METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT Bahan utama yang digunakan yaitu umbi garut kultivar creole berumur 10 bulan yang diperoleh dari kebun percobaan Balai Penelitian Biologi dan Genetika Cimanggu Bogor. Selain itu digunakan pati resisten tipe 3 komersial (Novelose 330 Resistant Starch, kadar RS lebih dari 30%). Bahan-bahan untuk analisis yaitu HCl pekat, NaOH, H 2 SO 4 pekat, K 2 SO 4, larutan NaOH- Na 2 S 2 O 3, H 3 BO 3, indikator metil merah, heksana, etanol 78%, etanol 80%, etanol 95%, pereaksi Anthrone, asam asetat, KI, I 2, aseton, buffer fosfat ph 6, buffer fosfat ph 7, pati murni (E Merck), maltosa murni (E Merck), asam dimetilsalisilat (DNS), glukosa standar (E Merck), amilosa standar (Fluca), enzim termamyl (α-amilase Sigma A-3403), enzim pepsin (Sigma P-7000), enzim protease (Sigma P-3910), enzim amiloglukosidase (Sigma A-9913), enzim pankreatin (Sigma P-1750), enzim α-amilase (Fluca), kertas saring Whatman No.1 dan No.42, akuades, dan aluminium foil. Alat-alat yang digunakan dalam pembuatan pati yaitu parutan (rasper), vibrating screen, bak pengendap pati, oven pengering, otoklaf, dan loyang. Alat-alat yang digunakan untuk analisis yaitu tanur, oven, shaker waterbath, penangas air, perangkat Soxhlet, perangkat Kjeldahl, spektrofotometer Jenway, spektrofotometer UV-Vis Spectronic 20D+, sentrifuse, neraca analitik, hotplate, penyaring vakum, vorteks, ph-meter, desikator, crucible filtering glass dan alat-alat gelas lainnya. B. METODE Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap. Pada tahap pertama dilakukan ekstraksi pati garut sebagai bahan baku. Tahap selanjutnya adalah proses hidrolisis pati garut dengan asam, yang dilanjutkan dengan modifikasi pati secara fisik dengan siklus autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus. Kemudian dilakukan analisis daya cerna pati. Pati yang memiliki daya cerna terendah selanjutnya dianalisis sifat kimianya meliputi analisis proksimat (AOAC 1995), kadar pati total (Apriyantono et al. 1989), kadar amilosa dan 23

2 amilopektin (Apriyantono et al. 1989), kadar serat pangan (AOAC 1995), serta kadar pati resisten (AOAC 1995). Pati garut native (PG), pati terhidrolisis asam (PGH), pati termodifikasi fisik (PGF), dan Novelose 330 juga turut dianalisis sebagai pembanding. (Gambar 5). Umbi garut Ekstraksi pati Pati garut Perlakuan hidrolisis asam (HCl 1.1 N dan 2.2 N selama 2, 4, dan 6 jam) Perlakuan siklus autoclaving-cooling (3 siklus) Analisis daya cerna pati garut Pemilihan daya cerna pati terendah Pati termodifikasi hidrolisis-fisik terpilih ANALISIS SIFAT KIMIA PATI: Analisis proksimat Analisis pati total Analisis kadar amilosa dan amilopektin Analisis serat pangan Analisis pati resisten Pati native Pati modifikasi asam Pati termodifikasi fisik Novelose 330 Gambar 5. Gambaran umum proses penelitian. 24

3 a. Ekstraksi Pati Garut Ekstraksi pati garut dilakukan dengan mengacu metode yang dikembangkan Lingga et al. (1989) untuk mendapatkan optimasi pembuatan pati garut. Ekstraksi pati garut dilakukan dengan tahapan proses seperti pada Gambar 6. Umbi segar Dikupas dan dicuci Diparut dengan rasper Direndam selama 1 jam Diekstraksi dengan penambahan air (1 : 3,5) (b/v) 2x air Suspensi pati Ampas Diendapkan selama 12 jam Dikeringkan (50 o C, 6 jam) Digiling dengan blender kering Diayak (80 mesh) Pati Gambar 6. Ekstraksi pati garut. 25

