Lampiran 1 Rancangan penelitian

LAMPIRAN 18

19 Lampiran 1 Rancangan penelitian Cacing tanah E. foetida dewasa Kering oven vakum (Setiawan) Tepung cacing kering Ekstraksi buffer dan sentrifugasi Ekstrak kasar protease Salting-out dengan amonium sulfat Pengukuran bobot molekul (SDS-PAGE metode Laemmli 1970) Konsentrasi protein (Bradford 1976) Presipitat Dialisis Dialisat Kromatografi kolom Aktivitas enzim dengan pengaruh suhu, ph, waktu inkubasi (Jackson 1988) Spesifisitas substrat secara spektrofotometri Eluat

20 Lampiran 2 Daftar faktor pembekuan darah Faktor Pembekuan Keterangan Faktor I Fibrinogen Faktor II Protrombin Faktor III Tromoboplastin jaringan (faktor jaringan) Faktor IV Ion kalsium (Ca 2+ ) Faktor V Faktor labil (proaccelerin) Faktor VI Belum didefinisikan* Faktor VII Faktor stabil (serum prothrombin conversion accelerator (SPCA) proconvertin) Faktor VIII Faktor antipembekuan darah, faktor VIII:C (protein pembekuan darah) Faktor IX Faktor Christmas (plasma thromboplastin component (PTC), faktor B antihemofilia) Faktor X Faktor Stuart-Prower Faktor XI Plasma thromboplastin antecedent (PTA) Faktor XII Faktor Hageman (faktor kontak) Faktor XIII Fibrin-stabilizing factor (FSF) Faktor Fitzgerald High-molecular-weight kininogen (HMWK) Faktor Fletcher Prekallikrein * Penamaan faktor VI dibatalkan karena senyawa yang dahulu dianggap sebagai faktor pembekuan darah sebenarnya adalah prekursor dari faktor V, dan untuk menghindari kekeliruan, faktor VI belum didefinisikan hingga saat ini.

21 Lampiran 3 Pembuatan bufer-bufer 1. Bufer fosfat ph 7 Sebanyak 8.9 g NaH 2 PO 4 ditambahkan dengan 2 g NaOH lalu dilarutkan dalam 525 ml akuades. 2. Bufer 50 mm Tris-HCl ph 7.5 Sebanyak 1.63 g Tris dilarutkan dalam 200 ml akuades, lalu ph diukur. Larutan kemudian dititrasi menggunakan HCl hingga ph menjadi 7.5. Volum ditera menggunakan akuades hingga 250 ml. 3. Bufer 1.5 M Tris-HCl ph 8.8 Sebanyak 18.15 g Tris dilarutkan dalam 60 ml akuabides, kemudian dititrasi menggunakan NaCl hingga ph mencapai 8.8. Bufer ditera menggunakan akuabides hingga volum 100 ml. Simpan bufer pada suhu 4 C. 4. Bufer 0.5 M Tris-HCl ph 6.8 Sebanyak 6 g Tris dilarutkan dalam 60 ml akuabides lalu dititrasi menggunakan NaCl hingga ph 6.8. Bufer ditera menggunakan akuabides hingga volum 100 ml. Simpan bufer pada suhu 4 C. 5. Bufer sampel elektroforesis Bufer 0.5 M Tris-HCl ph 6.8 sebanyak ml ditambahkan 2.5 ml gliserol, 1 ml SDS 10% ( v), 5 ml 2-merkaptoetanol, 0.5 ml bromofenol biru 1% ( v), lalu dilarutkan dalam 5 ml akuades. Simpan dalam lemari pembeku 6. Bufer running Sebanyak 1.803 g Tris ditambahkan 8.648 g glisina, dan 0.6 g SDS, kemudian dilarutkan dalam 500 ml akuades. Larutan dititrasi menggunakan 1 M HCl hingga ph menjadi 8.3. Tera dengan akuades hingga volum 600 ml. Simpan pada suhu 4 C. 7. Bufer 0.1 M glisina-naoh ph 8 Ditimbang 75 g glisina dilarutkan dalam 50 ml akuades, kemudian ph ditera menggunakan NaOH hingga mencapai ph 8.

