 2 terbaik pada persilangan Situ Bagendit x Kasalath diperkirakan sebesar 31,7 cm (1,77%) sedangkan pada Batur x Kasalath diperkirakan sebesar 48,2 cm (2,6%). Segmen Nipponbare (dari NIL- C443) yang masih tertinggal pada individu terbaik BC 2 F 2 persilangan Situ Bagendit x NIL-C443 diperkirakan sebesar 35,16 cm (1,96%), sedangkan Batur x NIL-C443 diperkirakan sebesar 28,8 cm (1,61 %). Penggunaan marka-marka molekuler ini terbukti lebih mempercepat dalam pengembalian genom individu hasil persilangan kepada genom tetua pemulih dibandingkan dengan teknologi konvensional. Kata kunci : Pup1, padi, marka foreground, marka recombinant, marka background Abstract Indonesia has very large acid-dryland with low nutrient, especially P element. Introgression of Pup1 segment into Indonesian modern rice genome is expected to increase P uptake ability in the soil solution, wich insure to increase yield under low P condition. In order to achieve this, activity on the introgression of the Pup1 from donor parent derived from IRRI (Kasalath and NIL-C443) into Indonesian modern varieties (Situ Bagendit and Batur) was conducted in both, greenhouse and Biology Molecular Lab, Indonesia and small part in Molecular Breeding Laboratory, IRRI ( ). Marker assisted backcrossing using foreground, recombinant, and background markers, were applied on F 1, BC 1 F 1, BC 2 F 1, and BC 2 F 2 plants. Selection of foreground and recombinant markers showed homozygote Pup1 locus at all of BC 2 F 2 plants. The genetic background of

2 36 the recipient parents was recovered in plants at the BC 2 F 2 generation, especially in NIL-C443 crosses, with only few loci from the donor parent others than Pup1 remaining. Kasalath segment which still remaining in the best BC 2 F 2 plant of Situ Bagendit x Kasalath is predicted around 31.7 cm (1.77%), whereas Batur x Kasalath is 48.2 cm (2.6%). Nipponbare segment (from NIL-C443) which still remaining in the best BC 2 F 2 plant of Situ Bagendit x NIL-C443 is predicted around cm (1.96%), whereas Batur x NIL-C443 is 28.8 cm (1.96%). Application of these molecular markers demonstrated that technology can rapidly recover lines with genome back to recurrent parent (Situ Bagendit or Batur), if it is compared to conventional breeding. Keywords : Pup1, rice, foreground markers, recombinant markers, background markers Pendahuluan Perakitan tanaman baru yang lebih baik mulai banyak dilakukan dengan memanfaatkan marka molekuler yang dikombinasikan dengan metode persilangan biasa. Kegiatan ini berkembang pesat karena perkembangan marka molekuler yang cukup handal dan sudah terbukti dapat membantu seleksi galur-galur hasil persilangan (Babu et al. 2004). Salah satu cara penerapan seleksi marka molekuler pada individu hasil persilangan adalah melakukan silang balik (MABC) yang dipadukan dengan pemanfaatan marka foreground, recombinant, dan background untuk menyeleksi individu untuk setiap generasi (Semagn et al. 2006). Menurut Ribaut dan Hoisington (1998) dengan menggunakan metode MABC ini untuk mengembalikan genom tanaman 98% seperti tetua pemulih hanya dibutuhkan dua kali silang balik, sedangkan dengan cara konvensional (tanpa bantuan marka molekuler) diperlukan 4-5 kali silang balik. Marka foreground sebetulnya sudah dikenal lama sebagai flanking marker (=marka pengapit), tapi berbeda dengan marka pengapit marka foreground ini merupakan marka yang jaraknya sangat dekat dengan gen target (tightly linked), bahkan kadang-kadang digunakan marka gen (atau kandidat gen) itu sendiri, sedangkan marka recombinant adalah marka di sekitar marka foreground yang bisa dipakai untuk memprediksi kondisi segmen gen target tersebut. Tahap selanjutnya dalam seleksi galur-galur hasil persilangan adalah dengan menggunakan marka sebanyak-banyaknya yang tersebar di seluruh kromosom

3 37 untuk melihat kondisi genom individu hasil persilangan. Tahap ini dinamakan seleksi background (background selection). Penggunaan seleksi background ini diperkirakan akan mempercepat pemulihan genom tetua pemulih. Individu yang memiliki kondisi genom homozigot mengikuti tetua pemulih terbanyak dipilih untuk tahap persilangan berikutnya. Seleksi background memiliki dua tujuan : (1) mengurangi proporsi genom donor pada kromosom pembawa segmen gen donor (2) mengurangi genom donor pada kromosom lain (Friscth et al. 1999). Marka untuk Pup1 sudah dipetakan dengan baik sejak tahun 1998 sampai sekarang, bahkan sudah banyak dibuat marka-marka yang spesifik untuk Pup1 (Wissuwa et al. 1998, 2002; Collard et al. 2006; dan Heuer et al. 2009). Oleh karena itulah dilakukan penelitian untuk memasukkan Pup1 ke dalam varietas padi Indonesia melalui metode seleksi silang balik (Backcross) dengan memanfaatkan marka spesifik untuk Pup1 sebagai marka foreground. Markamarka Pup1 ini telah diperoleh dengan meneliti sekuen dari lokus yang mengatur toleransi terhadap defisiensi P, yakni pada ukuran 15,31-15,47 Mb pada Kasalath. Sekuen sebesar 278 kb dari Kasalath ini bersifat unik dan tidak didapatkan pada Nipponbare, sehingga diduga Pup1 terdapat di daerah tersebut (Heuer et al. 2009). Marka-marka mikrosatelit yang tersebar di seluruh kromosom padi dimanfaatkan sebagai marka background untuk mempercepat pengembalian genom individu hasil persilangan kembali seperti tetua pemulih. Bahan dan Metode Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Biologi Molekuler dan rumah kaca Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB- Biogen), Jalan Tentara Pelajar No 3A, Bogor 16111, mulai Agustus 2006 sampai dengan Mei 2009, dan di antaranya pada 20 Oktober 2007 sampai dengan 20 Januari 2008 dikerjakan di Molecular Breeding Laboratory, IRRI, Los Banos, Filipina. Bahan Penelitian Materi tanaman terdiri 2 varietas unggul padi gogo Indonesia (Situ Bagendit dan Batur) dan 2 genotipe sumber Pup1 dari IRRI (Kasalath dan NIL-

