Identifikasi marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi terhadap keracunan aluminium pada padi persilangan Dupa x ITA131

Transkripsi

1 Identifikasi Jurnal Bioteknologi marka mikrosatelit Pertanian, yang Vol. 8, terpaut No., dengan 003, sifat pp toleransi Identifikasi marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi terhadap keracunan aluminium pada padi persilangan Dupa x ITA3 Identification of microsatellite marker for tolerance to aluminum toxicity on rice derived from Dupa x ITA3 Joko Prasetiyono, Tasliah, Hajrial Aswidinnoor, dan Sugiono Moeljopawiro Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 6, Indonesia Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Bogor 6680, Indonesia ABSTRACT Aluminum (Al) stress is one of major constraints in rice cultivation in acid soil. To obtain rice variety tolerant to Al stress, microsatellite marker has high potential for plant breeding, because it is reliable, effective, economic, and simple. To investigate quantitative trait loci (QTL) position for Al tolerance trait in rice, 90 F intercross population derived from a cross between an Al-tolerant variety Dupa and an Al-sensitive variety ITA3 were planted in Yoshida culture solution. Root length on stress solution (60 ppm AlCl 3 ) as phenotypic parameter was measured at 0 days after planting. Sixty six polymorphic microsatellite markers were amplified on DNA of 94 randomly selected F plants and used to construct QTL map. By employing single marker analysis, two QTLs on chromosome 7 were identified (P value < 0.05), meanwhile by interval mapping analysis, no QTL was identified (all LOD value < 3). [Keywords: Rice, aluminum toxicity, microsatellite markers] ABSTRAK Cekaman aluminium (Al) merupakan salah satu kendala utama dalam budi daya padi pada tanah masam. Dalam upaya mendapatkan varietas padi yang tahan terhadap keracunan Al, marka mikrosatelit memiliki potensi tinggi untuk diterapkan dalam pemuliaan tanaman karena efektif, ekonomis, dan sederhana dalam pelaksanaannya. Untuk mengetahui posisi quantitative trait loci (QTL) sifat toleransi terhadap keracunan Al pada padi, 90 populasi F yang berasal dari persilangan Dupa (toleran Al) dan ITA3 (peka Al) diuji menggunakan larutan Yoshida. Panjang akar pada kondisi tercekam (60 ppm AlCl 3 ) yang diamati pada umur 0 hari setelah tanam digunakan sebagai data fenotipik. Enam puluh enam marka mikrosatelit digunakan untuk mengamplifikasi DNA dari 94 tanaman F yang diambil secara acak dan digunakan untuk membuat peta pautan. Analisis marka tunggal menghasilkan dua marka yang terpaut dengan QTL pada kromosom 7 (nilai peluang < 0,05), sedangkan berdasarkan analisis marka interval, tidak ada QTL yang terpaut dengan 66 marka tersebut (semua nilai LOD < 3). [Kata kunci: Padi, keracunan aluminium, marka mikrosatelit] PENDAHULUAN Perluasan areal pertanian ke luar Jawa merupakan salah satu program pemerintah untuk meningkatkan produksi pertanian. Pada umumnya perluasan areal tersebut diarahkan ke tanah Podsolik Merah Kuning karena penyebaran tanah ini di Indonesia sangat luas, mencapai 45,794 juta ha atau 4,3% dari daratan Indonesia (Subagyo et al. 000). Kendala utama pemanfaatan tanah tersebut adalah ph rendah, keracunan Al, Mn, Fe, serta unsur hara rendah terutama N dan P, serta pencucian hara cukup tinggi (Soepardi 983). Beberapa perlakuan pemberian unsur hara buatan (pemupukan) telah dilakukan untuk meningkatkan kemampuan tanaman dalam menyerap unsur hara tersebut (Nasution dan Sudarman 986). Cara terbaik untuk menanggulangi masalah tersebut adalah melalui perakitan varietas yang toleran terhadap kondisi lahan masam, sehingga pengapuran untuk meningkatkan ph tanah dapat diminimalkan. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa toleransi padi terhadap cekaman Al dikendalikan oleh lebih dari satu pasang gen, yang terlihat dari pewarisan secara kuantitatif. Khatiwada et al. (996) menunjukkan bahwa nilai relatif panjang akar (RPA) yang tinggi dikendalikan oleh pengaruh aditif dan dominan, tetapi lebih banyak karena pengaruh aditif. Wu et al (997) melakukan studi genetik untuk sifat toleransi terhadap keracunan Al pada padi dengan membuat persilangan dialel tidak sempurna pada delapan tetua jantan dan tujuh tetua betina. Hasilnya menunjukkan bahwa ragam general combine ability (CGA) lebih besar dibanding specific combine ability (SCA), sehingga pengaruh gen-gen aditif lebih besar. Bianchi- Hall et al. (998) menyebutkan bahwa toleransi terhadap keracunan Al pada kedelai toleran Al (PI 46937) dikontrol oleh dua sampai lima gen.

