FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI

Transkripsi

1 Halaman : 1 dari 5 ISOLASI TOTAL DNA HEWAN DENGAN KIT EKSTRAKSI DNA 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel jaringan hewan, dapat dari insang, otot, darah atau jaringan hewan yang lain 2. ACUAN NORMATIF Karp, A., S. Kresovich, K. V. Bhat, W. G. Ayad and T. Hodgkin Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. International Plant genetic Resources Institute. Sambrook, J., E. F. Fritch and T. Maniatis Molecular cloning : a laboratory manual. Volume 1-3. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor. 3. ISTILAH DAN DEFINISI DNA (Deoxyribosa Nucleic Acid) adalah asam nukleat yang berada di dalam dan atau di luar inti sel (nukleus) yang dimiliki oleh semua organisme hidup (virus pengecualian) serta berperan sebagai materi genetik. Materi genetik adalah suatu faktor pembawa sifat organisme yaitu gen. Gen adalah segmen / sekuens spesifik dari DNA yang membawa sifat genetik, diekspresikan pada fenotip dan diwariskan kepada keturunanya Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di inti sel.

2 Halaman : 2 dari 5 4. CARA UJI 4.1. Prinsip Prinsip kerja isolasi DNA adalah preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan protease) dan RNA (dengan RNAse). Hasil dari ekstraksi DNA diperlukan uji kualitas DNA, yang ditentukan oleh kemurnian DNA, panjang DNA, kemampuan dipotong oleh enzim, tidak mengalami modifikasi selama proses isolasi berlangsung Bahan Kit ekstraksi jaringan hewan (gsync TM DNA Extraction Kit Geneaid), larutan buffer TE, larutan TBE 10x, larutan kloroform, akuades dan larutan ethanol Peralatan Timbangan, mortar, sentrifugasi, mikrotube, botol flakon, pipet eppendorf, pipet tip, pipet ukur, pro pipet, tabung reaksi, oven, erlenmeyer, gelas beker, elektroforesis, spektrofotometer Qubit, pendingin Persiapan pengujian Sampel jaringan hewan yang akan diuji ditimbang dengan berat 50 mg kemudian dibekukan dengan nitrogen cair atau dimasukkan dalam freezer terlebih dahulu 4.5. Prosedur pengujian Sampel jaringan hewan diambil mg kemudian dimasukkan dalam microtube 1,5 ml dan dipotong-potong menggunakan gunting bedah hingga menjadi potongan kecilkecil. Selanjutnya, ditambahkan 200 µl GST buffer dan 20 µl Proteinase K, lalu divorteks. Suspensi selanjutnya diinkubasi dalam oven pada suhu 60ºC sampai benar-

3 Halaman : 3 dari 5 benar larut dan lisat menjadi jernih. Bersama dengan inkubasi sampel ini, sebanyak 200 µl Elution buffer/ sampel turut diinkubasi dalam micotube 1,5 ml terpisah. Tahap selanjutnya adalah pelisisan sel. Suspensi dalam microtube 1,5 ml disentifugasi dengan kecepatan g selama 4 menit. Supernatan diambil kemudian dimasukkan ke dalam microtube 1,5 ml yang baru. Selanjutnya ditambahkan 200 µl GSB buffer, lalu digojoggojog selama 10 detik. Tahap berikutnya adalah pengikatan DNA. Pada tahap ini, sebanyak 200 µl ethanol absolut dingin ditambahkan lalu segera digojog-gojog selama 10 detik. Selanjutnya, seluruh suspensi diambil dan dimasukkan ke dalam GD collumn yang sudah terpasang pada collection tube. Kemudian, suspensi disentrifugasi dengan kecepatan g selama 2 menit. Filtrat yang tertampung dalam collection tube dibuang lalu collection tube dikeringkan untuk dipasang kembali ke GD collumn. Tahap selanjutnya adalah pencucian, sebanyak 400 µl W1 buffer ditambahkan lalu disentrifugasi dengan kecepatan g selama 1 menit. Filtrat yang tertampung dalam collection tube dibuang lalu collection tube dikeringkan untuk dipasang kembali ke GD collumn. Selanjutnya, sebanyak 600 µl Wash buffer ditambahkan lalu disentrifugasi dengan kecepatan g selama 1 menit. Filtrat yang tertampung dalam collection tube dibuang lalu collection tube dikeringkan untuk dipasang kembali ke GD collumn. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan g selama 6 menit. Colection tube dibuang dan diganti dengan collection tube yang baru. Tahap terakhir dari isolasi DNA genom adalah elusi. Sebanyak 100 µl Elution buffer yang telah dipanaskan di dalam oven ditambahkan kemudian didiamkan selama 3 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan g selama 1 menit. Langkah elusi yang sama kemudian diulang, sehingga total elusi dilakukan sebanyak dua kali. Filtrat yang tertampung dalam collection tube selanjutnya dipindahkan ke dalam microtube 1,5 ml yang baru, lalu disimpan dalam mesin pendingin bersuhu -20ºC untuk jangka penyimpanan yang lama.