4 38 C443 [=Nil-Pup1]). Primer yang digunakan adalah 2 primer foreground, 2 primer recombinant, dan primer-primer mikrosatelit (minimal 10 primer polimorfis tiap kromosom) untuk seleksi background. Primer-primer foreground dan recombinant yang digunakan dalam seleksi dapat dilihat dalam Tabel 6. Primerprimer untuk seleksi background berbeda-beda pada setiap generasi dan tidak ditampilkan secara keseluruhan. Hanya primer-primer yang memberikan hasil homozigot saja yang ditampilkan dalam grafik genotipe masing-masing persilangan (Gambar 15 dan 16) Tanaman yang dipakai untuk analisis molekuler menggunakan primer foreground dan recombinant bervariasi untuk setiap generasi. Jumlah tanaman untuk seleksi background sama untuk semua generasi (20 tanaman tiap persilangan). Tabel 6. Marka-marka yang digunakan dalam seleksi tanaman F 1, BC 1 F 1, BC 2 F 1, dan BC 2 F 2 a. Tanaman F 1 StBgdt x Kas StBgdt x NIL Btr x Kas Btr x NIL RM28102 RM28102 RM277 RM277 RM519 RM519 RM519 RM519 b. Tanaman BC 1 F 1 dan Tanaman BC 2 F 1 No Jenis Primer StBgdt x Kas StBgdt x NIL Btr x Kas Btr x NIL 1 Primer recombinant I RM28102 RM28102 RM277 RM277 2 Primer foreground SSR3 SSR3 RM1261 RM Primer recombinant II RM519 RM519 RM519 RM519 c. Tanaman BC 2 F 2 No Jenis Primer StBgdt x Kas St Bgdt x NIL Btr x Kas Btr x NIL 1 Primer recombinant I RM179 RM28067 RM1337 RM Primer foreground Kas 1n-C *) Kas19-C2 Kas 30-1n Kas1n-C Kas19-C2 Kas 30-1n Kas1n-C Kas5n-NK-C Kas 30-1n) 3 Primer recombinant II RM RM28102 RM511 RM465 Ket.: *) Kas1n-C adalah marka dominan sehingga belum diketahui kondisi genotipe tanaman terpilih apakah AA atau Aa sehingga digunakan primer tambahan (Kas30n-1) Kas1n-C Kas5n-NK-C Kas 30-1n Metode Penelitian Pembentukan benih F1 Materi yang digunakan adalah varietas unggul Indonesia, yakni Situ Bagendit dan Batur (tetua betina) sedangkan padi dari IRRI adalah Kasalath dan

5 39 NIL-C443 (tetua jantan). Persilangan dilakukan antar kedua kelompok tersebut sehingga didapatkan 4 kombinasi persilangan. Untuk menghasilkan biji F1 dilakukan penanaman sebanyak 5 kali (tahap) dengan masing-masing tahap berselang 1 minggu. Setelah tanaman berumur hari (tergantung jenis padi) maka dilakukan persilangan. Bunga yang telah dihibridisasi kemudian ditutup dengan kertas minyak. Penggunaan marka molekuler untuk menghasilkan benih BC 1 F 1 Masing-masing persilangan diambil biji F1 sebanyak 100 butir dan ditanam dalam 5 tahap/minggu (masing-masing tahap 20 biji). Benih padi F1 yang terpilih ditanam dalam bak plastik berisi tanah. Tiap kali penanaman dilakukan uji molekuler dengan menggunakan 2 primer (Tabel 6) untuk menentukan tanaman mana yang mengandung pita dari kedua tetua. Prosedur uji molekuler sama seperti pada kegiatan 1. Tanaman yang menghasilkan pita heterozigot (mengandung pita dari dua tetua) yang dipilih. Tanaman yang terpilih kemudian diambil dari bak plastik dan dipindahkan ke dalam ember berisi tanah. Tanaman dipelihara sampai besar dan kemudian dilakukan persilangan dengan salah satu tetua pemulih (Situ Bagendit atau Batur). Penggunaan marka molekuler untuk menghasilkan benih BC 2 F 1 Biji-biji generasi BC 1 F 1 ditanam dalam bak plastik. Masing-masing persilangan ditanam sekitar 300 butir dalam 4 tahap penanaman (75 tanaman/tahap). Tiap tahap yang diuji dengan 3 primer (foreground dan recombinant) dan kemudian dipilih 5 tanaman (total 20 tanaman tiap persilangan) untuk digunakan dalam analisis molekuler menggunakan marka-marka background. Dasar pemilihan 20 puluh tanaman ini adalah yang memiliki pita heterozigot pada 3 primer tersebut. Dua puluh tanaman terpilih tiap persilangan ini kemudian dipindahkan ke dalam ember dan kemudian dilakukan amplifikasi menggunakan marka-marka untuk seleksi background sebanyak 48 primer. Dari dua puluh tanaman ini, hanya 2 tanaman (1 tanaman utama dan 1 tanaman cadangan) yang disilang balikkan ke tanaman pemulih. Dasar pemilihan adalah jumlah lokus homozigot ke tetua pemulih terbanyak.

6 40 Penggunaan marka molekuler untuk menghasilkan benih BC 2 F 2 (seleksi foreground dan recombinant dikerjakan di BB-Biogen, seleksi background dikerjakan di IRRI) Biji-biji dari tanaman BC 2 F 1 (satu nomor tiap persilangan) sebanyak ± butir ditanam dalam bak pertanaman. Masing-masing persilangan dilakukan uji molekuler menggunakan 1 primer foreground dan 2 primer recombinant. Masing-masing persilangan dipilih 20 tanaman yang secara molekuler mengandung segmen DNA dari tetua donor. Pada individu BC 2 F 1 ini individu yang memiliki dua pita (heterozigot) yang dipilih untuk seleksi background. DNA dari keduapuluh tanaman ini kemudian diamplifikasi dengan menggunakan primer-primer polimorfik untuk seleksi background. Dua puluh tanaman ini dipelihara sampai panen untuk menghasilkan biji BC 2 F 2. Pada akhirnya hanya dipilih 1 tanaman saja untuk diteruskan ke generasi berikutnya. Dasar pemilihan adalah jumlah lokus homozigot terbanyak ke tetua pemulih. Primer-primer yang telah menghasilkan pita homozigot seperti tetua pemulih pada tanaman BC 1 F 1 tidak digunakan dalam kegiatan ini. Penggunaan marka molekuler untuk menghasilkan benih BC 2 F 3 Biji-biji generasi BC 2 F 2 (satu nomor tiap persilangan) sebanyak ± butir ditanam dalam bak plastik. Masing-masing persilangan dilakukan uji molekuler menggunakan 2 primer foreground (= marka spesifik untuk Pup1) dan 2 primer recombinant. Sebanyak 20 tanaman dipilih berdasarkan kondisi pita yang dihasilkan tiap individu. Individu yang memiliki pita homozigot untuk keempat marka tersebut yang dipilih untuk seleksi background. DNA dari keduapuluh tanaman ini diamplifikasi menggunakan primer-primer polimorfik untuk seleksi background. Dua puluh tanaman ini dipelihara sampai panen untuk menghasilkan biji BC 2 F 3. Generasi BC 2 F 3 inilah yang digunakan dalam pengujian P di rumah kaca dan lapangan. Seleksi foreground dan recombinant (tanaman F 1, BC 1 F 1, BC 2 F 1, BC 2 F 2 ) DNA dari masing-masing tanaman diisolasi dalam skala kecil menggunakan metode Dellaporta et al. (1983) yang dimodifikasi (Mercaptoetanol diganti