2 36 Joko Prasetiyono et al. Berdasar kondisi tersebut maka seleksi secara konvensional menurut Bennet (993) akan membutuhkan waktu yang lama dan areal yang luas untuk memproduksi satu galur baru. Seleksi berdasarkan fenotipe saja akan menemui kesulitan karena kondisi lingkungan yang bervariasi. Akibatnya, tekanan seleksi menjadi tidak merata sehingga dapat menyebabkan terjadinya kesalahan pemilihan galur yang toleran. Selain itu, bila gen-gen yang mengatur sifat ketahanan bersifat aditif, seleksi akan lebih sulit dilakukan karena masing-masing gen hanya menyumbang sebagian kecil terhadap fenotipe tersebut. Marka molekuler yang terpaut dengan gen-gen (lokus-lokus sifat kuantitatif) dapat membantu mengurangi ukuran populasi dan waktu generasi dalam program pemuliaan. Selain itu, marka molekuler mampu menyeleksi sifat-sifat yang diinginkan pada tahap pembibitan, bahkan untuk sifat yang sangat sulit sekalipun yang bila menggunakan seleksi fenotipe memerlukan waktu yang panjang, seperti morfologi perakaran, resistensi terhadap hama dan penyakit, serta toleransi terhadap cekaman abiotik seperti kekeringan, garam, defisiensi atau keracunan mineral (McCouch dan Tanksley 99). Perkembangan teknologi seperti RFLP, RAPD, AFLP, dan mikrosatelit telah menjangkau pengujian polimorfisme DNA untuk pemetaan genetik, marka untuk pemuliaan tanaman, dan eksplorasi hubungan kekerabatan (Powell et al. 996). Marka mikrosatelit mempunyai sifat seperti marka RFLP, merupakan motif sederhana urutan basa nitrogen yang terdapat pada kromosom suatu organisme. Urutan itu berulangulang sebagai motif yang unik. Para peneliti telah memetakan urutan tersebut, sehingga marka mikrosatelit memiliki kemampuan mendeteksi suatu populasi segregasi seakurat RFLP. Selain itu, secara teknis juga dimungkinkan untuk multiple loading pada gel poliakrilamid sehingga pendeteksian populasi segregasi dapat dilakukan secara cepat, tepat, dan efisien (Panaud et al. 995; McCouch et al. 997). Sampai saat ini ratusan marka mikrosatelit telah dibuat (Panaud et al. 996; Chen et al. 997; Temnykh et al. 000). Penggunaan marka mikrosatelit relatif mudah karena menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR) sehingga dapat menjangkau seluruh kromosom. Oleh karena itu, peluang untuk mendapatkan marka yang terpaut dengan suatu karakter agronomi semakin besar. Pemanfaatan peta keterpautan mikrosatelit dalam perakitan varietas baru juga dapat menghemat waktu, tenaga, dan dana (Akagi et al. 996). Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keterpautan marka mikrosatelit dengan sifat toleransi terhadap keracunan Al pada padi hasil persilangan Dupa x ITA3. Marka yang terpaut dengan sifat toleransi dapat digunakan sebagai alat seleksi dalam program pemuliaan tanaman. BAHAN DAN METODE Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor pada bulan Januari 000-Maret 003. Bahan Bahan tanaman adalah 90 galur tanaman padi generasi kedua (F) hasil persilangan Dupa x ITA3 dan tetuanya yang didapatkan dari Kebun Percobaan Muara, Bogor. Untuk uji fenotipik digunakan seluruh galur yang ada (90), sedangkan untuk analisis segregasi digunakan 94 galur yang dipilih secara acak dari populasi F tersebut. Primer mikrosatelit yang digunakan berjumlah 43 pasang (F dan R) berasal dari Research Genetic, Inc., USA. Metode Uji fenotipik Uji fenotipik menggunakan metode yang dideskripsikan oleh Lubis dan Suwarto (000). Bak plastik diisi dengan larutan Yoshida (Yoshida et al. 976) yang diencerkan 4 kali dengan penambahan Al (berasal dari AlCl 3 ) 60 ppm. Untuk uji tetua hanya digunakan larutan Yoshida tanpa pemberian Al (0 ppm). Seratus sembilan puluh benih padi generasi F (Dupa x ITA3) dan kedua tetuanya diletakkan di atas gabus berlubang yang bagian bawahnya diberi lapisan kain kasa. Sebelum ditanam, benih direndam dalam larutan HgCl 0,% selama satu menit, dibilas dengan akuades tiga kali kemudian direndam kembali dengan akuades secukupnya selama 48 jam. Larutan Yoshida dipertahankan pada ph 4 ± 0, dengan cara mengamati perubahan ph larutan setiap dua hari sekali. Tanaman dibiarkan tumbuh sampai umur 0 hari kemudian diukur panjang akarnya. Tanaman kemudian dipindahkan ke dalam media biasa dan diambil daunnya untuk isolasi DNA. Hasil pengamatan panjang akar selanjutnya digunakan untuk menghitung relatif panjang akar (RPA) dari dua tetua dengan rumus sebagai berikut: RPA = Panjang akar pada 60 ppm Al Panjang akar pada 0 ppm Al

