Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer (Sambrook et al ) Elektroforesis DNA Seleksi PCR dengan Marka Bradbury (Bradbury et al .

Transkripsi

1 7 Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer (Sambrook et al. 1989) Hasil isolasi DNA selajutnya dianalisis dengan spektrofotometeri untuk melihat konsentrasi dan kemurnian DNA. Sebanyak 2 µl DNA ditambahkan dengan 98 µl akuades dalam kuvet. Pengukuran konsentrasi sampel dilakukan pada panjang gelombang 260 nm. Kemurnian DNA sampel diukur pada perbandingan panjang gelombang 260/280nm. Sampel DNA yang murni mempunyai rasio 1.8 hingga 2.0. Apabila rasionya kurang dari 1.8 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan protein, dan untuk menghilangkannya ditambahkan proteinase. Apabila rasionya lebih dari 2.0 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan RNA, dan untuk menghilangkannya ditambahkan ribonuklease. Tahap selanjutnya DNA diencerkan dengan konsentrasi akhir 50 ng/ µl untuk proses amplifikasi PCR. Seleksi PCR dengan Marka Bradbury (Bradbury et al. 2005b) Hasil isolasi DNA tanaman BC2F1 CM yang telah disamakan konsentrasinya selanjutnya diamplifikasi dengan mesin PCR. Campuran reaksi untuk PCR terdiri atas 2 µl bufer PCR 10, 1.2 µl MgCl 2 50 mm, 0.4 µl dntp mix 50 mm, 1 µl untuk masing-masing marka external sense primer (ESP), internal fragrant antisense primer (IFAP), internal non-fragrant sense primer (INSP), dan external antisense primer (EAP), 0.16 µl Taq polymerase, 2 µl DNA 50 ng/ µl, dan ddh 2 O. Kemudian diamplifikasi dengan mesin PCR sebanyak 0 siklus pada kondisi denaturasi awal 94 0 C selama 2 menit, denaturasi 94 0 C selama 0 detik, penempelan marka 55 0 C selama 0 detik, perpanjangan marka 72 0 C selama 45 detik, dan perpanjangan marka akhir 72 0 C selama 5 menit. Amplifikasi DNA dengan Marka RM22 (Lang dan Buu 2008) Hasil isolasi DNA tanaman BCF1 CP yang telah disamakan konsentrasinya selanjutnya diamplifikasi dengan mesin PCR. Campuran reaksi untuk PCR terdiri atas 2 µl bufer PCR 10, 1.2 µl MgCl 2 50 mm, 0.4 µl dntp mix 50 mm, 1 µl masing-masing marka RM μl (forward dan reverse), 0.16 µl Taq polymerase, 2 µl DNA 50 ng/ µl, dan MQ H 2 O. Kemudian diamplifikasi dengan mesin PCR sebanyak 5 siklus pada kondisi denaturasi awal 94 C selama 5 menit, denaturasi 94 C selama 1 menit, penempelan marka 55 C selama 0 detik, perpanjangan marka 72 C selama 1 menit, dan perpanjangan marka akhir 72 C selama 5 menit. Elektroforesis DNA Produk PCR selanjutnya dilihat dengan elekroforesis. Sebanyak 10 µl produk PCR ditambahkan dengan 2 µl loading dye dan dicampur sempurna serta dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa (1.5% untuk elektroforesis dengan marka Bradbury dan % untuk elektroforesis dengan marka RM22). Marka 1 kb ladder disertakan untuk melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan tegangan listrik 80 volt selama 5 menit. Gel agarosa diwarnai dengan larutan etidium bromida (10 mg/l) selama 10 menit, kemudian dihilangkan pewarnaannya dengan air selama 5 menit. Gel agarosa selanjutnya divisualisasi dengan chemidoc gel system. HASIL DAN PEMBAHASAN Pembentukan Populasi BC2F1 CM dan BCF1 CP Persilangan tanaman padi merupakan penggabungan karakter melalui pertemuan tepung sari dengan kepala putik yang menghasilkan embrio dan kemudian embrio berkembang menjadi