7 41 dengan SDS, dan ditambah Chloroform Isoamilalkohol). Reaksi PCR dilakukan pada 20 µl volume yang mengandung 1 x bufer PCR (10 mm tris-hcl (ph 8,3), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,01% gelatin), 100 µm dntps (datp, dctp, dgtp, dttp), 0,5 µm primer (F dan R), 1 : 10 DNA, dan 1 unit taq DNA polimerase (IRRI taq). Program PCR yang digunakan adalah 5 menit pada suhu 94 o C untuk denaturasi permulaan, selanjutnya dilakukan 35 siklus yang terdiri dari: 60 detik pada suhu 94 o C untuk denaturasi, 60 detik pada suhu 55 o C untuk penempelan primer, dan 2 menit pada suhu 72 o C untuk perpanjangan primer. Perpanjangan primer terakhir selama 7 menit pada suhu 72 o C. Hasil PCR kemudian dipisahkan menggunakan gel poliakrilamid 5% (denaturing gel). Denaturing gel adalah gel yang dalam penggunaannya memerlukan DNA yang harus dipisahkan/didenaturasi terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam gel. Gel ini membutuhkan urea dalam proses pembuatannya. Pewarnaan DNA dilakukan dengan metode silver staining. Skoring hasil PCR dilakukan dengan melihat pola pita di atas kaca secara langsung. Seleksi background (tanaman BC 1 F 1, BC 2 F 1, dan BC 2 F 2 ) (Seleksi background pada tanaman BC 2 F 1 sebagian dilakukan di IRRI) Nomor-nomor tanaman yang sudah terpilih berdasarkan seleksi foreground dan recombinant digunakan sebagai template dalam proses amplifikasi DNA menggunakan marka-marka mikrosatelit yang prosedurnya telah diuraikan sebelumnya. Proses pewarnaan hasil PCR menggunakan metode silver staining. Untuk kegiatan di IRRI prosedur amplifikasi DNAnya sama, sedangkan prosedur pewarnaan dan dokumentasi hasil PCR berbeda. Setelah dilakukan amplifikasi, pita DNA dipisahkan dengan menggunakan gel poliakrilamid 8% (non-denaturing gel). Non-denaturing gel adalah gel yang dalam penggunaannya memerlukan DNA yang tidak perlu dipisahkan/ didenaturasi terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam gel. Gel ini tidak memerlukan urea dalam pembuatannya. Setelah terjadi pemisahan DNA dalam gel ini, kemudian gel direndam dalam larutan Cyber safe selama 10 menit kemudian didokumentasi dalam alat Gel Doc. Skoring dilakukan dengan melihat pita-pita DNA di dalam layar komputer.

8 42 Hasil dan Pembahasan Pembentukan Benih F 1,BC 1 F 1, BC 2 F 1,BC 2 F 2, dan BC 2 F 3 Kegiatan pembentukan benih untuk membentuk galur-galur baru yang mengandung Pup1 dilakukan dengan metode persilangan biasa, namun untuk seleksi tanaman yang akan disilangkan menggunakan bantuan marka molekuler, terutama pada saat akan membentuk benih BC 1 F 1, BC 2 F 1, BC 2 F 2, dan BC 2 F 3. Untuk membentuk benih F 1 tidak menggunakan marka molekuler. Hasil pembentukan benih yang telah dihasilkan selama penelitian ini dapat dilihat dalam Tabel 7. Tabel 7. Jumlah benih yang dihasilkan tiap generasi No Benih SB x Kas SB x NIL Btr x Kas Btr x NIL 1 F BC 1 F (6 F1) 307 (11F1) 230 (5F1) 403 (6F1) 3 BC 2 F 1 #1082 = 181 #1143 *) = 392 #1360 *) =165 #1429=120 #2032 *) = 290 #2066 = 420 #2335 = 352 #2372 *) =406 4 **) BC 2 F 2 >500 >500 >500 >500 5 **) BC 2 F 3 >500 >500 >500 >500 Ket. : SB = Situ Bagendit, Btr = Batur, Kas = Kasalath, dan NIL=NIL-C443 *) tanaman yang dipilih untuk kegiatan berikutnya. **) masing-masing persilangan terdapat 20 nomor tanaman. Benih F1 yang dihasilkan dari persilangan dengan Kasalath lebih banyak dibandingkan yang disilangkan dengan NIL-C443. Hal ini mungkin disebabkan perbedaan genom antara padi tipe indica (Kasalath) dengan padi tipe japonica (NIL-C443). Padi Indonesia yang digunakan sebagai tetua betina adalah tipe indica sehingga saat disilangkan dengan Kasalath penyesuaian antar paangan kromosom saat penyerbukan tidak mengalami kendala. Lain halnya dengan apabila disilangkan dengan padi tipe japonica (NIL-C443) terjadi ketidaksesuaian antar pasangan kromosom, sehingga sering terjadi kerontokan benih setelah terjadi penyerbukan. Perbaikan genetik pada persilangan indica vs japonica ini biasanya akan kembali normal pada generasi F4 atau F5. Kehampaan antara kedua subspecies ini sudah diteliti secara molekuler (Ikehashi 2009). Benih-benih BC 1 F 1 dihasilkan dari persilangan silang balik tanaman F 1 dengan tetua pemulih. Pada kegiatan ini menggunakan beberapa primer pengapit

9 43 saja untuk memilih tanaman mana yang kondisi genotipenya heterozigot. Pada pembentukan benih BC 2 F 1 mulai dilakukan analisis molekuler menggunakan primer foreground, recombinant, dan background. Tanaman BC 1 F 1 sebagai tanaman material utama juga hanya dua yang digunakan, satu yang akan diteruskan untuk kegiatan selanjutnya, satu tanaman sebagai cadangan seandainya tanaman utama tidak menghasilkan benih yang cukup. Pada kegiatan ini dilakukan seleksi background tapi hanya menggunakan 4 primer/kromosom, mengingat waktu yang sempit sebelum tanaman harus mulai disilangkan. Benihbenih BC 2 F 2 dan benih BC 2 F 3 dihasilkan dari proses persilangan sendiri (selfing). Pembentukan benih-benih untuk merakit galur-galur padi yang toleran terhadap defisiensi P menggunakan cara konvensional dan mengandalkan proses rekombinasi secara bebas, sehingga bagian Pup1 yang terintegrasi ke dalam tetua Indonesia akan bervariasi panjangnya. Satu individu akan mengandung segmen Pup1 dengan tambahan segmen tetua donor (Kasalath atau NIL-C443) dengan panjang segmen yang berbeda tiap individu. Segmen yang tidak diinginkan ini sering dinamakan dengan linkage drag. Dalam proses rekombinasi bebas tidak bisa diatur secara tepat individu yang terpilih hanya mengandung segmen gen/lokus itu sendiri. Berbeda dengan proses integrasi gen dalam rekayasa genetika dimana yang diintegrasikan dalam suatu tanaman adalah memang betulbetul satu gen saja tanpa adanya segmen-segmen tambahan yang tidak dinginkan. Pada kegiatan pembentukan benih ini tidak dilakukan pengujian fenotipik karena secara teknis tidak mungkin dilakukan. Pada pengujian P diperlukan dua set tanaman, dimana satu set harus diberi pupuk P sedangkan satu set yang lain tidak diberi pupuk, kemudian peubah jumlah anakan produktif atau bobot kering total dibandingkan antara yang tidak diberi pupuk dengan yang diberi pupuk kemudian diskor. Skor yang memiliki nilai 0-0,19 dianggap sangat peka, 0,2-0,39 dinggap peka, 0,4-0,59 dianggap sedang, 0,6-0,79 dianggap toleran, dan 0,8-1 dianggap sangat toleran (IRRI, 1996). Oleh karena itu pengujian benih-benih yang mengandung segmen Pup1 hanya bisa dilakukan pada generasi BC 2 F 3. Pada generasi ini segmen Pup1 sudah dalam keadaan homozigot dan jumlah benih yang dalam satu nomor sudah banyak dan bisa dibagi ke dalam dua set perlakuan. Pada percobaan perakitan galur-galur padi tahan blas, setiap generasi bisa dilakukan