3 Identifikasi marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi Standar nilai RPA mengikuti Nasution dan Suhartini (99) dan Khatiwada et al. (996) yaitu: RPA > 0,7 = toleran RPA 0,69-0,6 = moderat RPA > 0,6 = peka Data panjang akar populasi F pada larutan Yoshida yang mengandung 60 ppm AlCl 3 dipakai sebagai data fenotipik dan digunakan dalam uji keterpautan. Survai primer SSR dan uji keterpautan Daun dari dua tetua (Dupa dan ITA3) dan 90 nomor F (Dupa x ITA3) diambil untuk isolasi DNA menggunakan metode Dellaporta yang dimodifikasi (Dellaporta et al. 983). RNAse ditambahkan untuk melarutkan RNA. Kualitas dan kuantitas DNA diamati dengan menggunakan alat elektroforesis dan spektrofotometer. Program PCR yang digunakan adalah 5 menit pada suhu 94 o C untuk denaturasi permulaan, selanjutnya dilakukan 35 siklus terdiri atas menit pada suhu 94 o C untuk denaturasi, menit pada suhu 55 o C untuk penempelan primer, dan menit pada suhu 7 o C untuk pemanjangan primer. Perpanjangan primer terakhir dilakukan pada suhu 7 o C selama 7 menit. Hasil PCR kemudian diseparasi menggunakan gel poliakrilamid 5%. Sampel diberi penanda migrasi DNA kemudian didenaturasi menggunakan mesin PCR pada suhu 94 o C selama 5 menit dan secepat mungkin dimasukkan ke dalam kotak berisi es. Gel dipersiapkan terlebih dahulu dan dimasukkan dalam alat pencetak gel. Sampel dielektroforesis menggunakan gel poliakrilamid 5% pada suhu 50 o C pada konstan daya 00 watt selama 3 jam. Pewarnaan DNA dilakukan dengan metode silver staining. Kaca yang ditempeli gel berisi DNA direndam dalam baki yang berisi 0% asam asetat glasial (larutan fiksasi) dan digoyang selama 0 menit. Kaca dicuci dalam air bebas ion sebanyak kali masingmasing menit. Selanjutnya kaca direndam dalam larutan pewarna (silver staining) di atas mesin penggoyang selama jam, kemudian dibilas dalam air bebas ion selama 0 detik. Kaca kemudian direndam dalam larutan developer hingga muncul pita-pita, setelah itu secepatnya direndam dalam larutan asam asetat selama 5 menit, dibilas dengan air bebas ion, dan dikeringanginkan. Primer yang menghasilkan pita yang berbeda posisi pada dua tetua dipilih sebagai primer untuk analisis segregasi pada F (Dupa x ITA3). Analisis segregasi dilakukan dengan mengamati pola pita pada populasi F yang bersegregasi dengan memberikan simbol kategori: A= pola pita sama dengan tetua Dupa B = pola pita sama dengan tetua ITA3 H= pola pita mengandung kedua tetua - = tidak ada amplifikasi dan atau pita tidak sama dengan kedua tetua. Analisis data Uji kenormalan data dan plot data fenotipik menggunakan program SAS versi 7. Untuk mengetahui frekuensi alel masing-masing tetua, dihitung total masing-masing alel kemudian dibandingkan dengan jumlah total kedua alel Dupa dan ITA3. Uji X pada taraf 5% digunakan untuk menguji proporsi genotipe masing-masing marka/lokus, apakah mengikuti perilaku hukum Mendell atau tidak. Pembuatan peta mengacu pada susunan marka mikrosatelit yang dideskripsikan oleh Chen et al. (997) dan Temnykh et al. (000). Genotipe masing-masing primer dipilah dan diurutkan sesuai dengan posisinya pada peta yang sudah ada. Data tiap-tiap kromosom diolah menggunakan program MapMaker versi.0 (MacIntosh), sedangkan analisis QTL menggunakan program Qgene versi 3.0, berupa analisis marka tunggal dan marka interval. Uji fenotipik HASIL DAN PEMBAHASAN Uji fenotipik menggunakan larutan Yoshida dengan penambahan Al cukup sederhana, murah, cepat, dan akurat. Panjang akar digunakan sebagai parameter utama karena dari beberapa hasil penelitian, target utama keracunan Al adalah jaringan akar terutama ujung akar. Kondisi perakaran tanaman pada larutan Yoshida yang ditambah 60 ppm AlCl 3 merupakan cerminan kemampuan tanaman dalam upaya mengurangi pengaruh Al. Tanaman dengan kondisi perakaran yang panjang dan baik akan mampu mengurangi pengaruh Al, demikian pula sebaliknya. Hasil uji fenotipik dalam bak plastik disajikan pada Gambar. Rata-rata panjang akar Dupa pada media tanpa Al mencapai 9,5 cm dan pada 60 ppm Al sebesar 7,3 cm. Untuk ITA3, rata-rata panjang akar pada media yang mengandung 0 ppm Al sebesar,9 cm dan pada 60 ppm Al,58 cm. Relatif panjang akar (RPA) tetua Dupa dan ITA3 masing-masing adalah 0,77 dan 0,. Berdasarkan hasil ini, Dupa tetap menunjukkan sifat toleran terhadap Al, sedang ITA3 juga tetap merupakan tetua yang peka. Dengan demikian dapat

4 38 Joko Prasetiyono et al. disimpulkan bahwa seleksi dengan menggunakan larutan Yoshida + 60 ppm AlCl 3 dapat digunakan untuk mengevaluasi populasi F. Kondisi perakaran tetua Dupa dan ITA3 disajikan pada Gambar. Variasi panjang akar terlihat pada populasi F, yang menunjukkan adanya segregasi sifat toleransi terhadap keracunan Al pada kedua tetuanya. Distribusi panjang akar mendekati normal dengan nilai hasil uji mendekati (0,98086). Survai primer dan analisis segregasi F Hasil survai tetua menggunakan 43 primer mikrosatelit mendapatkan 0 primer (45,7%) yang polimorfis pada dua tetua, 3 primer tidak menghasilkan pita, 7 primer menghasilkan pita yang banyak, dan 3 primer sisanya menghasilkan pita monomorfis. Berdasarkan jarak antarprimer dalam peta keterpautan yang sudah Gambar. Hasil uji fenotipik populasi F (Dupa x ITA3). Fig.. Phenotypic test result of F (Dupa x ITA3). A B Gambar. Kondisi perakaran tetua Dupa (kiri) dan ITA3 (kanan) pada umur 0 hari setelah tanam pada larutan Yoshida yang ditambah 0 ppm Al (A) dan 60 ppm A (B). Fig.. Root condition of Dupa (left) and ITA3 (right) at 0 days after planting in Yoshida solution without (A) and with addition of 60 ppm Al (B). A B ada, dari 