PENGUJIAN IN VITRO BEBERAPA VARIETAS KEDELAI (Glycin max L. Mrr) TOLERAN KEKERINGAN MENGGUNAKAN Polythyln Glikol (PEG) 6000 PADA MEDIA PADAT DAN CAIR Evika Sandi Savitri Staf Pngajar Jurusan Biologi, Fakultas Sains & Tknologi, UIN Maliki Malang ABSTRAK Kondisi strs kkringan scara in vitro dapat disimulasi dngan mnurunkan potnsial air mdia, yaitu dngan pnambahan PEG (politilna glikol). Pnapisan scara in vitro dilakukan dngan mmanfaatkan komponn pnylksi yang dapat mnsimulasikan ckaman lingkungan. Pada pnapisan in vitro, pnambahan komponn slksi harus dipilih, shingga pada konsntrasi yang tpat dapat mnglompokkan vritas kdlai yang pka, modrat dan tolran. Salah satu rspon tanaman trhadap ckaman kkringan yaitu trjadi prkcambahan yang abnormal. Tujuan pnlitian ini ialah untuk mngtahui rspon prkcambahan varitas kdlai yang ditanam pada mdia in vitro dngan pnambahan PEG 6000 dan untuk mngtahui konsntrasi PEG yang mampu mnylksi varitas kdlai pka dan tolran kkringan pada mdia padat dan mdia cair. Pnlitian ini trdiri dari 2 tahap yang prtama pngujian pada mdia padat, mnggunakan Rancangan Acak Lngkap (RAL) 2 faktor. Faktor prtama adalah konsntrasi PEG 6000 yang trdiri dari 4 taraf prlakuan (0 gr/l; 20 gr/l; 40 gr/l dan 60 r/l), dan faktor kdua adalah varitas kdlai (Wilis, Tanggamus, Grobogan, Argomulyo, Kaba dan Pandrman). Pnlitian ini mnggunakan 24 kombinasi prlakuan dngan 3 ulangan. Pnlitian kdua pngujian pada mdia cair, mnggunakan Rancangan Acak Lngkap (RAL) 2 faktor. Faktor prtama adalah varitas kdlai yang trdiri dari 3 taraf yaitu: Wilis, Tanggamus dan Grobogan. Faktor kdua adalah konsntrasi PEG 6000 yang trdiri dari 4 taraf prlakuan yaitu: 0%, 5%, 10% dan 15%, yang masing-masing stara dngan potnsial air 0; -0,13; -0,19; -0,41 MPa. Pada pnlitian mdia padat, brdasarkan hasil indks snsivitas kkringan, varitas Grobogan, Argomulyo dan Kaba mnunjukkan rspon pka kkringan, sdangkan varitas Wilis dan Argomulyo mnunjukkan rspon tolran kkringan dan varitas Tanggamus mnunjukkan rspon mdium tolran. Konsntrasi PEG 60 gr/l mampu mnsimulasi kkringan pada mdia padat. Pada mdia cair, brdasarkan indks snsivitas mnunjukkan varitas Tanggamus dan Wilis brsifat mdium tolran dan Grobogan pka trhadap kkringan. Konsntrasi PEG 5% pada mdia MS cair in vitro mampu mnsimulasikan ckaman kkringan. Kata kunci : Pngujian in vitro, varitas kdlai, mdia padat, mdia cair PENDAHULUAN Kdlai mrupakan salah satu kbutuhan pokok bagi masyarakat misalnya sbagai bahan baku makanan atau sbagai bahan susu kdlai. Kbutuhan kdlai mningkat stiap tahunnya shingga mnimbulkan tantangan yang brat bagi pmbangunan prtanian kdlai. Tantangan ini smakin brat karna di satu sisi laju prmintaan trus mningkat, akan ttapi disisi lain muncul bbrapa prmasalahan diantaranya ktrbatasan lahan yang smpit shingga dilakukan kstnsifikasi pada lahan marjinal sprti lahan masam, lahan kring atau lahan yang ksuburannya rndah. Pnggunaan PEG sbagai agn pnylksi ini tlah banyak digunakan untuk pnapisan kkringan pada kdlai (Hamim, 1996 dan Widortno, 2004), pada kacang tanah (Rahayu, 2004), pada kalus nilam (Sudjahjo, 2007) dan skrining in-vitro pada tomat (Kulkarni, 2007). Dalam Kulkarni (2007), pnggunaan 4 konsntrasi PEG antara 0, 20, 40 dan 60 gr/l ini, yang mampu mnapis tanaman tomat trhadap kkringan brkisar 60 gr/l. Mnurut Sirait (2001), pnapisan scara in vitro untuk sifat ktahanan trhadap ckaman abiotik mmpunyai kunggulan komparatif, antara lain waktu slksi lbih singkat, tidak mmbutuhkan ruang yang luas, mudah dikontrol dan tidak dibatasi olh musim. Mnurut Kosmiatin (2005), kdlai yang ditanam dalam mdia dngan pnambahan PEG dapat digunakan sbagai indikator kmampuan snyawa PEG untuk mnstimulasikan ckaman kkringan dalam mdia in-vitro. Pngujian pada mdia yang brbda akan mnunjukkan pnglompokkan yang brbda. Brdasarkan latar 9