10 44 seleksi blas dengan cara diinokulasi dengan jamur blas di dalam rumah kaca blas (blast nursery), atau saat perakitan padi toleran genangan padi seluruh individu yang akan disilangkan bisa diuji dulu dengan merendam seluruh tanaman dengan air dan langsung bisa diseleksi (Septiningsih et al. 2009). Apabila pada pembentukan galur-galur toleran P ini tidak dibantu dengan marka molekuler maka metode yang digunakan akan lebih rumit. Untuk membentuk benih BC 1 F 1 tidak banyak kesulitan karena tanaman F 1 mudah dikenali dari bentuk daun, dan tinggi tanaman. Kasalath memiliki figur yang tinggi besar dan anakan banyak, NIL-C443 memiliki figur yang pendek dan anakan sedikit, sedangkan Situ Bagendit memiliki figur yang sedang (mirip IR64) dan Batur memiliki figur yang tinggi besar (lebih pendek dibanding Kasalath). Dari bentuk bulir juga mudah dikenali. Kasalath memiliki bulu pada bulir padinya, sedangkan NIL-C443 bentuk bulirnya seperti Nipponbare yang bulat dan kecil. Situ Bagendit dan Batur memiliki bulir yang tidak berbulu dan sedang. Kesulitan mulai dihadapi pada saat pembentukan benih BC 2 F 1. Tanaman BC 1 F 1 sulit dibedakan antara satu dengan yang lain apakah masih mengandung segmen Pup1 atau tidak. Pengujian juga sulit dilakukan karena tidak ada dua set tanaman yang sama. Apalagi komponen yang digunakan sebagai peubah skoring P adalah jumlah anakan dan bobot kering tanaman, dimana dua komponen ini sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan. Oleh karena itulah marka molekuler untuk sifat toleransi terhadap defisiensi P ini sangat bermanfaat untuk seleksi tiap generasinya. Seleksi foreground dan recombinant Seleksi foreground dan recombinant merupakan kegiatan yang pertama dalam analisis molekuler. Kegiatan ini bertujuan untuk menyaring individu yang mengandung Pup1 di antara sekian ratus individu yang diuji. Analisis molekuler dimulai dengan melakukan amplifikasi menggunakan primer-primer seleksi foreground dan recombinant secara bersamaan. Hal ini dimaksudkan agar segmen Pup1 selalu bisa dipertahankan keberadaannya dalam individu hasil persilangan. Jumlah tanaman tiap generasi dapat dilihat dalam Tabel 8. Contoh

11 45 hasil seleksi dengan menggunakan primer foreground dan recombinant dapat dilihat dalam Gambar 12. Tabel 8. Jumlah tanaman yang dipakai untuk analisis molekuler menggunakan primer foreground dan recombinant No Persilangan Jumlah tanaman F 1 *) BC 1 F 1 **) BC 2 F 1 **) BC 2 F 2 **) 1 Situ Bagendit x Kasalath Situ Bagendit x NIL-C Batur x Kasalath Batur x NIL-C Ket. : Benih F1 ditabur 5 kali, benih BC 1 F 1 ditabur 4 kali, benih BC 2 F 1 ditabur 1 kali, dan Benih BC 2 F 2 ditabur 1 kali *) seharusnya 100 tanaman **) seharusnya 300 tanaman Untuk seleksi dengan primer foreground dan recombinant ini masingmasing individu tidak dilakukan skoring seperti pada kegiatan pemetaan QTL, tetapi hanya dicatat yang memenuhi syarat saja dipakai dalam analisis selanjutnya (seleksi background). Oleh karena setiap kegiatan analisis ini hanya memiliki waktu 2 minggu sebelum tanaman dipindahkan dari bak pembibitan ke dalam ember besar, maka sampel yang tidak muncul untuk satu atau semua primer yang digunakan diabaikan (tidak dilakukan pengulangan PCR). Hanya sampel yang memenuhi syarat untuk semua primer saja yang dicatat kemudian diambil secara acak (dilihat juga dengan kondisi tanaman di bak pembibitan) baru kemudian dilanjutkan dengan seleksi background menggunakan primer-primer mikrosatelit yang tersebar di seluruh kromosom padi. Untuk menyakinkan hasil seleksi awal tersebut keduapuluh sampel tanaman ini DNAnya kemudian diamplifikasi lagi dengan primer yang sama, baru kemudian dilakukan amplifikasi menggunakan primer background. Hal ini dilakukan pada tanaman BC 1 F 1, BC 2 F 1, dan BC 2 F 2 terseleksi. Dalam kegiatan seleksi foreground ini juga mengalami kendala, yakni berubahnya primer-primer yang digunakan. Pada awalnya primer-primer yang digunakan adalah primer yang sesuai dengan yang dipublikasikan oleh Collard et al. (2006), dimana antara ujung ujung marka (RM277 RM519) berjarak sekitar 5 cm (jika 1 cm = 250 kb, maka 5 cm setara 1250 kb atau 1,25 Mb [Durret et al. 2002]). Setelah dilakukan pembuatan primer-primer spesifik untuk Pup1, maka