0 primer polimorfis tersebut kemudian dipilih 76 primer untuk mengamplifikasi DNA 94 individu F. Hasil amplifikasi primer kedua tetua dapat dilihat pada Gambar 3. Dari 76 primer yang digunakan, 67 primer menghasilkan pita yang dapat diskor. Sembilan primer tidak bisa diskor karena polimorfisnya terlalu dekat ( primer), pita terlalu banyak (3 primer), atau pita terlalu tipis (4 primer). Hasil amplifikasi disajikan pada Gambar 4. Pembuatan peta pautan Kromosom 67 primer yang digunakan untuk analisis segregasi kemudian dikelompokkan berdasarkan peta yang dideskripsikan oleh McCouch et al. (997) dan Temnykh et al. (000). Dengan program Mapmaker/ Exp menggunakan fungsi centimorgan kosambi, kromosom akan terpecah apabila frekuensi rekombinasi melebihi 40% (batas tertinggi 50%) dengan batas LOD 3. Pemetaan menghasilkan 4 peta pautan dengan 66 primer, sedangkan satu primer tidak termasuk pada kelompok pautan. Pemetaan seharusnya menghasilkan peta pautan sesuai dengan jumlah kromosom padi (n = ). Hal ini karena kromosom 3 dan 8 masingmasing terpecah menjadi dua peta. Pada kromosom 3, jarak antara RM3 dan RM46 terlalu besar (06,3 cm) dengan frekuensi rekombinasi 48,6% sehingga melebihi batas yang ditentukan (data tidak ditampilkan). Demikian pula kromosom 8 terpecah karena primer RM6 dan RM56 tidak terpaut. Jumlah pautan yang tidak sesuai dengan jumlah kromosom padi ini disebabkan marka mikrosatelit yang digunakan masih terlalu sedikit untuk mencakup seluruh kromosom. Untuk menghubungkan peta yang terpisah diperlukan lebih banyak marka mikrosatelit atau menggunakan marka lain misalnya RFLP (Septiningsih et al. 003). Empat belas peta pautan yang dihasilkan dalam penelitian ini dapat mencakup kromosom sepanjang.430 cm, dengan jarak rata-rata antarmarka 7,5 cm (Gambar 5). Panjang cakupan dan jarak antarprimer ini masih tergolong rendah. Peta pautan yang dibuat Wu et al. (000) mampu mencakup.40 cm dengan jarak rata-rata antarmarka,7 cm. Nguyen et al. (00) membuat peta pautan yang dapat mencakup kromosom sepanjang.75,8 cm dengan jarak rata-rata antarmarka 0,46 cm. Analisis QTL Marka mikrosatelit dapat digunakan untuk mengetahui frekuensi alel dan proporsi genotipe sesuai proporsi yang diharapkan. Berdasarkan perhitungan frekuensi

5 Identifikasi marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi bp DNA ladder 400 bp 300 bp 00 bp 00 bp RM0 5. RM0 9. RM8 3. RM4 7. RM54. RM63. RM0 6. RM0 0. RM3 4. RM46 8. RM56. RM RM04 7. RM4. RM3 5. RM49 9. RM6 3. CT09 (RM64) 4. RM09 8. RM6. RM39 6. RM53 0. RM6 4. CT4 Gambar 3. Hasil amplifikasi primer mikrosatelit pada tetua Dupa dan ITA3 pada gel poliakrilamid 5%. Fig. 3. Microsatellite primer amplification of Dupa and ITA3 at polyacrilamid gel 5% B A a b c 6 Gambar 4. Hasil amplifikasi 94 galur F (Dupa x ITA3) menggunakan primer CT 06a (RM 6) (A) dan RM 57 (B) pada gel poliakrilamid 5%; () Dupa dan () ITA3, a = pita seperti tetua ITA3, b = pita seperti tetua Dupa, dan c = pita seperti kedua tetua (heterosigot). Sampel 94 galur F yang dianalisis ditunjukkan no. sampai 94. Fig.4. Amplification results of 94 F lines (Dupa x ITA3) using CT 06a primer (RM 6) (A) and RM 57 (B) at polyacrilamid gel 5%; () Dupa and () ITA3, a = bands like ITA3, b = bands like Dupa, and c = bands like Dupa and ITA3 (heterozygote). The 94 F lines were shown in no. to no. 94. alel, dari 66 marka yang diuji, 47,3% mengikuti pola alel Dupa dan 5,7% mengikuti pola alel ITA3. Proporsi alel yang diharapkan adalah 50% alel Dupa dan 50% alel ITA3 sehingga terjadi penyimpangan frekuensi alel,7% cenderung ke alel ITA3. Perhitungan frekuensi alel ini mutlak diperlukan untuk mengetahui besarnya penyimpangan populasi yang digunakan. Apabila penyimpangan sangat besar, diperlukan

6 40 Joko Prasetiyono et al. (7,7%) 8,5 (3,6%) 5,7 (38,%) 50,3 (40,%) 55,5 (8,0%) 8,8 (6,7%) 6,8 (9,5%) 33,9 (46,6%) 83,9 (9,8%) 34,3 (3,%) 36,5 (,5%),9 7 RM84 RM490 RM580 RM5 RM47 RM8 RM RM37 RM48 RM RM445 RM8 RM48 (9,5%) 9,6 (4,%) 4,6 (4,4%) 6,7 (39,5%) 53,5 (,9%), (33,0%) 39,7 (6,0%) 8,8 (9,0%) 33, (5,%) 5,7 (5,7%) 6, (43,0%) 64,7 8 RM RM79 RM555 RM49 RM6 RM475 RM63 RM RM40 RM66 RM38 RM506 RM6 (4,5%) 4,9 (,7%) 3, (7,8%) 7,8 (0,0%) 0, (3,9%) 4,3 3 8A RM RM489 RM3 RM8 RM56 RM30 RM64 (8,3%) 8,3 (7,%) 7,9 (6,3%) 9, (46,7%) 84 (5,%) 5 (8,%) 8 3A 9 RM46 RM68 RM50 RM44 RM464 RM566 RM57 RM0 (43,0%) 64,8 (8,0%) 8, (8,%) 3 (,6%) 4 0 RM307 RM73 RM474 RM6 RM467 RM7 (4,%) 4,5 (7,5%) 30,8 (3,3%) 5, (3,0%) 36, (6,6%) 6,7 (8,%) 9 (,%) 3 (,6%) (39,6%) 53 5 RM548 RM437 RM509 RM440 RM6 RM538 RM67 RM0 RM09 RM RM44 (9,0%) 9,0 (,4%),9 (4,0%) 6,0 (7,4%) 7,5 (5,8%) 6 (5,9%) 8 6 RM70 RM50 RM50 RM340 RM439 RM9 RM47 RM77 Gambar 5. Peta pautan 66 primer mikrosatelit pada 94 individu F (Dupa x ITA3). Angka menunjukkan persentase frekuensi rekombinasi, disusul jarak antarmarka (cm) dan nama marka. Fig. 5. Linkage map of 66 microsatellite primers of 94 F lines (Dupa x ITA3). Numbers show percentage of recombination frequency, followed by a distance between markers (cm) and marker name.