benih. Menurut Welsh (1981), kombinasi karakter dari kedua tetua pada individu generasi pertama terjadi secara acak, sehingga dapat menghasilkan kombinasi karakter yang lebih menguntungkan dari kedua tetuanya. Komposisi gen yang diperoleh dari hasil persilangan padi BCF1 CP yaitu 9.75%:6.25%, sedangkan padi BC2F1 CM adalah 87.5%:12.5%, artinya gen dari tetua Ciherang bersegregasi lebih banyak dalam tanaman yang disilangbalikkan. Individu BC2F1 maupun BCF1 yang dihasilkan bersifat heterozigot dan akan mengalami pemisahan pada generasi-generasi berikutnya. Pembentukan populasi BC2F1 CM dan BCF1 CP bermula dari persilangan. Dari persilangan ini dihasilkan biji tanaman padi. Biji ini yang kemudian dipelihara hingga membentuk suatu populasi tanaman hasil persilangan. Biji padi hasil persilangan dijemur atau dipanaskan terlebih dahulu selama kurang lebih 2 atau hari dengan suhu ±45 C. Kemudian biji disemai dalam cawan petri selama kurang lebih 7 hari dan

2 8 dipindahkann ke dalam bak berisi tanah untuk menyesuaikan diri dengann kondisi lingkungan yang baru. Masa penyesuaian ini dilakukan selama kurang lebih 2 minggu agar tanaman tidak stres dengan perubahan lingkungan. Tanaman kemudian dipindahkan ke dalam ember berisii tanah hingga masa panen. Persilangan dilakukan ketika masa pembungaann antara tetua jantan dan tetua betina bersamaan. Pengaturan dan penghitungan jarak waktu tanam pun menjadi hal kunci dalam persilangan. Pada penelitian ini, tetua Ciherang ditanam tiga kali yaitu: seminggu sebelum tanaman silang balik (backcross) ditanam, saat tanaman silang balik ditanam, dan seminggu setelah tanaman silang balik ditanam. Pembentukan populasi tanaman BC2F1 CM maupun BCF1 CP dapat dilihat pada gambar 5. Gambar 5 Pembentukan populasi tanaman padi BC2F1 CM maupun BCF1 CP; (a) benih yang telah dijemur; (b) disemai dalam cawan petri; (c) benih sudah tumbuh; (d) dipindahkan ke dalam bak berisi tanah; (e) dipindahkan ke dalam ember berisi tanah; (f) populasi tanaman; (g) malai yang telah berbunga (bunting); (h) disilangkan (penyerbukan); (i) benih hasil persilangan. Ketelitian khusus dalam persilangan sangat dibutuhkan terutama ketika kastrasi. Jika kastrasi tidak dilakukan dengan benar maka akan menyebabkan terjadinya penyerbukan sendiri pada bunga betina. Jika hal itu terjadi maka persilangan terarah (site- directed crossing) dinyatakan tidak berhasil. Kastrasi adalah pembuangan bagian-bagian tanaman yang tidak dibutuhkan. Kastrasi dilakukan pada bunga betina, yaitu pada tanaman BC2F1 CM dan BCF1 CP. Dalam hal ini, bagian yang tidak diperlukan yaitu benang sari dan tepung sari. Setiap bunga memiliki enam benang sari serta dua kepala putik yang menyerupai rambut dan tidak boleh rusak. Penyerbukann dilakukan sehari setelah kastrasi, sehingga putik benar-benar matang dan keberhasilan penyilangan menjadi lebih tinggi. Bunga yang telah dikastrasi kemudian ditutupi dengan kertas minyak agar tidak terjadi persilangan yang tidak diharapkan (Gambar 5h). Penyerbukan dilakukan dengan cara mengambil tepung sari dari bunga tetua jantan yaitu tanaman Ciherang. Bunga jantan diletakkan di atas bunga betina sambil digerakkan agar tepung sari jatuh ke kepala putik. Biji terbentuk 2 minggu dari dilakukannyaa penyerbukan. Biji hasil persilangan akan mempunyai bentuk melengkung, (Gambar 5i). ramping, dan tanpa