12 46 primer yang digunakann juga berubah posisinya ke posisii di luar RM277, tapi masih di dalam daerah perkiraan posisi Pup1 (Gambar 4 dan Gambar 5). Posisi baru tersebut berada di antara primer spesifik T5-4 dan Ba76H14_7154 dengan jarak antar kedua markaa adalah 0,15 Mbp (setara 0,6 cm). Penyempitan wilayah primer dari 5 cm menjadi 0,6 cm membuat seleksi keberadaan segmen Pup1 menjadi lebih terarah lagi. Sampai saat ini pun ekplorasi gen-gen yang ada dalam segmen Pup1 tetap dilakukan di IRRI. Primer 2 (F) Primer1 (R) B A individu BC 2 F Primer3 (R) Gambar 12. Contoh hasil amplifikasi menggunakan primer foreground (F) dan recombinant (R) pada individu BC 2 F 1 Situ Bagendit x NIL- C443 yang dipisahkan dalam gel poliakrilamid 5% Ket.: A = Situ Bagendit B = NIL=C443 (Garis putus-putus menunjukkan individu yang terpilih karena memiliki pita heterozigot pada ketiga primer (foreground dan recombinant) secara bersamaan. Pita yang tidak keluar diabaikan dan tidak dilakukan pengulangan PCR. Tetua B pada primerr 3 tidak muncul tapi bisa diperkirakan dengan melihat pola pita individu BC 2 F 1.) Berdasarkan Gambar 15 dan 16 segmen yang mengandung Pup1 (kromosom 12) masih panjang, yakni Situ Bagendit x Kasalath # 960 memiliki panjang segmen tersebut 1,51 Mbp ( 6,04 cm), Situ Bagendit x NIL-C443 #1256 sebesar 1,222 Mbp ( 4,,88 cm), Batur x Kasalath # 1946 sebesar 6,25 Mbp (25 cm), Batur x NIL-C443 # 2329 sebesar 8, 03 Mbp ( 32,12 cm). Hal ini menunjukka an kondisi Pup1 lebih baik pada persilangan Situ Bagendit karena memiliki panjang segmen lebih pendek dibandingkan dengan Batur. Pada

13 47 pembentukan padi toleran genangan segmen Sub1 yang tertinggal berkisar antara 0,8 sampai 3,7 Mbp pada generasi BC 3 dari 5 persilangan (Septiningsih et al. 2009). Berdasarkan kondisi ini persilangan lebih baik diteruskan sampai BC 3, namun galur yang akan digunakan sebagai materi genetik harus galur-galur yang sudah terbukti toleran terhadap defisiensi P melalui pengujian beberapa kali. Dalam kegiatan seleksi menggunakan marka foreground dan recombinant, ada yang mengabaikan peran marka recombinant karena marka foreground sudah dianggap cukup ampuh dipakai sebagai alat seleksi. Dalam prakteknya mereka hanya menggunakan marka foreground (marka pengapit) lalu dilanjutkan dengan marka background (Gopalakhrishnan et al. 2008). Namun, dalam proses rekombinasi bebas setiap individu hasil persilangan belum diketahui secara pasti apakah mereka membawa segmen DNA secara utuh ataukah terpotong di ujungujungnya. Mungkin faham yang mengabaikan peran marka recombinant berpendapat bahwa marka foreground (=marka pengapit) sudah cukup dipakai karena belum spesifik ke gen, tapi dipastikan gen tersebut berada di tengah-tengah antara dua marka (biasanya bisa dilihat dari nilai LOD, umumnya minimal 3 untuk mencapai selang kepercayaan 99% [Ooijen 1999]). Jadi, tanpa marka recombinant pun tidak menjadi masalah. Berbeda halnya apabila marka yang digunakan adalah marka spesifik untuk gen target, dengan jangkauan segmen DNA yang sangat pendek (biasanya kurang dari 1 cm), maka dibutuhkan bantuan marka lain di luar wilayah marka spesifik untuk meyakinkan bahwa segmen DNA tersebut benar-benar telah mengandung gen target. Apalagi bila populasi yang digunakan sangat besar biasanya dilakukan dua kali seleksi. Seleksi pertama menyaring individu dengan marka foreground, dilanjutkan dengan seleksi tahap kedua dengan menggunakan marka recombinant. Untuk kegiatan ini marka foreground dan recombinant digunakan sekaligus untuk menghemat waktu pelaksanaan. Pada individu-individu yang sudah terseleksi bisa dilakukan dengan beberapa marka spesifik lainnya (biasanya marka-marka untuk gen spesifik banyak jumlahnya). Pada kegiatan analisis molekuler menggunakan primer foreground dan recombinant, jumlah individu yang terseleksi lebih mudah didapatkan pada tanaman F 1, BC 1 F 1, dan BC 2 F 1. Hal ini mengacu pada persentase rekombinasi

14 48 genotipe masing-masing individu adalah 50% heterozigot (Aa), 25% homozigot (AA), dan 25% homozigot (aa). Pada saat seleksi tanaman BC 1 F 1 walaupun jumlah individu yang digunakan sangat sedikit (Tabel 8), namun seleksi tanaman untuk tahap selanjutnya tidak terlalu sulit karena persentase mendapatkan individu yang heterozigot masih besar (50%). Berbeda halnya saat dilakukan seleksi pada tanaman BC 2 F 2, jumlah individu yang terpilih menjadi sangat sedikit karena harus memilih individu yang homozigot untuk segmen Pup1, padahal persentase kemungkinan segmen Pup1 yang homozigot hanya sekitar 25%. Berarti apabila menggunakan 300 tanaman kemungkinan mendapat tanaman yang dimaksud hanya sekitar 75 tanaman. Ini pun harus dicocokkan juga dengan kondisi hasil amplifikasi dengan primer recombinant. Oleh karena itulah pemisahan hasil amplifikasi dengan primer foreground dan recombinant dilakukan serentak pada gel poliakrilamid 4,5 % dengan menggunakan plate kaca yang panjang. Kemampuan multiload (4 kali loading tiap kaca) menyebabkan skoring masingmasing individu mudah dilakukan karena tinggal melihat hasil masing-masing individu pada primer foreground (2 primer) dan primer recombinant (2 primer). Dalam satu jalur (satu individu) akan berisi 4 pola pita yang mencerminkan kedua jenis primer tersebut. Hal ini akan memudahkan pada saat scoring hasil amplifikasi. Individu yang memenuhi syarat untuk semua jenis primer dicatat dan bisa dipilih untuk seleksi background (sebelumnya dilihat juga kondisi tanaman di bak perkecambahan). Seleksi Background Seleksi background menggunakan marka-marka mikrosatelit yang tersebar di seluruh kromosom padi mulai banyak dilakukan oleh pemulia tanaman. Seleksi background ini bisa mempersingkat waktu mendapatkan tanaman yang homozigot dibandingkan dengan cara persilangan konvensional dan metode ini sudah mulai digunakan dalam program pemuliaan menggunakan marka molekuler (Collard et al. 2005; Semagn et al. 2006; Hospital 2005), bahkan seleksi background ini telah dibuat perhitungan matematisnya oleh Hu dan He (2005), dan terbukti bisa meningkatkan pengembalian genom kembali ke tetua pemulih lebih cepat dibandingkan tanpa seleksi background. Sebenarnya untuk mempercepat

15 49 homosigosit tas tanaman bisa dilakukan dengan cara kultur anter setelah tanaman disilangkan (bisa di BC 1 atau BC 2 ). Namun, kultur anter tidak bisa memberi petunjuk tanaman hasil kultur anter yang mana yang mengandung gen yang diinginkan secara cepat. Dengann teknologi marka molekuler setiap individu tanaman bisa dilacak keadaan genomnya, apakah mengandung gen target atau tidak, dan bisa dilacak komposisi genotipe masing-masing lokus, apakah AA, Aa, atau aa. Namun, teknologi dengan menggunakan markaa background ini juga sangat mahal karena memerlukan bahan-bahan kimia yang banyak, tenaga ekstra karena dibatasi waktu (sebelum persilangan harus sudah adaa hasilnya) Situ Bagendit RM237 Kasalath 1 20 Individu BC 2 F 1 Situ Bagendit x Kasalath Batur RM Individu BC 2 F 1 Batur x NIL-C443 NIL-C443 Gambar 13 Contoh seleksi background individu BC 2 F 1 menggunakan primer mikrosatelitt pada non-denaturinpoliakrilamid 8% dan diwarnai dengan Cybersafe solution (dikerjakan di IRRI). Dalam gel ini hanya bisa dilakukan 1 kali loading saja (satu baris 100 sampel). gel. Hasil amplifikasi dipisahkan dalam gel