7 Identifikasi marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi... 4 pengulangan pemilihan sampel populasi. Penyimpangan segregasi akan mempengaruhi tingkat kepercayaan uji pautan. Hasil uji X (Tabel ) menunjukkan bahwa 48 marka (7,73%) berperilaku seperti hukum Mendell (::), sedang 8 marka sisanya (7,7%) tidak berperilaku seperti hukum Mendell. Penyimpangan ini terjadi pada kromosom ( marka), kromosom 3 (4 marka), kromosom 3A ( marka), kromosom 4 ( marka), kromosom 5 ( marka), kromosom 6 (3 marka), kromosom 7 ( marka), kromosom 9 ( marka), dan kromosom ( marka). Dari 8 marka yang menyimpang, 50% cenderung ke tetua ITA3, 8% ke tetua Dupa, dan % ke kedua tetua (heterosigot). Hal ini menunjukkan bahwa alel-alel pada 8 lokus tidak bersegregasi secara bebas. Setengah dari lokus-lokus tersebut masih didominasi oleh genotipe ITA3 (genotipe aa). Analisis marka tunggal Metode analisis marka tunggal tidak membutuhkan informasi susunan marka pada peta pautan. Metode ini membagi populasi ke dalam kelas-kelas berdasarkan genotipe setiap lokus/marka, dan menganggap adanya satu QTL jika terdapat perbedaan nyata dalam rataan skor fenotipe untuk masing-masing kelompok. Analisis marka tunggal dapat menggunakan uji t- student, analisis varian (F) atau regresi (McCouch dan Doerge 995). Uji t-student digunakan apabila genotipe yang diuji hanya ada dua macam, misal MM dan mm. Apabila genotipe yang diuji lebih dari dua macam dapat digunakan uji varian (F) atau regresi. Marka terpaut dengan QTL bila nilai peluangnya kurang dari 0,05 atau 0,0. Hasil analisis statistik untuk analisis marka tunggal dan proporsi genotipe dapat dilihat pada Tabel. Berdasarkan nilai peluang tersebut dapat ditentukan marka yang diduga terpaut dengan sifat toleransi terhadap keracunan Al. Marka-marka yang diduga terpaut dengan sifat tersebut adalah RM49 (kromosom ), RM 3 (kromosom 3), RM48 (kromosom 7), RM445 (kromosom 7), dan RM566 (kromosom 9). Namun, bila dilihat dari sumber segmen DNA, hanya marka RM48 dan RM445 (kromosom 7) yang memenuhi syarat. Dua marka ini memiliki segmen DNA dari Dupa sebagai sumber tetua toleran, sedangkan tiga marka lainnya mempunyai segmen DNA yang berasal dari ITA3 sebagai tetua peka. Hasil ini sesuai dengan analisis lanjutan (analisis permutasi) yang dilakukan.000 kali yang menghasilkan RM48 dan RM445 berbeda nyata pada taraf 5% (F hit RM48=3,56 dan F tabel =,98; F hit RM445=3,5 dan F tabel =,9). Analisis marka interval Analisis marka interval digunakan karena QTL yang dideteksi kadang-kadang berada di antara dua marka. Analisis dilakukan dengan membandingkan nilai sifat (fenotipik) pada genotipe-genotipe dua marka dan memperkirakan pengaruh QTL yang diperoleh. Dengan membandingkan dua marka secara berurutan akan didapatkan posisi QTL di antara dua marka. Untuk menentukan ada tidaknya QTL dapat dilihat dari nilai regresi untuk masing-masing marka interval, atau dengan melihat nilai kemungkinan maksimum (nilai LOD maksimum). Untuk penelitian ini digunakan nilai batas LOD, yakni dengan membandingkan puncak LOD masingmasing kromosom dengan batas LOD minimal yang diperkenankan pada taraf 5%. Penentuan batas LOD minimal menggunakan analisis permutasi atau membandingkan dengan tabel simulasi yang telah dibuat. Batas LOD sangat tergantung pada panjang kromosom. Berdasarkan analisis menggunakan program Qgene (data tidak ditampilkan), dapat diketahui LOD tertinggi untuk tiap-tiap puncak interval masing-masing kromosom. LOD untuk masing-masing kromosom tidak terlalu tinggi. Untuk melihat LOD yang ideal, hasil ini kemudian dibandingkan dengan tabel simulasi menurut Van Ooijen (999) yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel. Berdasarkan tabel tersebut dapat disimpulkan bahwa dengan menggunakan analisis marka interval belum didapatkan marka-marka yang terpaut dengan sifat toleransi terhadap keracunan Al. Hal ini sesuai dengan hasil analisis permutasi di mana marka dianggap terpaut dengan QTL bila puncak LOD melebihi 3,33 (taraf 5%) atau 4,45 (taraf %). Marka-marka yang dianalisis dalam penelitian ini masih belum bisa dipakai sebagai alat seleksi. Walaupun analisis marka tunggal mendapatkan dua marka yang terpaut dengan QTL, tetapi hasil tersebut belum memberikan gambaran rinci mengenai frekuensi rekombinasi di antara marka-marka dengan QTL dan juga efek dari QTL tersebut. Sebelum ditemukan metode analisis marka interval, hasil analisis tiap-tiap marka tunggal dibandingkan satu sama lain untuk memperkirakan posisi QTL yang lebih tepat. Tersedianya program komputer untuk analisis marka interval telah mempermudah dan mempercepat proses analisis marka interval. QTL yang berada di antara dua marka akan memberikan gambaran yang lebih lengkap mengenai efek dan posisinya. Analisis marka tunggal masih bisa digunakan bila peta pautan belum didapatkan. Namun bila peta pautan sudah berhasil dibuat,