sekam Pengujian Kuantitatif dan Kualitatif DNA Uji kuantitatif digunakan untuk mengukur konsentrasi DNA, sedangkan uji kualitatif digunakan untuk mengetahui kemurnian DNA. Konsentrasi DNA diukur pada panjang gelombang 260 nm dengan faktor pengenceran 200 kali, sedangkan kemurnian dilihat pada perbandingan panjang gelombang 260/280 nm. Menurut Sambrook et al. (1989), rasio kemurnian DNA yang baik adalah 1.8 hingga 2.0. Apabila rasio berada berada di bawah angka 1.8 mengindikasikan bahwa sampel DNA masih terdapat kontaminan berupa protein, sedangkan rasio berada di atas angka 2.0 mengindikasikan bahwa sampel masih terdapat kontaminann berupa RNA. Hasil pengukuran yang diperoleh menunjukkann bahwa sampel DNA kurang murni. Hal ini dapat dilihat dari rasio kemurniannya yang berada pada kisaran baik itu sampel DNA tanaman BC2F1 CM maupun BCF1 CP. Kurang murninya DNA disebabkan karena proses isolasi DNA yang kurang steril, sehingga menyebabkan protein ataupun RNA (dari lingkungan)

3 9 mengkontaminasi DNA sampel. Namun hal ini masih bisa ditolerir karena konsentrasi protein maupun RNA sangatlah kecil yaitu berkisar 5 10 μg/ml, sehingga tidak mengganggu analisa selanjutnya. Konsentrasi DNA yang diperoleh berada pada kisaran μg/ml baik itu sampel DNA tanaman BC2F1 CM maupun BCF1 CP. Konsentrasi DNA yang beragam tersebut kemudian diseragamkan menjadi 50 μg/ml dengan cara pengenceran menggunakan air destilata. Tujuan penyeragaman konsentrasi DNA agar hasil amplifikasi pada sampel yang satu dengan yang lainnya tidak berbeda jauh, sehingga ketika dielektroforesis akan mempunyai ketebalan pita yang sama. Seleksi Tanaman Padi BC2F1 CM dengan Menggunakan Marka Bradbury Tidak semua bunga yang disilangkan menghasilkan benih BC2F1 yang mengandung gen heterozigot badh2, sehingga perlu dilakukan seleksi tanaman BC2F1 CM. Seleksi tanaman BC2F1 CM tidak dapat diuji secara langsung melalui uji aroma biasa untuk melihat apakah gen badh2 dari tanaman aromatik telah bergabung dengan alel gen padi nonaromatik. Oleh karena itu, digunakan marka molekuler berbasis PCR. Analisis PCR dalam penelitian ini menggunakan marka berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Padmadi (2009). DNA tanaman padi BC2F1 CM hasil persilangan Ciherang dengan Mentik Wangi diamplifikasi dengan menggunakan marka Bradbury. Berdasarkan penelitian sebelumnya (Padmadi 2009), marka Bradbury tidak sepenuhnya dapat membedakan padi aromatik dan nonaromatik pada beberapa varietas lokal Indonesia. Varietas padi aromatik yang mempunyai pola pita DNA yang berbeda dengan padi varietas nonaromatik adalah Mentik Wangi dan Gunung Perak. Hal tersebut kemungkinan disebabkan oleh perbedaan delesi pada kromosom 8. Selain itu, penggunaan marka RM 22 tidak dapat membedakan Mentik Wangi dengan varietas nonaromatik lainnya. Oleh karena itu, marka Bradbury digunakan untuk menyeleksi tanaman BC2F1 CM. Keuntungan menggunakan marka ini yaitu mampu membedakan gen yang homozigot dominan (pada varietas nonaromatik dalam hal ini Ciherang), homozigot resesif (pada varietas aromatik dalam hal ini Mentik Wangi), dan heterozigot (pada varietas hasil persilangan). Penelitian sebelumnya Bradbury et al. (2005) mengatakan bahwa gen aroma (badh2) merupakan gen yang bersifat resesif. Tanaman hasil persilangan disinyalir memiliki gen dengan pola heterozigot yang mana