16 50 Padaa kegiatan ini seleksi background yang paling sulit dilakukan adalah \pada saat menganalisis tanamann BC 1 F 1. Pada tahap ini seluruh seleksi background harus selesai dilakukan sebelum tanaman disilang balikkan dengan tetua pemulih. Padahal tanaman padi mulai bunting pada umur 8 minggu setelah tanam pada padi yang berumur hari (Situ Bagendit dan Batur), sedangkan pada padi yang lebih pendek mulai bunting pada umur 4-6 minggu setelah tanam. Akibatnya, marka background yang digunakan tidak banyak (hanya 4 marka tiap kromosom) dan tidak dilakukan pengulangan untuk hasil amplifikasi yang jelek, sehingga hasilnya tidak terlalu bagus (Tabel 9-12). Apabila seleksi background pada tanaman BC 1 F 1 ini berjalan lambat persilangan bisa gagal dilakukan dan harus mengulang lagi dari awal. Apabila benih BC 1 F 1 tidak mencukupi harus diulang lagi dari benih F1. Berbeda dengann seleksi background pada tanaman BC 2 F 1 dan BC 2 F 2, setelah memilih 20 tanaman berdasarkan seleksi foreground dan recombinant tanaman ditanam dalam ember besar dan dibiarkan menyerbuk sendiri. Oleh karena itulah seleksi background bisa dilakukan dengann lebih teliti dan bisa dilakukan pengulangan n bagi sampel-sampel yang tidak bagus hasil PCRnya. Tabulasi seluruh seleksi background dapat dilihat dalam Tabel Contoh seleksi background juga dapat dilihat dalam Gambar 13 dan 14. Situ Bagendit RM NIL-C443 Individu BC 2 F 1 Situ Bagendit x NIL-C443 Situ Bagendit RM5 NIL-C Individu BC 2 F 1 Situ Bagendit x NIL-C443 Gambar 14 Contoh seleksi background individu BC 2 F 1 menggunakan primer mikrosatelit pada denaturing gel. Hasil amplifikasii dipisahkan dalam gel poliakrilamid 5% (denaturingg gel) dan diwarnai dengan silver staining (dikerjakan di Indonesia). Dalam gel ini bisa dilakukan loading 4-6 kali (satu baris berjumlah 1000 sampel), tergantung panjang pendeknya gel yang dipakai.

17 51 Berdasarkan Gambar 13 dan 14 setiap lokus (primer) akan menghasilkan individu dengan tipe genotipe berbeda-beda. Pada tanaman BC 1 F 1 dan BC 2 F 1 hanya akan ada dua tipe genotipe, yakni homozigot ke tetua pemulih (Situ Bagendit dan Batur) atau heterozigot. Tipe genotipe yang homozigot ke tetua donor (Kasalath dan NIL-C443) tidak mungkin ditemukan. Pada tanaman BC 2 F 2 tipe genotipe ketiga ini akan bisa ditemukan dalam beberapa lokus (primer) dengan jumlah yang sangat kecil. Setelah dilakukan tabulasi kondisi genotipe masing-masing nomor pada tanaman BC 2 F 2 maka didapat data genotipe homozigot terbanyak yang juga dianggap sebagai tanaman terbaik berdasarkan analisis molekuler, kemudian dibuat grafik genotipenya berdasarkan lokasi marka-marka mikrosatelit yang dibuat oleh Temnykh et al. (2007). Setelah dilakukan analisis molekuler sejak dari tanaman F 1, BC 1 F 1, BC 2 F 1, dan BC 2 F 2 terlihat tingkat pengembalian genom ke tetua pemulih lebih banyak pada persilangan Situ Bagendit x NIL-C44 (tertinggi sebanyak 154 marka pada individu BC 2 F 2 nomor 1256) dibandingkan dengan persilangan Situ Bagendit x Kasalath (tertinggi sebanyak 143 marka pada individu BC 2 F 2 nomor 960) (Tabel 9 dan 10). Gambar 15 merupakan gambar yang menunjukkan komposisi genotipe (perkiraan) dari satu individu terbaik dari persilangan yang menggunakan tetua Situ Bagendit berdasarkan pada jumlah terbanyak marka mikrosatelit yang homozigot untuk tetua pemulih. Pada persilangan Situ Bagendit x Kasalath individu terbaik (nomor 960), walaupun sudah sampai generasi BC 2 F 2 ternyata masih ada fragmen-fragmen dari tetua Kasalath, misalnya pada kromosom 1 (1 titik 0,5 cm), kromosom 4 (2 titik 5 cm dan 5 cm), kromosom 7 (1 titik 3 cm), kromosom 10 (1 titik 2 cm), dan kromosom 12 (1 titik setelah fragmen Pup1 16,2 cm). Setelah dihitung total terdapat sekitar (perkiraan) 31,7 cm merupakan DNA Kasalath. Pada kromosom 1, 4, dan 7 kondisi segmen Kasalath masih heterozigot sehingga masih ada kemungkinan lokus-lokus tersebut akan berubah menjadi homozigot Situ Bagendit pada generasi berikutnya. Apabila dibandingkan dengan seluruh panjang kromosom padi (1795,7 cm), maka DNA Kasalath (selain segmen Pup1) yang masih terdapat pada individu terbaik persilangan Situ Bagendit x Kasalath