8 4 Joko Prasetiyono et al. Tabel. Hasil analisis statistik marka tunggal (nilai peluang) dan proporsi genotipe (nilai X ). Table. Statistical results for single marker analysis (probability value) and genotype proportion (X values). Marka Kromosom Jarak (cm) Sumber Nilai peluang LOD Marker Chromosomes Distance Source Prob. value X RM37 0 Dupa 0,3 0,599,93 RM 33,9 Dupa 0,89 0,377,48 RM8 40,7 Dupa,6 0,0603 0,38 RM47 59,5 Dupa 0,76 0,844 0,376 RM5 5 Dupa 0,75 0,88 0,8 RM580 65,3 ITA3 0,06 0,8748 5,83 RM490 9 Dupa 0, 0,800 5,93 RM84 09,5 Dupa,0 0,03, RM38 0 Dupa 0,75 0,883 0,67 RM66 6, Dupa,6 0,0605 0,893 RM40 3,9 Dupa 0,5 0,38 5,07 RM 65 Dupa 0,03 0,9353,59 RM63 93,8 Dupa 0,4 0,393,03 RM475 33,5 ITA3 0,7 0,548 7,37 RM6 45,6 Dupa 0,0 0,978,43 RM49 99, ITA3,69 0,03* 4,95 RM555 5,8 ITA3 0,4 0,40 0,3 RM79 40,4 ITA3 0,6 0,53, RM 50 ITA3 0,3 0,56,87 RM8 3 0 ITA3 0,55 0,935 3,3 RM3 3 7,8 ITA3,44 0,0404* 37,9 RM Dupa 0,08 0,8368 0,4 RM 3 45,9 Dupa 0,09 0,88 0,68 RM44 3A 0 ITA3,9 0,0565 0,3, RM50 3A 9, ITA3 0,05 0,8946 3,9 RM68 3A 47, ITA3 0,6 0,560 8,36 RM46 3A 55,4 ITA3 0,9 0,54 6,46 RM ITA3 0,54 0,3004 0,3 RM ,8 ITA3 0,07 0,8556 7,4 RM Dupa 0,4 0,39 0,45 RM6 5 6,7 Dupa 0,7 0,0,6 RM ,9 ITA3 0,6 0,700 0,5 RM , ITA3 0,4 0,4 0,7 RM ,9 Dupa 0,47 0,3509 6, RM ,4 Dupa 0, 0,8005 0,3 RM Dupa 0,5 0,758 4,8 RM ,5 Dupa 0,36 0,4485 5,8 RM ,5 ITA3 0,5 0,76 7,53 RM50 6 9,4 ITA3 0,5 0,578 57,47 RM ,4 ITA3 0,69 0,49,7 RM Dupa,53 0,033*,9 RM8 7,9 Dupa 0,69 0,49 3,8 RM ,4 Dupa,5 0,0347* 3,7 RM 7 93,7 Dupa 0,4 0,733 8,8 RM ,6 ITA3 0,9 0,655,4 RM6 8 0 ITA3 0,08 0,8367 0,33 RM ,7 Dupa 0,0 0,9564 0,09 RM64 8A 0 ITA3 0,34 0,469,54 RM30 8A 4,3 ITA3 0,6 0,567 5,4 RM56 8A 4,4 ITA3 0,33 0,479,7 RM0 9 0 ITA3 0,34 0,4688 6,3 RM57 9 8,9 ITA3 0,35 0,4585 9,3 RM ,6 ITA3,5 0,0339* 0,69 RM ITA3 0, 0,786 0,7 RM7 0 0 ITA3 0,08 0,837 4,7 RM467 0,8 ITA3 0,3 0,49,83

9 Identifikasi marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi Tabel. (lanjutan). Table. (continued). Marka Kromosom Jarak (cm) Sumber Nilai peluang LOD Marker Chromosomes Distance Source Prob. value X RM6 0 43,6 ITA3 0,05 0,8946,46 RM ,7 ITA3 0,3 0,57 0,7 RM44 0 ITA3 0,5 0,34 0,3 RM 53,9 Dupa 0,93 0,6 6,4 RM09 66,7 Dupa 0,09 0,883 5,6 RM0 90,4 Dupa 0,3 0,55,09 RM67 09,4 Dupa 0,4 0,73 3,47 RM77 0 ITA3 0,47 0,3509 0,78 RM47 8,7 Dupa 0,58 0,749 0,8 RM9 45 Dupa 0,6 0,7003 3,43 Keterangan: Jumlah sampel yang dianalisis bervariasi dari 87 sampai 94 karena beberapa nomor tidak ada pita atau pitanya tidak seperti kedua tetuanya (data hilang). Sumber: asal segmen DNA yang terdeteksi. *Berbeda nyata pada taraf 5% (P<0,05). Nilai X < 5,99 memenuhi hukum Mendell (::). Notes: Number of samples analyzed ranged between 87 and 94 because some samples had no bands or the bands are not same as those of their parent (the data missed). Source: Origin of detected DNA. *Highly different at 5% (P<0.05). X value <5.99 fit Mendell's rule (::). Tabel. Posisi puncak QTL untuk tiap-tiap kromosom. Table. Peak position of QTL of each chromosomes. Kromosom Chromosomes Panjang total Total length Posisi QTL QTL position (cm) LOD Batas LOD Minimum LOD 09,5 RM47 -RM8,4 3, 50 RM49 -RM6,03 3, 3 45,9 RM3 -RM8,54,4 3A 55,4 RM50 -RM44,4, RM307 -RM73 0,54,7 5 3,4 RM6 -RM538 0,84, RM340 -RM50 0,63,7 7 77,6 RM48 -RM8,73 3 RM445 -RM, ,7 RM6 -RM506 0,,7 8A 4,4 RM30 -RM64 0,6,4 9 9 RM57 -RM566,5,9 0 5,7 RM7 -RM467 0,3,7 09,4 RM -RM44 0,9,9 45 RM47 -RM77 0,45,4 Keterangan: Batas LOD adalah LOD minimal yang akan memberikan hasil signifikan pada tingkat kepercayaan 95% (P<0,05), berbeda-beda tergantung panjang total masing-masing kromosom. Kromosom 7 memiliki dua puncak QTL yang hampir sama. Notes: Minimal LOD that gives significant result at probability level 95% (P<0.05), the values were differed among chromosomes depending on its total length. Chromosomes 7 has two QTL peaks.