4 b. Pembuatan Pati Termodifikasi dengan Hidrolisis Asam Proses hidrolisis pati garut dengan asam adalah tahap pendahuluan sebelum pembuatan pati resisten tipe 3 (tahap modifikasi fisik). Pembuatan pati modifikasi dengan hidrolisis asam (metode Lehmann (2003) yang dimodifikasi konsentrasi asam, rasio larutan asam dan pati, serta waktu inkubasi) dilakukan dengan enam perlakuan berbeda. Perlakuan tersebut adalah hidrolisis pati pada konsentrasi asam 1.1 dan 2.2 N dengan tiga variasi waktu hidrolisis (2, 4, dan 6 jam) seperti pada Gambar 7. Pati garut Ditambahkan HCl 1.1 N dan 2.2 N dengan rasio larutan asam : pati = 1:1 (b/v) Diinkubasi dalam inkubator bergoyang bersuhu 35 o C selama 2, 4, dan 6 jam Dinetralkan dengan NaOH hingga ph 6 Disentrifuse dengan kecepatan rotasi 2500 x g (3300 rpm) selama 10 menit Residu pati Supernatan Dicuci beberapa kali dengan air destilata Dikeringkan dengan oven suhu 50 o C Pati terhidrolisis Gambar 7. Proses hidrolisis pati garut dengan asam. 26

5 c. Pembuatan Pati Termodifikasi Secara Fisik Selanjutnya untuk masing-masing perlakuan, dilakukan pembuatan pati modifikasi secara fisik (metode Lehmann (2002) yang dimodifikasi pada proses pragelatinisasi (70 o C)), seperti pada Gambar 8. Pati garut (native dan terhidrolisis) Disuspensikan dalam air 20% (b/v) Dipanaskan pada suhu ± 70 o C sambil diaduk hingga homogen dan mengental Diautoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Didinginkan pada suhu ruang selama 1 jam 3 siklus Disimpan pada suhu 4 o C selama 24 jam Dikeringkan dengan oven bersuhu 50 o C Digiling Diayak 60 mesh Pati modifikasi secara fisik (3 siklus pemanasan-pendinginan) Gambar 8. Proses pembuatan pati resisten secara fisik. 27

6 C. PROSEDUR ANALISIS 1. Kadar Air, Metode Oven (AOAC, 1995) Kadar air diukur dengan metode oven biasa karena kandungan bahan volatil pada sampel rendah dan sampel tidak terdegradasi pada suhu 100 o C. Cawan aluminium kosong dikeringkan dalam oven suhu 105 o C selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 5 menit atau sampai tidak panas lagi. Cawan ditimbang dan dicatat beratnya. Lalu ditimbang sampel sebanyak 5 g di dalam cawan tersebut. Dikeringkan sampel dalam oven sampai beratnya konstan (perubahan berat tidak lebih dari g). Setelah itu cawan didinginkan di dalam desikator, ditimbang berat akhirnya, dan dihitung kadar airnya dengan persamaan berikut: Kadar air (% bb) = (x-y) x 100% (x-a) Keterangan : x = berat cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g) y = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (g) a = berat cawan kosong (g) 2. Kadar Abu, Metode Oven (AOAC, 1995) Cawan porselen dibakar dalam tanur selama 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator. Setelah cawan dingin, ditimbang. Kemudian sampel sebanyak 3-5 g ditimbang di dalam cawan lalu diabukan di dalam tanur hingga diperoleh abu berwarna putih dan beratnya tetap. Pengabuan dilakukan dalam 2 tahap yaitu tahap pertama pada suhu 400 o C lalu dilanjutkan pada suhu 550 o C, kemudian didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang. Perhitungan kadar abu dengan persamaan sebagai berikut: Kadar abu (% bb) = W 2 x 100% Keterangan : W 1 = berat sampel (g) W 2 = berat abu (g) W 1 28