pada tanaman hasil persilangan telah mengandung pita alel dari kedua tetua. Gen aroma yang bersifat resesif ini tidak terkspresi secara utuh sehingga untuk mengekpresikan karakter aroma ini perlu dilakukan selfing pada generasi BC5F1. Marka Bradbury terdiri dari empat marka, yaitu ESP (External Sense Primer), EAP (External Antisense Primer), INSP (Internal Nonfragrant Sense Primer), dan IFAP (Internal Fragrant Antisense Primer). Prinsip kerja dari keempat marka tersebut adalah dua marka EAP dan ESP akan menempel pada varietas padi aromatik dan nonaromatik. Kedua marka tersebut merupakan kontrol positif yang akan menghasilkan pita DNA berukuran 580 bp. Pasangan marka ESP dan IFAP akan menempel pada varietas aromatik dan akan menghasilkan pita DNA berukuran 257 bp. Pasangan marka EAP dan INSP akan menempel pada varietas nonaromatik dan menghasilkan pita DNA berukuran 55bp (Gambar 6). Hasil amplifikasi menunjukkan terdapat tujuh tanaman yang positif memiliki gen heterozigot badh2 dari keseluruhan dua puluh empat tanaman. Pola gen heterozigot badh2 memiliki dua buah pita yang merupakan gabungan dari kedua tetua tanaman padi Ciherang 55 bp dan Mentik Wangi berukuran 257 bp, hal ini mendukung pernyataan Bradbury et al. (2005) dan penelitian sebelumnya (Padmadi 2009; Praptiwi 2010; Sugihartati 2010). Hasil amplifikasi PCR ditampakkan dengan gel agarosa 1,5%. Penggunaan konsentrasi gel agarosa tersebut berdasarkan ukuran produk PCR yang dihasilkan. Menurut Sambrook et al. (1989), penggunaan konsentrasi tersebut untuk ukuran fragmen DNA 250 bp 12 kbp. Gambar 6 Proses amplifikasi dengan marka Bradbury (Bradbury et al. 2005).

4 10 Pola gen heterozigot ini terlihat dari pola pita hasil amplifikasi yang ditampakkan melalui elektroforegram (Gambar 7). Dari elektroforegram dapat diketahui bahwa ukuran produk hasil amplifikasi padi Mentik Wangi lebih kecil dibandingkan padi Ciherang karena adanya delesi basa pada gen badh2 padi Mentik Wangi. Ini mengindikasikan bahwa gen badh2 padi Mentik Wangi telah mengalami mutasi akibat peristiwa evolusi dalam suatuu populasi yang terisolasii secara genetik. Gen badh2 padaa padi Ciherang tidak mengalami mutasi atau masih dalam keadaan fertil. Gambar 7 Hasil amplifikasi DNA tanaman padi BC2F1 CM menggunakan marka Bradbury. Marker (M) 1 kb ladder; Ciherang (Cih); Mentik Wangi (MW); Tanaman BC2F1 CM nomor 2, 4, 5, 12, 15, 18, dan 19. Seleksi Padi BCF1 CP Menggunakan Marka RM22 Marka aromatik yang digunakann untuk menyeleksi tanaman hasil persilangan Ciherang dengan Pandan Wangi adalah marka RM22 (Lang dan Buu 2008). Berdasarkan penelitian sebelumnya (Padmadi 2009), marka RM22 dapat membedakan secara jelas pola amplifikasi antara padi Ciherang dengan Pandan Wangi akibat adanya polimorfisme pada kromosom nomor 8. Namun, ketika digunakan marka Bradbury pola amplifikasi antara padi Ciherang dengan Pandan Wangi tidak dapat dibedakan. Oleh karena itu, marka RM22 digunakann untuk menyeleksi padi BCF1 CP. Keuntungan menggunakan marka ini yaitu mampu membedakan homozigot nonaroma (dominan), homozigot aroma (resesif), dan heterozigot. Marka RM22 dapat mengamplifikasi DNA Ciherang dengan ukuran 160 bp, Pandan Wangi 140 bp, dan BCF1 CP mengasilkan dua pita dengan ukuran 140 dan 160 bp. Penelitian sebelumnya (Padmadi 2009) juga telah membuktikan marka RM22 mampu membedakan