10 44 Joko Prasetiyono et al. sebaiknya hasil analisis marka interval saja yang dijadikan dasar alat seleksi. Hasil penelitian ini berbeda dengan hasil yang diperoleh Nguyen et al. (00) dengan menggunakan populasi F hasil persilangan Chiembau (padi toleran Al dari Vietnam) dengan Omon (galur rakitan peka Al). Dari hasil penelitiannya, posisi QTL untuk sifat panjang akar pada kondisi keracunan Al terletak pada kromosom, sementara pada penelitian ini posisi QTL untuk sifat yang sama terletak pada kromosom 7. Hasil penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa sifat toleransi terhadap keracunan Al dikendalikan oleh lebih dari satu gen. Hal ini terbukti pula dengan penelitian menggunakan bantuan marka molekuler. Wu et al. (000) telah melakukan pemetaan QTL pada 50 galur recombinant inbred line (RIL) persilangan antara IR55 (peka Al) dan Azusena (toleran Al). Disebutkan bahwa QTL yang mengendalikan panjang akar pada kondisi tercekam Al diatur oleh gen-gen yang berada pada kromosom (RZ80-RG33) dan kromosom (RG9-RG457). Disebutkan pula bahwa pada tahap awal pembibitan, toleransi terhadap keracunan Al dikontrol oleh pengaruh aditif, sedangkan pengaruh epistasi terjadi pada akhir masa pembibitan. Berdasarkan hal tersebut Wu et al. (000) menyimpulkan bahwa QTL yang terdeteksi mungkin merupakan lokus-lokus yang terdiri atas banyak alel yang mengontrol toleransi terhadap Al, efisiensi pengikatan P, atau untuk toleransi Al dan Fe +. Nguyen et al. (00) melakukan pemetaan QTL pada 46 double haploid padi hasil persilangan CT M (toleran Al) dan IR (peka Al) dengan menggunakan 80 marka DNA (RFLP, AFLP, dan mikrosatelit). Posisi QTL untuk panjang akar pada kondisi tercekam Al terdapat pada kromosom, 6, 7, 9, 0,dan, sedangkan pada kondisi normal pada kromosom, 7, dan 8. Dibandingkan dengan tanaman lain, ternyata toleransi tanaman padi terhadap keracunan Al tidak diatur oleh gen-gen yang mengumpul di satu tempat (satu kromosom) melainkan menyebar. Oleh karena itu, disarankan untuk merakit tanaman yang mengandung banyak gen (pyramiding gen) (Nguyen et al. 00). Perbedaan hasil penelitian ini dengan penelitian sebelumnya diduga karena penggunaan tetua persilangan yang berbeda. Mekanisme toleransi terhadap keracunan Al yang dimiliki Dupa mungkin berbeda dengan tetua toleran Al yang digunakan oleh peneliti sebelumnya. Untuk memastikan hal ini perlu dilakukan eksplorasi lebih jauh mengenai keterpautan QTL yang berada pada kromosom, 3, 7, dan 9 dengan menggunakan populasi F yang lebih besar dari 94 tanaman seperti yang digunakan dalam penelitian ini. KESIMPULAN Teknik seleksi untuk ketahanan terhadap keracunan Al dengan menggunakan larutan Yoshida cukup sederhana, mudah, dan akurat. Pemetaan menghasilkan 4 peta pautan, di mana kromosom 3 dan 8 terpecah menjadi dua. Total jarak kromosom yang tercakup sebesar.430 cm dengan jarak rata-rata antarmarka 7,5 cm. Analisis marka tunggal mendapatkan dua marka mikrosatelit pada kromosom 7 (RM48 dan RM445) yang diduga terpaut dengan sifat toleransi terhadap keracunan Al. Analisis marka interval belum mendapatkan marka-marka yang secara nyata menunjukkan posisi QTL. Perlu dilakukan analisis lanjutan dengan menambah jumlah individu F (Dupa x ITA3) menjadi 90 individu dan menambah jumlah primer mikrosatelit dengan mengkonsentrasikan pada kromosom, 3, 7, dan 9. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih ditujukan kepada Ir. Erwina Lubis (Balai Penelitian Tanaman Padi) yang telah menyediakan bahan persilangan, serta Ir. M. Yunus, MSi; Dwinita W. Utami, MSi; dan KRT Trijatmiko, MSi (Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian) yang telah meluangkan waktunya untuk mendiskusikan penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Akagi, H., Y. Yokozeki, A. Inagaki, and T. Fujimura Microsatellite DNA markers for rice chromosomes. Theor. Appl. Genet. 93: Bennet, J Maps and markers. In Genome Analysis of Plant, Pests, and Pathogens. Workshop Handbook. IRRI, Los Banos. p Chen, X., S. Temnykh, Y. Cu, F.G. Cho, and S.R. McCouch Development of a microsatellite framework map providing genome wide coverage in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 95: Dellaporta, S.L., J. Wood, and J.B. Hicks A plant DNA minipreparation: version II. Plant. Mol. Biol. Rep (4): 9-. Bianchi-Hall, C.M., T.E. Carter, T.W. Rufty, C. Arellano, H.R. Boerma, D.A. Ashley, and J.W. Burton. 998.