22 Lampiran 4 Prosedur regenerasi kolom DEAE-Selulosa Sigma D6418 Langkah-langkah regenerasi berikut sebaiknya dilakukan di dalam corong Buchner. Regenerasi yang dilakukan di dalam kolom dapat mengakibatkan penyumbatan yang tak kasatmata. 1. Resin disuspensikan di dalam akuades sebanyak 5 kali volum resin dan didiamkan selama 30-45 menit. 2. Volum resin diukur. Volum yang didapat dicatat sebagai Volum Kolom (VK) yang akan digunakan untuk mengukur volum larutan pencuci kolom. Lanjutkan ke langkah 3. Untuk resin dalam keadaan tersuspensi (baru atau bekas) 3. Suspensi kolom disaring. 4. Resin yang telah disaring disuspensikan ke dalam 2 VK 0.1 M NaOH yang mengandung 0.5 M NaCl selama 10 menit, maksimum selama 30 menit, kemudian dituang ke dalam corong Buchner dan pompa cairan secara PERLAHAN (laju alir 1 VK bufer/ 5 menit). Resin dicuci kembali menggunakan larutan yang sama sebanyak 2 VK. 5. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan 0.5 M NaCl (tanpa 0.1 M NaOH). Jika resin dalam keadaan sangat kotor, ditambahkan 0.5 M NaCl sebanyak 3-5 VK setelah pencucian menggunakan asam dan/atau basa dan corong dibiarkan terbuka agar larutan dapat mengalir tanpa hambatan. 6. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan 0.1 M HCl yang mengandung 0.5 M NaCl. 7. Langkah nomor 4 diulangi kembali menggunakan akuades. 8. Pencucian dilanjutkan menggunakan akuades sebanyak 5-10 VK atau hingga ph efluen lebih besar dari 5. 9. Resin disuspensikan di dalam 2 VK 1 M NaCl dan dititrasi menggunakan NaOH hingga ph suspensi berkisar antara 7-8. Simpan (Langkah 10) atau gunakan (Langkah 11). 10. Menyimpan resin: kemasan diberi label dan disimpan pada 0-5 C (Lanjutkan pada langkah 11 untuk menggunakan resin. Jika diperkirakan terjadi kontaminasi bakteri, mulailah pada Langkah 4). 11. Menggunakan resin: resin disaring kemudian dicuci menggunakan 5 VK akuades. Resin diresuspensi menggunakan 10x bufer (sesuai yang akan digunakan) sebanyak 2 VK lalu disaring. Resuspensi resin di dalam 1x bufer yang sama sebanyak 2 VK lalu ph filtrat diukur. Jika ph filtrat berkisar 0.15 dari ph 1x bufer, resin siap digunakan. Jika tidak, ulangi Langkah 11. 12. Resin dikemas ke dalam kolom. Biarkan kolom terkemas secara alami. Pemompaan dapat menyebabkan penyumbatan. 13. Sampel dimasukkan ke dalam kolom, dicuci, lalu dielusi. 14. Regenerasi kolom seperti pada Langkah 3-8.