4 Halaman : 4 dari Perhitungan Perhitungan data ukuran DNA dilakukan melalui analisis kualitatif dan kuantitatif DNA. Analisis data secara kualitatif untuk memperoleh konsentrasi serta kemurnian hasil ektraksi DNA dapat menggunakan spektrofotometer Qubit kemudian dihitung nilai konsentrasi dengan persamaan [DNA]=OD260x50x FC Keterangan : [DNA]: konsentrasi DNA (μl/ml) OD 260: nilai absorbansi pada panjang gelombang 260nm FC: faktor pengenceran Sedangkan umtuk menghitung nilai kemurnian hasil ekstraksi ditentukan dengan persamaan DNA= OD 260 OD 280 Keterangan : DNA : kemurnian DNA OD 260: nilai absorbansi pada panjang gelombang 260nm OD 280: nilai absorbansi pada panjang gelombang 280nm. Analisis data kualitatif menggunakan metode elektroforesis dengan pengamatan pita atau band dilakukan dibawah sinar UV. Uji kualitas DNA dilakukan dengan mengambil sebanyak 5 µl sampel dicampurkan dengan 2µL loading buffer (30% gliserol; 0,2% bromfenol biru; 10mM tris-hcl ph 8,0; 0,1 mm EDTA), kemudian dimasukkan ke dalam 0,8% gel agarosa (0,2µg ml -1 SYBR SAFE) dan dielekroforesis pada 50V selama 40 menit dalam TBE buffer 1X. Hasil positif yang didapatkan saat pengamatan di bawah sinar UV yaitu tervisualisasinya pita total DNA hasil isolasi. Cara analisis hasil pita yang didapatkan adalah benar pita total DNA yaitu dengan melihat ukuran pita/band yang tervisualisasi dalam satuan base pair (bp) dan kemudian dicocokkan dengan marker.

5 Halaman : 5 dari 5 5. PENGENDALIAN MUTU 5.1. Pengendalian mutu hasil isolasi DNA Setiap tahapan isolasi disesuaikan dengan protokol isolasi DNA dengan adanya modifikasi pada saat optimasi metode sebelumnya sehingga didapatkan pelet DNA yang berwarna putih bening didasar tube ekstraksi 5.2. Pengendalian mutu hasil DNA Ukuran DNA yang dapat dipisahkan oleh gel agarosa dengan konstentrasi 0,8% berkisar dari 10kb 0,7kb (Beckmann & Osborn, 1992). Konsentrasi dan kemurnian DNA diuji secara kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometri dengan sinar UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pita ganda DNA dapat menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm sedangkan kontaminan seperti protein atau fenol akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang 280 nm. Oleh sebab itu, nilai kemurnian DNA dapat diukur dengan absorbansi Å260/Å280 dengan hasil kemurnian pada kisaran 1,7-1,8. Tingkat konsentrasi DNA diketahui dari nilai OD sampel dengan formula [DNA] (mg/ml) = O.D.260 x 50 x faktor pengenceran (Sambrook and Russel, 1989).