18 52 tersebut sekitar 1,77%. Menurut hitungan matematis pada generasi BC 2 diperkirakan tingkat pengembalian ke genom tetua pemulih sekitar 82% bila menggunakan metode seleksi konvensional dan 87,5% apabila menggunakan metode seleksi menggunakan marka molekuler (Collard et al. 2005). Walaupun demikian karena keterbatasan marka polimorfik antara Situ Bagendit vs Kasalath, atau karena memang tidak ada marka yang tersedia, maka masih banyak daerahdaerah yang belum diketahui komposisi genomnya, seperti pada kromosom 1 (4 titik 25, 20, 30, 31 cm), kromosom 2 (3 titik 33, 22, 25 cm), kromosom 3 (1 titik 48,8 cm), kromosom 4 ( 0 titik), kromosom 5 (2 titik 25, 29 cm), kromosom 6 (2 titik 31,6 dan 38,9 cm), kromosom 7 (2 titik 21,6 dan 19,8 cm), kromosom 8 (1 titik 26,2 cm), kromosom 9 (1 titik 20,4 cm), kromosom 10 (2 titik 25,1 dan 26,8 cm), kromosom 11 (1 titik 32,7 cm), dan kromosom 12 (1 titik 28,72 cm). Pada persilangan Situ Bagendit x NIL-C443 marka yang bisa dimanfaatkan lebih banyak karena perbedaan subspecies antara padi indica dan japonica yang menjadikan tingkat polimorfismenya lebih tinggi. Pada persilangan ini individu BC 2 F 2 nomor 1256 memiliki marka mikrosasatelit yang homozigot sebanyak 154 marka dan segment NIL-C443 yang masih tertinggal tidak sebanyak persilangan Situ Bagendit x NIL-C443, misalnya pada kromosom 2 ( 1 titik 16 cm), kromosom 5 (1 titik 5 cm), kromosom 11 (1 titik 5 cm) dan kromosom 12 (3 titik 6,52, 1,16, dan 1,48 cm). Total panjang segmen NIL-C443 yang masih terdapat dalam individu BC 2 F 2 nomor 1256 tersebut sekitar 35,16 cm (atau sekitar 1,96%). Pada kromosom 2, 5, dan 8 kondisi segmen NIL- C443 adalah heterozigot sehingga masih ada peluang untuk mendapatkan lokus yang homozigot ke tetua Situ Bagendit. Daerah-daerah yang belum diketahui kondisi genomnya adalah pada kromosom 1 (3 titik 26,2, 19,6, 21,3 cm), kromosom 2 (2 titik 31,2 dan 22,6 cm), kromosom 3 (2 titik 21,5 dan 25,1 cm), kromosom 4 (1 titik 32,3 cm), kromosom 5 (1 titik 25,3 cm), kromosom 6 (2 titik 30 dan 24,3 cm), kromosom 7 (1 titik 21,6 cm), kromosom 8 (1 titik 26,2 cm), kromosom 9 (1 titik 23, 4 cm), kromosom 10 (1 titik 26,8 cm), kromosom 11 (1 titik 27,2 cm), dan kromosom 12 (1 titik 30 cm).

19 53 Pada persilangan Batur dengan Kasalath dan NIL-C443 terlihat jumlah marka mikrosatelit yang homozigot ke tetua Batur lebih banyak dibandingkan dengan persilangan Situ Bagendit (Tabel 11 dan 12). Batur x Kasalath memiliki jumlah marka homozigot terbanyak pada individu BC 2 F 2 nomor 1941 sebanyak 154 marka (Situ Bagendit x Kasalath hanya 143 marka). Batur x NIL-C443 memiliki jumlah marka homozigot terbanyak pada individu BC 2 F 2 nomor 2329 sebanyak 162 marka, sedangkan Situ Bagendit x NIL-C443 hanya 154. Hal ini menunjukkan pada tetua Batur banyak marka yang bisa digunakan untuk seleksi background. Tanaman BC 2 F 2 persilangan Batur x Kasalath pada individu terbaiknya (nomor 1941) masih terdapat beberapa segmen NIL-C443 yang belum hilang (Gambar 16), yakni kromosom 4 (3 titik 5, 5, dan 9 cm), kromosom 9 (3 titik 5, 3, dan 3 cm), kromosom 11 (1 titik 5 cm), dan kromosom 12 (2 titik 10 dan 3,2 cm). Total panjang segmen Kasalath yang masih terdapat dalam indiviudu tersebut sekitar 48,2 cm (2,6% dari total genom). Pada kromosom 4, 9, dan 11 kondisi lokus yang mengandung segmen Kasalath tersebut adalah heterozigot sehingga masih membuka peluang mendapat lokus yang homozigot pada generasi BC 2 F 3 nya. Selain itu masih banyak daerah yang belum diketahui kondisi genomnya, yakni kromosom 1 (3 titik 26,2, 20,3, dan 24,9 cm), kromosom 2 (2 titik 22,6 dan 24,9 cm), kromosom 3 (4 titik 23,6, 21,5, 23,1 dan 25,8 cm), kromosom 4 (1 titik 20 cm), kromosom 5 (3 titik 28,6, 28,8, dan 22,1 cm), kromosom 6 (2 titik 32,3 dan 40,1 cm), kromosom 7 (2 titik 24,2 dan 19,8 cm), kromosom 8 dan 9 (0 titik), kromosom 10 (1 titik 23,2 cm), kromosom 11 (1 titik 37,5 cm), dan kromosom 12 ( 1 titik 22,4 cm). Pada persilangan Batur x NIL-C443 individu terbaik pada generasi BC 2 F 2 (nomor 2329) masih memiliki segmen NIL-C443 yang belum hilang, yakni pada kromosom 5 (1 titik 5 cm), dan kromosom 12 (2 titik 11,04 dan 12,84 cm), dengan total 28,88 cm (1,61% dari total genom). Daerah-daerah yang belum diketahui komposisi genotipenya adalah kromosom 1 (1 titik 26,2 cm), kromosom 2 (2 titik 21,9 dan 22,6 cm), kromosom 3 (2 titik 65,5 dan 47,4 cm), kromosom 4 (3 titik 20, 28,3, dan 28,3 cm), kromosom 5 (1 titik 25,3 cm), kromosom 6 (1 titik 56,6 cm), kromosom 7 (1 titik 21,5 cm), kromosom

20 54 8 (1 titik 21,9 cm), kromosom 9 (1 titik 23,4 cm), kromosom 10 (1 titik 24,4 cm), kromosom 11 27,2 cm), kromosom 12 (0 titik). Apabila dilakukan tabulasi jumlah segmen tetua donor dan daerah yang belum diketahui kondisi genotipenya pada individu terbaik dari populasi BC 2 F 2 masing-masing persilangan dapat disebutkan sbb : Situ Bagendit x Kasalath (segmen Kasalath : 6 titik, daerah tidak tahu : 20 titik), Situ Bagendit x NIL-C443 (segmen NIL-C443 : 6 titik, daerah tidak tahu : 17 titik), Batur x Kasalath (segmen Kasalath : 9 titik, daerah tidak tahu : 20 titik), Batur x NIL-C443 (segmen NIL-C443 : 3 titik, daerah tidak tahu 15 titik). Berdasarkan hal tersebut terlihat persilangan Batur x NIL-C443 merupakan persilangan yang terbaik karena segmen tetua donornya paling sedikit dan daerah yang belum diketahui juga paling sedikit. Namun, analisis molekuler ini tidak bisa dijadikan patokan bagaimana kondisi fenotipik dari tanaman tersebut karena fenotipik yang diperlihatkan oleh tanaman tidak semata-mata hasil ekspresi dari satu gen atau satu lokus saja tapi ribuan gen yang terletak pada ribuan lokus, sehingga masingmasing tanaman perlu diuji secara fenotipik. Yang terpenting adalah semua individu BC 2 F 2 dari tiap persilangan sudah mengandung segmen Pup1 dalam kondisi homozigot saja, hanya tinggal dilihat apakah ekspresi segmen tersebut benar-benar terjadi (100% terekspresi) ataukah masih terhambat oleh gen-gen lain yang dimiliki oleh segmen tetua donor yang belum hilang atau justru dari tetua Indonesia itu sendiri yang menolak keberadaan segmen DNA yang baru. Masih banyaknya lokus-lokus yang belum diketahui kondisi genotipe karena ada dua hal, yakni : (i) Keterbatasan marka mikrosatelit yang polimorfis. Hal ini terutama pada persilangan yang menggunakan tetua Kasalath. Polimorfisme yang rendah antara Kasalath dengan Situ Bagendit atau Batur lebih disebabkan karena tanaman tersebut semuanya termasuk dalam kelompok padi indica (sebagian ada yang memasukkan Kasalath sebagai sub spesies Aus). Sifat-sifat yang mirip tersebut menyebabkan tingkat polimorfisme primer-primer menjadi lebih rendah.