7 3. Kadar Protein, Metode Kjehldahl (AOAC, 1995) Sampel sebanyak g dimasukkan ke dalam labu Kjedahl 100 ml, lalu ditambahkan 2 g K 2 SO 4, 40 mg HgO, dan 2.5 ml H 2 SO 4 pekat. Setelah itu, didestruksi selama 30 menit sampai cairan berwarna jernih dan dibiarkan sampai dingin. Selanjutnya ditambahkan air suling secukupnya hingga jernih kembali lalu dituang ke dalam alat destilasi dan dilakukan pembilasan secara kuantitatif. Sebanyak ml campuran NaOH 60% - Na 2 S 2 O 3 5% dituang ke dalam alat destilasi lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 100 ml yang berisi H 2 BO 3 3% dan indikator (campuran dua bagian metil merah 0.2% dalam alkohol dan satu bagian metilen biru 0.2% dalam alkohol), kemudian dititrasi dengan HCl 0.02 N yang telah distandardisasi. Larutan blanko juga dianalisis seperti halnya sampel. Kadar nitrogen dihitung berdasarkan rumus : % Nitrogen = (ml HCl ml Blanko) x N HCl x 14,007 x 100% mg contoh Kadar protein (% bb) = % Nitrogen x Faktor Konversi (FK) FK : 5.70 untuk tepung-tepungan (termasuk pati) 4. Kadar Lemak, Metode Soxhlet (AOAC, 1995) Labu lemak yang telah bebas dari lemak dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 o C kemudian ditimbang setelah didinginkan. Sampel sebanyak 5 g dibungkus dalam kertas saring kemudian ditutup kapas yang bebas lemak. Sampel dimasukkan ke dalam alat ekstraksi Soxhlet, kemudian kondensor dan labu dipasang pada ujung-ujungnya. Pelarut heksana dimasukkan ke dalam alat lalu sampel direfluks selama + 6 jam. Setelah itu pelarut didestilasi dan ditampung pada wadah lain. Labu lemak dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh berat tetap. Kemudian labu lemak dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan dan ditimbang. Kadar lemak dihitung dengan persamaan sebagai berikut: 29

8 Perhitungan : Kadar lemak (% bb) = W 2 x 100% W 1 Keterangan : W 1 = Berat sampel (g) W 2 = Berat lemak (g) 5. Kadar Karbohidrat By Difference (AOAC, 1995) Pengukuran kadar karbohidrat menggunakan metode by difference, dilakukan dengan cara sebagai berikut: Kadar karbohidrat (% bb) = 100% - (kadar protein + kadar lemak + kadar abu + kadar air) 6. Kadar Total Pati (Apriyantono et al. 1989) a. Hidrolisis Pati dengan Asam Sampel tepung sebanyak 0.5 g ditimbang dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 300 ml. Ditambahkan 50 ml etanol dan diaduk selama 1 jam. Suspensi tersebut disaring dengan kertas saring dan dicuci dengan air sampai volume filtrat 250 ml. Filtrat ini mengandung karbohidrat yang terlarut dan dibuang. Residu yang terdapat pada kertas saring dicuci 5 kali dengan 10 ml eter. Eter dibiarkan menguap dari residu, kemudian dicuci kembali dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut. Residu dipindahkan secara kuantitatif dari kertas saring ke erlenmeyer dengan cara pencucian dengan 200 ml air ditambah 20 ml larutan HCl 25%. Ditutup dengan pendingin balik dan dipanaskan di atas penangas air sampai mendidih selama 2.5 jam untuk menghidrolisis pati. Setelah didinginkan, larutan hasil hidrolisis dinetralkan dengan larutan NaOH 25% dan diencerkan sampai volume 500 ml dan dihomogenkan dan disaring untuk kemudian disebut sebagai larutan stok. b. Penentuan Total Gula dengan Metode Anthrone Disiapkan larutan pereaksi Anthrone 0.1% dengan melarutkan 0.1 g bubuk Anthrone dalam 100 ml asam sulfat pekat. Larutan dibuat 30