23 Lampiran 5 Data aktivitas protease Suhu 25 C, ph 6 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 20 27 28 25±0.004 33 0.510 0.000 5 03 98 66 89±0.020 30 0.523-25 10 38 38 38 38±0.000 39 0.523-0.060 20 65 66 70 67±0.003 82 0.534-0.060 40 39 55 47 47±0.008 17 0.556 0.022 60 07 10 11 09±0.002 73 0.517 0.074 Suhu 37 C, ph 6 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 29 32 26 29±0.003 56 95 0.000 5 44 24 23 30±0.012 33 84-0.040 10 56 65 38 53±0.014 38 0.538 0.075 20 09 97 26 11±0.015 40 0.534-0.077 40 26 20 26 24±0.003 36 0.536-0.015 60 37 35 33 35±0.002 39 0.540-0.003 Suhu 60 C, ph 6 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 91 76 83 83±0.008 11 0.507 0.000 5 41 38 13 31±0.015 23 0.514 0.084 10 21 25 34 27±0.007 20 0.517 0.036 20 55 64 45 55±0.010 28 0.569 0.056 40 41 26 27 31±0.008 23 0.594 0.007 60 54 72 46 57±0.013 26 0.596 0.019 Suhu 25 C, ph 7.4 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 24 27 11 21±0.009 0.175 15 0.000 5 19 20 13 17±0.004 0.195 93 22 10 06 17 19 14±0.007 17 77-0.019 20 21 18 0.185 08±0.020 01 58 0.022 40 10 02 38 17±0.019 15 83 0.003 60 64 46 62 57±0.010 55 35 0.002

24 Lanjutan lampiran 5 Suhu 37 C, ph 7.4 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 23 39 21 28±0.010 28 93 0.000 5 54 50 50 51±0.002 42 23 0.099 10 37 30 40 36±0.005 45 17-0.054 20 42 38 54 45±0.008 43 54 0.005 40 45 44 36 42±0.005 52 38-0.013 60 41 44 57 47±0.009 40 29 0.006 Suhu 60 C, ph 7.4 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 56 59 59 58±0.002 51 93 0.000 5 89 94 88 90±0.003 63 0.555 0.185 10 83 76 73 77±0.005 68 0.560 0.031 20 03 05 97 02±0.004 68 0.581 0.054 40 73 62 58 64±0.008 69 0.609 0.070 60 02 00 72 91±0.017 67 0.629 0.057 Suhu 25 C, ph 8 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 75 66 60 67±0.008 67 57 0.000 5 81 83 82 82±0.001 69 51 0.143 10 65 67 59 64±0.004 61 67 0.015 20 67 56 60 61±0.006 72 74-0.027 40 72 69 77 73±0.004 68 65 0.006 60 65 63 80 69±0.009 76 74 0.006 Suhu 37 C, ph 8 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 29 22 22 24±0.004 0.191 71 0.000 5 24 31 24 26±0.004 03 22 10 10 44 35 38 39±0.005 03 50 0.146 20 26 31 52 36±0.014 14 58 0.045 40 44 37 30 37±0.007 20 70 0.017 60 40 40 38 39±0.001 24 0.519 0.008

25 Lanjutan lampiran 5 Suhu 60 C, ph 8 Waktu Aktivitas (menit) Ul 1 Ul 2 Ul 3 Rerata Blanko Standar ( U m ) 0 46 38 48 44±0.005 50 73 0.000 5 65 70 64 66±0.003 61 0.507 0.041 10 24 19 14 19±0.005 62 0.500 39 20 24 19 23 22±0.003 75 98 0.105 40 25 21 65 37±0.024 91 0.525 0.049 60 58 54 61 58±0.004 96 0.535 0.043 Contoh perhitungan: Misal, suhu 25 C, ph 6, menit ke-5 Ulan an Ulan an Ulan an Rerata Rerata... Rerata = 89 ktivitas U m sampel - standar - lanko lanko aktor pen enceran Waktu inku asi ktivitas U m. -.. -. ktivitas U m -.. ktivitas -. U m

26 Lampiran 6 Penentuan panjang gelombang maksimum aktivitas enzim metode Jackson Suhu 25 C, ph 6 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 23 462.0 2 34 471.0 3 60 478.0 4 90 494.0 5 46 513.0 6 96 533.0 7 0.514 544.0 8 0.520 550.0 9 0.550 567.0 10 0.553 575.0 Suhu 37 C, ph 6 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 18 458.0 2 20 465.0 3 22 472.0 4 94 490.0 5 10 502.0 6 31 511.0 7 70 536.0 8 0.500 552.0 9 0.530 570.0 10 0.531 578.0 0.6 0.5 0.55 0.5 5 5 5 400 450 500 550 600 400 450 500 550 600 Suhu 60 C, ph 6 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 94 450.0 2 09 469.0 3 23 477.0 4 53 489.0 5 72 499.0 6 01 516.0 7 62 553.0 8 69 562.0 9 91 572.0 10 93 578.0 0.55 0.5 5 5 5 400 450 500 550 600