21 55 (ii) (iii) Ada daerah-daerah pada kromosom padi yang memang belum ada primer-primer mikrosatelitnya, terutama pada daerah-daerah yang dekat dengan sentromer. Keterbatasan koleksi primer yang ada laboratorium menyebabkan ada beberapa titik yang tidak bisa dilihat. Kualitas primer juga mempengaruhi dalam deteksi molekuler ini. Primer-primer yang (mungkin) rusak ternyata banyak yang tidak menghasilkan pita, walaupun sudah diulang sebanyak dua kali. Namun demikian penggunaan marka molekuler untuk seleksi individu hasil persilangan ini terbukti bisa mempercepat pengembalian genom ke tetua pemulih dibandingkan dengan cara konvensional. Dengan cara konvensional untuk mendapatkan kondisi genom seperti yang dilakukan dalam penelitian ini dibutuhkan paling tidak 5-6 silang balik, baru kemudian dilakukan silang sendiri dan harus diseleksi lagi untuk mendapatkan individu dengan lokus Pup1 dalam keadaan homozigot. Kadang-kadang diperlukan waktu lebih dari 5 tahun untuk mendapatkan varietas baru.

22 56 Tabel 9. Tabulasi seleksi background untuk persilangan Situ Bagendit x Kasalath No BC 1 F 1 BC 2 F 1 BC 2 F 2 Juml kumulatif No Waktu Juml lokus No Jmlh lokus No Jmlh lokus lokus homozigot *** Tanaman Tanam homozigot Tanaman homozigot Tanaman homozigot pada tan BC 2 F 2 (dari 48 marka) (dari 98 marka) (dari 60 marka) I ** I I III III IV I II IV I II II II III IV III * III IV * IV II Ket : Bagian yang ditebalkan menunjukkan tanaman yang dipilih untuk disilangkan dengan tetua Situ Bagendit, atau disilang sendiri. * = tanaman yang dipilih untuk generasi berikutnya (berdasarkan jumlah lokus homozigot ke tetua Situ Bagendit terbanyak) ** = tanaman yang terpilih untuk dibuat grafik genotipe *** = jml lokus kumulatif = Jml lokus homozigot BC 1 F 1 terpilih (23) + Jml lokus homozigot BC 2 F 1 terpilih (78) + lokus homozigot BC 2 F 2 (tiap galur)

23 57 Tabel 10. Tabulasi seleksi background untuk persilangan Situ Bagendit x NIL-C443 No BC 1 F 1 BC 2 F 1 BC 2 F 2 Juml kumulatif No Waktu Juml lokus No Jmlh lokus No lokus homozigot *** Tanaman Tanam homozigot Tanaman homozigot Tanaman pada tan BC 2 F 2 Jmlh lokus homozigot (dari 55 marka) (dari 48 marka) (dari 98 marka) I * I I I ** II I II II II IV III III IV III II IV III IV IV * III Ket :Bagian yang ditebalkan menunjukkan tanaman yang dipilih untuk disilangkan dengan tetua Situ Bagendit, atau disilang sendiri. * = tanaman yang dipilih untuk generasi berikutnya (berdasarkan jumlah lokus homozigot ke tetua Situ Bagednit terbanyak) ** = tanaman yang terpilih untuk dibuat grafik genotipe *** = jml lokus kumulatif = Jml lokus homozigot BC 1 F 1 terpilih (28) + Jml lokus homozigot BC 2 F 1 terpilih (85) + lokus homozigot BC 2 F 2 (tiap galur)

24 58 Tabel 11. Tabulasi seleksi background untuk persilangan Batur x Kasalath No BC 1 F 1 BC 2 F 1 BC 2 F 2 Juml kumulatif No Waktu Juml lokus No Jmlh lokus No Jmlh lokus lokus homozigot *** Tanaman Tanam homozigot Tanaman homozigot Tanaman homozigot pada tan BC 2 F 2 (dari 48 marka) (dari 100 marka) (dari 71 marka) I II I I I II II III * I II IV ** II III III III IV IV III IV * IV Ket. : Bagian yang ditebalkan menunjukkan tanaman yang dipilih untuk disilangkan dengan tetua Bstur, atau disilang sendiri. * = tanaman yang dipilih untuk generasi berikutnya (berdasarkan jumlah lokus homozigot ke tetua Batur terbanyak) ** = tanaman yang terpilih untuk dibuat grafik genotipe *** = jml lokus kumulatif = Jml lokus homozigot BC 1 F 1 terpilih (25) + Jml lokus homozigot BC 2 F 1 terpilih (78) + lokus homozigot BC 2 F 2 (tiap galur)

25 59 Tabel 12. Tabulasi seleksi background untuk persilangan Batur x NIL-C443 BC 1 F 1 BC 2 F 1 BC 2 F 2 Juml kumulatif lokus No Tanaman Waktu Jumlah lokus No Jmlh lokus No Jmlh lokus homozigot *** Tanam homozigot Tanaman homozigot Tanaman homozigot(dari pada tan BC 2 F 2 (dari 48 marka) (dari 117 marka) 52 marka) I I I I II I II II II III III IV II ** III IV III III IV IV * IV * Ket. : Bagian yang ditebalkan menunjukkan tanaman yang dipilih untuk disilangkan dengan tetua Bstur, atau disilang sendiri. * = tanaman yang dipilih untuk generasi berikutnya (berdasarkan jumlah lokus homozigot ke tetua Batur terbanyak) ** = tanaman yang terpilih untuk dibuat grafik genotipe *** = jml lokus kumulatif = Jml lokus homozigot BC 1 F 1 terpilih (23) + Jml lokus homozigot BC 2 F 1 terpilih (100) + lokus homozigot BC 2 F 2 (tiap galur)

26 60 Segmen Pup1 Segmen Pup1 = Situ Bagendit x = sentromer = Kasalath = Situ = NIL C443 Bagendit x = sentromer Gambar 15. Perkiraan Grafik genotipe individu terbaik tanaman BC 2 F 2 persilangan Situ Bagendit x Kasalath no. 960 (kiri) dan persilangan Situ Bagendit x NIL-C443 no (kanan) Segmen Pup1 Segmen Pup1 = Batur = Kasalath x = sentromer = Batur = NIL-C443 x = sentromer Gambar 16. Perkiraan grafik genotipe individu terbaik tanaman BC 2 F 2 persilangan Batur x Kasalath no (kiri) dan persilangan Batur x NIL-C443 no (kanan)