9 sesaat sebelum digunakan. Larutan stok sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup, lalu ditambahkan dengan 5 ml pereaksi Anthrone. Blanko dibuat dengan memipet 1 ml akuades ke dalam tabung bertutup, lalu ditambahkan dengan 5 ml pereaksi Anthrone. Untuk kurva standar, sampel diganti dengan larutan glukosa murni 0.2 mg/ml sebanyak 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 ml yang masing-masing kemudian ditepatkan menjadi 1 ml dengan air destilata. Tabung ditutup dan diinkubasi dalam penangas air pada suhu 100 o C selama 12 menit. Larutan segera didinginkan dengan air mengalir, lalu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm. Kadar total gula sampel ditentukan berdasarkan kurva standar glukosa yang diperoleh dari plot kadar glukosa dan absorbansi larutan glukosa murni. c. Penentuan Kadar Pati Sampel Nilai kadar total gula yang diperoleh dikalikan dengan faktor pengenceran. Kadar total pati dalam sampel diperoleh dengan mengalikan kadar total gula dengan faktor konversi Kadar Amilosa (Apriyantono et al. 1989) a. Pembuatan Kurva Standar Amilosa Sebanyak 40 mg amilosa murni dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml, ditambahkan 1 ml etanol 95% dan 9 ml larutan NaOH 1 N ke dalam labu. Labu takar lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 95 o C selama 10 menit. Setelah didinginkan, larutan gel pati ditambahkan air destilata sampai tanda tera sebagai larutan stok standar. Larutan stok dipipet 1, 2, 3, 4, dan 5 ml dan dipindahkan masing-masing ke dalam labu takar 100 ml. Ke dalam masing-masing labu takar tersebut kemudian ditambahkan 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 ml larutan asetat 1 N. Ditambahkan 2 ml larutan iod (0.2 g I 2 dan 2 g KI dilarutkan dalam 100 ml air destilata) ke dalam setiap labu, lalu ditera dengan air destilata. Larutan dibiarkan selama 20 menit, lalu diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang 31

10 gelombang 625 nm. Kurva standar merupakan hubungan antara kadar amilosa dan absorbansi. b. Analisis sampel Sebanyak 100 mg sampel pati dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Kemudian ditambahkan etanol 95% dan 9 ml larutan NaOH 1 N ke dalam labu takar. Labu takar kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 95 o C selama 10 menit. Setelah didinginkan, larutan gel pati ditambahkan air destilata sampai tanda tera dan dihomogenkan. Dipipet 5 ml larutan gel pati dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml. Ke dalam labu takar tersebut, kemudian ditambahkan 1.0 ml larutan asam asetat 1 N dan 2 ml larutan iod, lalu ditera dengan air destilata. Larutan dibiarkan selama 20 menit, lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm. Blanko dibuat dengan memipet 5 ml akuades dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml. Ke dalam labu takar tersebut, kemudian ditambahkan 1.0 ml larutan asam asetat 1 N dan 2 ml larutan iod, lalu ditera dengan air destilata. Larutan dibiarkan selama 20 menit, lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm. Kadar amilosa ditentukan berdasarkan persamaan kurva standar yang diperoleh. 8. Kadar Serat Pangan, Metode Enzimatis (AOAC, 1995) Sampel kering diekstrak lemaknya dengan pelarut petroleum eter pada suhu kamar selama 15 menit. Sejumlah 1 g sampel bebas lemak (w) dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 25 ml 0.1 M buffer fosfat ph 6 dan dibuat suspensi. Lalu ditambahkan 0.1 ml termamyl cair, ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi pada suhu 100 o C selama 15 menit, diangkat dan didinginkan, kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan ph diatur menjadi 1.5 dengan menambahkan HCl 4 M. Selanjutnya ditambahkan 100 mg pepsin, ditutup dan diinkubasi pada suhu 40 o C dan diagitasi selama 60 menit. Kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan ph diatur menjadi 6.8, lalu ditambahkan 100 mg pankreatin, ditutup dan diinkubasi pada suhu 40 o C selama 60 menit sambil diagitasi, dan terakhir 32

11 ph diatur dengan HCl menjadi 4.5. Selanjutnya disaring dengan kertas saring Whatman no 42 yang telah ditimbang bobotnya (bobot diketahui), lalu dicuci dua kali dengan akuades. Residu (Serat Makanan Tidak Larut / Insoluble Dietary Fiber / IDF) Sampel dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 95% dan 2 x 10 ml aseton, lalu dikeringkan pada suhu 105 o C sampai berat tetap (sekitar 12 jam) dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (D1). Kemudian diabukan dalam tanur 500 o C selama minimal 5 jam dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (I1). Filtrat (Serat Makanan Larut / Soluble Dietary Fiber / SDF) Volume filtrat diatur dengan akuades sampai dengan 100 ml, lalu ditambah dengan 400 ml etanol 95% hangat (60 o C), diendapkan 1 jam. Lalu disaring dengan kertas Whatman no. 42 dan dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 78%, 2 x 10 ml aseton, lalu dikeringkan pada suhu 105 o C hingga berat konstan, didinginkan dalam desikator dan ditimbang (D2). Selanjutnya diabukan dalam tanur 500 o C selama minimal 5 jam. Didinginkan dalam desikator dan ditimbang (I2). Serat Makanan Total / Total Dietary Fiber / TDF dan Blanko Serat makanan total (TDF) ditentukan dengan menjumlahkan nilai SDF dan IDF. Nilai blanko untuk IDF (B1) dan SDF (B2) diperoleh dengan cara yang sama namun tanpa menggunakan sampel. Kadar serat pangan dihitung dengan persamaan sebagai berikut: Nilai IDF (% bb) = ((D1 I1 B1) / w) x 100% Nilai SDF (% bb) = ((D2 I2 B2) / w) x 100% Nilai TDF (% bb) = Nilai IDF + Nilai SDF 9. Kadar Pati Resisten, Metode Enzimatik Gravimetri (AOAC, 1995) Sebanyak 0.5 g sampel pati dilarutkan dalam 25 ml buffer fosfat 0.08 M (ph 6.0) dalam gelas piala 250 ml, lalu ditutup dengan aluminium foil. Kemudian ditambahkan 0.2 ml enzim termamyl cair dan campuran diinkubasi dalam penangas air suhu 95 o C selama 30 menit, dengan diaduk 33