27 Lanjutan lampiran 6 Suhu 25 C, ph 7.4 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 08 457.0 2 24 474.0 3 69 489.0 4 74 496.0 5 86 506.0 6 99 521.0 7 19 535.0 8 19 549.0 9 33 558.0 10 60 577.0 Suhu 37 C, ph 7.4 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 0.194 436.0 2 09 450.0 3 15 465.0 4 27 472.0 5 57 486.0 6 78 496.0 7 05 515.0 8 35 544.0 9 58 555.0 10 69 577.0 Suhu 60 C, ph 7.4 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 41 462.0 2 45 471.0 3 72 487.0 4 60 522.0 5 74 527.0 6 88 534.0 7 0.504 540.0 8 0.519 549.0 9 0.529 561.0 10 0.563 578.0 0.5 5 5 5 400 450 500 550 600 5 5 0.15 400 450 500 550 600 0.6 0.5 400 450 500 550 600

28 Lanjutan lampiran 6 Suhu 25 C, ph 8 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 76 434.0 2 74 444.0 3 96 456.0 4 23 464.0 5 52 472.0 6 63 477.0 7 90 497.0 8 97 563.0 9 0.507 571.0 10 0.518 577.0 Suhu 37 C, ph 8 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 57 424.0 2 84 484.0 3 09 495.0 4 07 504.0 5 29 512.0 6 67 532.0 7 85 542.0 8 0.509 556.0 9 0.508 561.0 10 0.532 577.0 Suhu 60 C, ph 8 Puncak Panjang gelombang (nm) 1 76 440.0 2 90 449.0 3 06 458.0 4 31 469.0 5 18 493.0 6 72 523.0 7 91 533.0 8 0.500 541.0 9 0.542 564.0 10 0.557 576.0 0.55 0.5 5 5 5 0.55 0.5 5 5 5 0.6 0.5 400 450 500 550 600 400 450 500 550 600 400 450 500 550 600

29 Lampiran 7 Contoh hasil pengukuran aktivitas enzim Lampiran 8 Penentuan panjang gelombang maksimum aktivitas fibrinolitik Puncak Panjang gelombang (nm) 1 0.160 423.0 2 0.172 433.0 3 07 446.0 4 28 457.0 5 66 468.0 6 60 505.0 7 65 515.0 8 43 526.0 9 23 533.0 10 89 541.0 0.1 0 400 420 440 460 480 500 520 540 560

30 Lampiran 9 Kurva standar pewarna karmoisin 1.000 0.800 0.600 00 00 0.000 y = 0.0022x + 0.0207 R² = 0.9948 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Konsentrasi pewarna (ppm) Lampiran 10 Hasil pengukuran aktivitas fibrinolitik S S S B Keterangan: B= blanko S= sampel

31 Lampiran 11 Pengukuran bobot molekul dengan PhotoCaptMW Lampiran 12 Prosedur pembuatan reagen Bradford Reagen Bradford (Bradford 1976): 1. 50 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dilarutkan dalam 25 ml etanol 95%. 2. Ditambahkan 50 ml asam fosfat 85% ( v). 3. Ditera menggunakan akuades hingga volum 0.5 liter ketika pewarna telah larut sempurna. 4. Larutan disaring menggunakan kertas Whatman no. 1 ketika akan digunakan. 5. Jika sampel tidak larut, tambahkan 1 M NaOH sebanyak 1x volume sampel. Jika sampel ditambahkan NaOH, standar juga harus diberi perlakuan yang sama.