11 Identifikasi marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi Heritability and resource allocation of aluminum tolerance derived from soybean PI Crop Sci. 38: Khatiwada, S.P., D. Senadhira, A.L. Carpena, R.S. Zeigler, and P.G. Fernandez Variability and genetics of tolerance for aluminum toxicity in rice (Oryza sativa L). Theor. Appl. Genet. 93: Lubis, E. dan Suwarno Seleksi padi gogo yang cocok untuk lahan masam. Buletin Plasma Nutfah 6(): McCouch, S.R. and S.D. Tanksley. 99. Development and use of restriction fragment length polymorphism in rice breeding and genetics. p In G.S. Khush and G.H. Toenniessen (Eds.). Rice Biotechnology. IRRI. Los Banos, Philippines. McCouch, S.R. and R.W. Doerge QTL mapping in rice. TIG (): McCouch, S.R., X. Chen, O. Panaud, S. Temnykh, Y. Xu, Y.G. Cho, N. Huang, T. Ishii, and M. Blair Microsatellite marker development, mapping, and applications in rice genetics and breeding. Plant Mol. Biol. 35: Nasution, I. dan O. Sudarman Penelitian status hara padi sawah di tanah masam. Kumpulan Makalah Seminar Balai Penelitian Tanaman Pangan Bogor: Nasution, I. dan T. Suhartini. 99. Evaluasi metode uji ketahanan kultivar padi gogo terhadap tanah masam. Prosiding Lokakarya Penelitian Komoditas dan Studi Khusus 99. AARP-Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian bekerja sama dengan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Jakarta. hlm Nguyen, V.T., M.D. Burow, H.T. Nguyen, B.T. Le, T.D. Le, and A.H. Paterson. 00. Molecular mapping of genes conferring aluminum tolerance in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 0: Nguyen, V.T., B.D. Nguyen, S. Sarkarung, C. Martinez, A.H. Paterson, and H.T. Nguyen. 00. Mapping of genes controlling aluminum tolerance in rice: Comparison of different genetic backgrounds. Mol. Genet. Genomics 67: Panaud, O., X. Chen, and S.R. McCouch Frequency of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.). Genome 38: Panaud, O., X. Chen, and S.R. McCouch Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L.). Mol. Gen Genet. 5: Powell, W., M. Morgante, C. Andre, M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey, and A. Rafalski The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breed. : Septiningsih, E.M., J. Prasetiyono, E. Lubis, T.H. Tai, T. Tjubaryat, S. Moeljopawiro, and S.R. McCouch Identification of quantitative trait loci for yield and yield components in an advanced backcross population derived from the Oryza sativa variety IR64 and the wild relative O. rufipogon. Theor. App. Gen. 07: Soepardi, G Disawahkan dan tidak disawahkan sehubungan dengan pupuk P. Pertemuan Teknis Evaluasi Kerjasama Penelitian dan Pengujian ZA dan TSP di Petrokimia Gresik. PT Petrokimia Gresik. Gresik. 9 hlm. Subagyo, H., N. Suharta, dan Agus B.S Tanah-tanah pertanian di Indonesia. hlm Dalam A. Adimihardja, L.I. Amien, F. Agus, dan D. Djaenuddin (Ed.). Sumberdaya Lahan Indonesia dan Pengelolaannya. Pusat Penelitian Tanah dan Agroklimat, Bogor. Temnykh, S., W.D. Park, N. Ayres, S. Cartinhour, N. Hanck, L. Lipovich, Y.G. Cho, T. Ishii, and S.R. McCouch Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 00: Van Ooijen, J.W LOD significance thresholds for QTL analysis in experimental populations of diploid species. Heredity 83: Wu, P., B. Zhao, J. Yan, A. Luo, Y. Wu, and D. Senadhira Genetic control of seedling tolerance to aluminum toxicity in rice. Euphytica 97: Wu, P., C.Y. Liao, B. Hu, K.K. Yi, W.Z. Jin, J.J. Ni, and C. He QTLs and epistasis for aluminum tolerance in rice (Oryza sativa L.) at different seedling stages. Theor. Appl. Genet. 00: Yoshida S., D.A. Forno, J. Cock, and K.A. Gomez Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice. IRRI, Los Banos, Philippines. 83 pp.