12 lembut selama 5 menit sekali. Setelah didinginkan sampai suhu ruang, ph larutan diatur hingga 4.5 dengan 5 ml larutan HCl N dan ditambahkan 0.5 ml enzim amiloglukosidase (10 mg / 1 ml buffer fosfat), lalu diinkubasi dalam penangas air bergoyang dengan suhu 60 o C selama 30 menit. Setelah didinginkan sampai suhu ruang, ph campuran diatur menjadi 7.5 dengan menambahkan 5 ml larutan NaOH N, lalu ditambahkan 0.05 ml enzim protease (40 mg protease / 50 ml buffer fosfat), dan campuran diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 60 o C selama 30 menit. Setelah inkubasi selesai, larutan disentrifuse 2000 rpm selama 20 menit. Setelah itu diambil bagian peletnya. Kemudian pelet dicuci dua kali dengan etanol 80% dan air destilata. Residu tersebut dikeringkan dalam oven bersuhu 40 o C. Kadar pati resisten dihitung dengan persamaan sebagai berikut: Kadar RS (% bb) = bobot residu x 100% bobot sampel 10. Daya Cerna Pati (modifikasi Muchtadi et al., 1992) Metode ini mengalami modifikasi dari metode aslinya, yaitu modifikasi terhadap blanko sampel. Metode Muchtadi et al. (1992) tidak turut menganalisis blanko sampel. Pengukuran terhadap blanko perlu dilakukan untuk mengetahui kandungan maltosa awal dari sampel (bukan kandungan maltosa yang terbentuk saat analisis). Sebanyak 1 g sampel dimasukkan dalam erlenmeyer 250 ml, lalu ditambahkan dengan 100 ml air destilata. Wadah ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan dalam waterbath hingga mencapai suhu 90 o C sambil diaduk. Setelah suhu 90 o C tercapai, sampel segera diangkat dan didinginkan. Dari larutan tersebut dipipet sebanyak 2 ml ke dalam tabung reaksi bertutup, lalu ditambahkan 3 ml air destilat dan 5 ml buffer fosfat ph 7. Masing-masing sampel dibuat dua kali, salah satunya sebagai blanko. Tabung ditutup dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 15 menit. Larutan diangkat dan ditambahkan 5 ml larutan enzim α-amilase (1 mg/ml dalam 34

13 buffer fosfat ph 7) untuk sampel dan 5 ml buffer fosfat ph 7 untuk blanko sampel. Inkubasi dilanjutkan selama 30 menit. Sebanyak 1 ml campuran hasil inkubasi dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup berisi 2 ml larutan DNS (asam dinitrosalisilat). Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 12 menit, lalu segera didinginkan dengan air mengalir. Ke dalam larutan ditambahkan 10 ml air destilata dan divorteks. Kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm. Kurva standar diperoleh dari perlakuan DNS terhadap 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 ml larutan maltosa murni 0.5 mg/ml yang ditepatkan menjadi 1 ml dengan air destilata. Daya cerna pati dihitung dengan persamaan sebagai berikut: Daya cerna pati = A a x 100% B b dimana : A = kadar maltosa sampel a = kadar maltosa blanko sampel B = kadar maltosa pati murni b = kadar maltosa blanko pati murni 35