32 Lampiran 13 Penentuan kurva standar protein metode Bradford Hari ke-1 Konsentrasi ( mg / ml ) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata 0.0000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.0125 0.108 0.126 0.087 0.107 0.0250 0.133 0.149 0.125 0.136 0.0500 02 10 19 10 0.1000 15 24 11 17 500 86 43 47 25 0.5000 0.812 0.824 0.835 0.824 0.7500 0.965 0.940 0.917 0.941 1.0000 0.944 0.995 1.023 0.987 1.2 1 y = -1.0465x 2 + 1.9578x + 0.0735 R² = 0.9852 0.8 0.6 0 0 0.6 0.8 1 1.2 Konsentrasi BSA ( mg / ml ) Berdasarkan daerah linier kurva di atas, [BSA] yang dipilih setelah disesuaikan dengan [sampel] adalah antara 0.025- mg/ml. Hari ke-2 Konsentrasi ( mg / ml ) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata Terkoreksi 0.000 0.065 0.000 0.025 0.152 0.148 0.157 0.152 0.087 0.050 04 07 00 04 0.139 0.075 25 25 23 24 0.159 0.100 42 41 38 40 0.175 0.125 55 56 61 57 0.192 0.150 80 85 83 83 18 0.175 26 18 25 23 58 00 49 49 33 44 79

33 Lanjutan lampiran 13 5 5 y = 1.2118x + 0.0463 R² = 0.9314 0.15 0.1 0.05 0 0 0.05 0.1 0.15 5 Konsentrasi BSA ( mg / ml ) Hari ke-3 Konsentrasi ( mg / ml ) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata Terkoreksi 0.000 0.065 0.000 0.025 0.132 0.128 0.137 0.132 0.067 0.050 0.164 0.177 0.160 0.167 0.102 0.075 05 05 0.193 01 0.136 0.100 22 21 18 20 0.155 0.125 55 56 41 51 0.186 0.150 80 75 73 76 11 0.175 26 18 25 23 58 00 49 49 33 44 79

34 Lanjutan lampiran 13 5 y = 1.3029x + 0.0246 R² = 0.9815 0.15 0.1 0.05 0 0.000 0.050 0.100 0.150 00 50 Konsentrasi BSA ( mg / ml ) Hari ke-4 Konsentrasi Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.025 0.039 0.033 0.045 0.039 0.050 0.102 0.088 0.104 0.098 0.075 0.153 0.154 0.156 0.154 0.100 01 0.199 0.182 0.194 0.125 40 30 42 37 0.150 72 73 61 69 0.175 09 13 11 11 00 42 48 52 47 5 5 0.15 0.1 0.05 0 y = 1.7647x + 0.0073 R² = 0.9938 0.000 0.050 0.100 0.150 00 50 Konsentrasi BSA ( mg / ml )

35 Lampiran 14 Penentuan konsentrasi protein No Konsentrasi Sampel. Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata protein ( mg / ml ) 1 Ekstrak kasar 0.174 0.196 0.186 0.185±0.011 1.009 2 Presipitat 18 16 52 29±0.020 1.259 3 Dialisat 85 32 28 15±0.026 1.746 4 Dialisat kering beku 35 30 70 12±0.036 1.729 5 Ekstrak kolom 9 0.040 0.033 0.028 0.034±0.006 0.015 6 Ekstrak kolom 17 67 40 49 52±0.014 0.139 7 Ekstrak kolom 18 80 95 03 93±0.012 0.162 8 Ekstrak kolom 37 06 52 80 46±0.037 0.135 9 Ekstrak kolom 38 0.157 0.173 39 0.190±0.043 0.104 Catatan: perhitungan konsentrasi protein menggunakan kurva standar hari ke-4 Contoh perhitungan: Rerata Ulan an Ulan an Ulan an kstrak kasar... kstrak kasar. onsentrasi protein ekstrak kasar sor an.. onsentrasi protein ekstrak kasar... onsentrasi protein ekstrak kasar. m m onsentrasi protein ekstrak kasar. m m