padi Pandan Wangi dan Ciherang. Penggunaan marka RM22 mampu mengamplifikasi padi aromatik dan nonaromatik dengan variasi panjang fragmen DNA antara 120 bp 160 bp (Gambar 8) (Lang dan Buu 2008). Elektroforegram yang diperoleh dari dua puluh tiga tanaman padi BCF1 CP menunjukkann bahwa sebanyak sembilan tanaman padi BCF1 CP positif mengandung gen heterozigot badh2. Pola gen heterozigot seperti yang terlihat pada pola pita hasil elektroforesiss gel agarosa memiliki dua buah pita yang merupakan kombinasi dari kedua tetua padi Ciherang dan Pandan Wangi (Gambar 9). Hasil penelitian diperoleh ukuran produk amplifikasi dari padi Ciherang lebih besar daripada Pandan Wangi disebabkan oleh adanya delesi basa pada padi Pandan Wangi. Adanya delesi basa padaa gen badh2 padi Pandan Wangi mengindikasikan bahwa gen tersebut telah mengalami mutasi sama halnya yang terjadi pada padi Mentik Wangi. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwaa pola amplifikasi pada tanaman BCF1 CP menunjukkann sifat heterozigot yaitu mengandung gen dari kedua tetua bp Gambar 8 Proses amplifikasi dengan marka RM22 (Lang dan Buu 2008) ). Gambar 9 Hasil amplifikasi DNA tanaman padi BCF1 CP menggunakan marka RM22. Marker (M) 1 kb ladder; Ciherang (Cih); Pandan Wangi (PW); Tanaman BCF1 CP nomor 1,, 7, 9, 12, 14, 15, 18, dan 21.

5 11 Hasil PCR ditampakkan dengan menggunakan gel agarosa %. Penggunaan konsentrasi tersebut berdasarkan perbedaan basa yang sangat kecil yaitu 20 basa dan tidak akan terlihat berbeda jika digunakan konsentrasi gel agarosa di bawah %. Pengamatan Karakter Tanamann Padi BC2F1 CM dan BCF1 CP Pengamatan karakter tanaman dilakukan terhadap tanaman yang positif mengandung gen heterozigot badh2. Variabel karakter tanaman yang diamati meliputi jumlah anakan, tinggi tanaman, rata-rata jumlah butir padi per malai, waktu tanam, dan waktu berbunga. Hasil pengamatan yang dilakukan (Tabel 1) menunjukkan adanya keragaman karakter dari tetua donor maupun pemulih terhadap tanamann hasil persilangan. Pengamatan tanamann padi BC2F1 CM menunjukkan jumlah anakan (11 16 anakan) dan jumlah gabah padi per malai (9 12 butir) telah mengikuti karakter Ciherang (14 17 anakann dan 90 gabah per malai) (Hermanto 2006). Adapun waktu tanam BC2F1 CM ( 120 hari) dan waktu berbunganya (bulan ke-) juga telah mengikuti karakter Ciherang (116 hari waktu tanam dan berbunga pada bulan ke-) (Hermanto 2006). Sementara, tinggi tanaman BC2F1 CM (68 90 cm) masih belum mengikuti karakter Ciherang (107 cm). Karakter ini masih mengikuti tetua donornya yaitu Mentik Wangi yang memiliki tinggi tanaman berkisar 95 cm (Hermanto 2006). Secara keseluruhan, BC2F1 CM telah mengikuti Ciherang. Gabah padi Pandann Wangi berbentuk bulat gemuk, berbulu, dan tahan rontok. Dari hasil pengamatan, ada bentuk gabah yang sudah mengikuti karakter Ciherang (tidak berbulu, bentuk, panjang ramping, warna gabah kuning bersih). Sebagian lain, masih ada yang berbulu (Gambar 10) akan tetapi sudah mengikuti karakter Ciherang (gemuk, bulat, dan tahan rontok). Gambar 10 Gabah padi yang berbulu (panah merah) pada tanaman BCF1 CP. Tabel 1 Hasil pengamatann karakter tanaman padi Tanamann padi Tinggi Rata-rata Jumlah tanaman jumlah bulir anakan (cm) padi per malai BC2F1 (2)* CM BC2F1 (4)* CM BC2F1 (12)* CM BC2F1 (15)* CM BC2F1 (18)* CM BC2F1 (19)* CM BCF1 (1)* CP BCF1 ()* CP BCF1 (7)* CP BCF1 (9)* CP BCF1 (12)* CP BCF1 (14)* CP BCF1 (15)* CP Ciherang Mentik Wangi Pandan Wangi Ket.: (*) = nomor sampel tanaman Waktu tanam (hari) Waktu berbunga (bulan ke-) 4 4

6 12 Pengamatan tanaman BCF1 CP diketahui bahwa waktu tanam BCF1 CP ( 119 hari) dan waktu berbunganya (bulan ke-) telah mengikuti karakter Ciherang (116 hari waktu tanam dan berbunga pada bulan ke-) (Hermanto 2006). Pengamatan yang dilakukan terhadap jumlah anakan BCF1 CP (14 21 anakan) dan jumlah gabah per malai (9 16 bulir) juga telah mengikuti karakter Ciherang (14 17 anakan dan 90 gabah per malai) (Hermanto 2006). Sementara, tinggi tanaman BCF1 CP (68 85 cm) masih belum mengikuti karakter Ciherang (107 cm). Namun, secara keseluruhan karakter BCF1 CP telah mengikuti karakter Ciherang. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pembentukan tanaman padi BCF1 CP dan BC2F1 CM berhasil dilakukan. Keberhasilan ini dapat dilihat dari pita heterozigot menggunakan marka spesifik Bradbury untuk BC2F1 CM dan RM22 untuk BCF1 CP. Marka Bradbury dan RM22 dapat melacak introgresi badh2 termutasi dari padi Mentik Wangi dan Pandan Wangi ke padi Ciherang. Kedua marka tersebut juga dapat menentukan status gen (fertil atau termutasi) dan alel (homozigot atau heterozigot) badh2. Tanaman BC2F1 CM dan BCF1 CP secara umum telah mengikuti karakter tetua Ciherang. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut hingga dihasilkan tanaman generasi BC5F2 untuk mendapatkan benih Ciherang nontransgenik aromatik. Penentuan urutan basa nukleotida pada padi varietas aromatik dan nonaromatik lokal lainnya juga perlu dilakukan untuk menentukan marka aromatik yang lebih spesifik untuk padi-padi tersebut. DAFTAR PUSTAKA Adijono P, Bambang K, Allidawati, Suwarno Pemuliaan padi aromatik dan ketan. Dalam: Mahyudin Syam, Hermanto, A. Musadad dan Sunihaardi (eds.). Kinerja Penelitian Tanaman Pangan. Pusat Penelitian Tanaman Pangan. Bogor. hal Ahn SN, Bollish CN, Tanksley SD RFLP tagging of a gene for aroma in rice. Theor Appl Genet 84: Berner DK, Hoff BJ Inheritance of scent in American long grain rice. J Crop Sci 26: Bhattacharjee et al Basmati rice: a review. International. J Food Sci and Tech 7: Bourgis et al Characterization of the major fragrance gene from an aromatic japonica rice and analysis of its diversity in Asian cultivated rice. Theor Appl Genet : Bradbury L Identification of the gene responsible for fragrance in rice characterisation of the enzyme transcribed from this gene and its homolog [tesis]. Australia: Faculty of Science and Management, School of Environmental. Bradbury LM, Fitgerald TL, Henry RJ, Jin Q, Waters DLE. 2005a. The gene for fragrance in rice. J Plant Biotech : Bradbury LMT, Henry RJ, Jin Q, Reinke RF, Waters DLE. 2005b. A perfect marker for fragrance genotyping in rice. J Mol Breed 16: Buttery RG, Ling LC, Juliano BO, Turnbaugh JG Cooked rice aroma and 2-acetyl-1-pyroline in rice. J Agric Food Chem 1: Doyle JJ, JL Doyle Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: Gasser CS, Farley RT Genetically engineered plants for crop improvement. Science 244: Hami Seno DS, Santoso TJ, Tri Jatmiko KR, Padmadi B, Praptiwi D Konstruksi padi nonaromatik yang beraroma wangi menggunakan PCR berbantuan marka gen badh2. Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelitian IPB 2009, ISBN: ,