Evika Sandi Savitri blakang di atas maka prlu dilakukan pngujian trhadap bbrapa varitas kdlai pada fas prkcambahan untuk mnglompokkan varitas yang tolran dan pka trhadap ckaman kkringan mnggunakan PEG 6000 pada mdia padat dan mdia cair. Salah satu rspon tanaman trhadap ckaman kkringan yaitu trjadi prkcambahan yang abnormal. Empat gnotip kdlai yang di uji mnunjukkan ada yang brsifat pka, modrat dan tolran. Pnambahan PEG 10% k dalam sluruh mdia pada ksplan mbrio masak mmprlihatkan prsntas prkcambahn yang ssuai dngan tingkat tolransinya trhadap kkringan. Pada klompok pka, rata-rata prkcambahan hanya 25%, modrat 35% dan tolran 60%. Tujuan pnlitian ini ialah untuk mngtahui rspon prkcambahan varitas kdlai yang ditanam pada mdia in vitro dngan pnambahan PEG 6000 dan untuk mngtahui konsntrasi PEG yang mampu mnylksi varitas kdlai pka dan tolran kkringan pada mdia padat dan mdia cair. METODE PENELITIAN Pnlitian I Pnlitian ini trmasuk pnlitian ksprimntal mnggunakan Rancangan Acak Lngkap (RAL) 2 faktor. Faktor prtama adalah konsntrasi PEG 6000 yang trdiri dari 4 taraf prlakuan (0 gr/l; 20 gr/l; 40 gr/l dan 60 r/l), dan faktor kdua adalah varitas kdlai (Wilis, Tanggamus, Grobogan, Argomulyo, Kaba dan Pandrman). Pnlitian ini mnggunakan 24 kombinasi prlakuan dngan 3 ulangan. Dngan dmikian dalam pnlitian scara ksluruhan trdapat 72 kombinasi prlakuan pr-unit prcobaan. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam pnlitian ini mliputi: botol kultur, pinst, rlnmyr, cawan ptri, labu takar, glas ukur, bakr glass, pipt, laminar Air flow, rak kultur, autoklaf, ph mtr, bunsn spiritus, timbangan analitik, hot plat, pnymprot alkohol (hand sprayr), lmari pndingin, kamra, thrmomtr; krtas labl, krtas tissu, kork, aluminium foil, plastic gulung, kart glang dan plastik cling wrap. Bahan yang digunakan dalam pnlitian mliputi kdlai (Wilis, Tanggamus, Grobogan, Argomulyo, Kaba dan Pandrman), PEG (polythylna glikol) 6000, bahan dasar MS (Murashig dan Skoog) (larutan stok makronutrin mdium MS; larutan stok mikronutrin mdium MS, larutan stok sumbr bsi, aquads stril, agar bacto, larutan stok organik yaitu sukrosa, vitamin, asam amino), alkohol 70%, spiritus, tpol, dtrgn, dan bayclin 20%. Bahan buffr ph: NaOH 0,1 N danhcl 0,1 N. PROSEDUR PENELITIAN Strilisasi Alat Alat-alat glas dan disscting st (scalpl, pinst, gunting) di cuci dngan dtrgn, kmudian dirndam slama ± 1 24 jam dalam larutan typol.stlah trndam slama 1 hari, alat-alat trsbut dicuci dngan air mngalir kmudian di autoclav. Alat dari bahan glas di tutup plastic, sdangkan alat-alat dari bahan logam dan cawan ptri dibungkus dngan krtas payung. Kmudian smua alat trsbut di strilisasi dalam autoklaf pada tmpratur 121 0 C, 17,5 psi slama 60 mnit. Pmbuatan mdia Mdia MS (Murashig-Skoog) dibuat larutan stok trlbih dahulu. Mdium trsbut ditambahkan agar13,5 g (tidak dibuat stok). Slanjutnya mdium dipanaskan sampai mndidih dan diaduk.stlah mdia tlah homogn dan mndidih. Bahan PEG ditimbang ssuai takaran; 0, 20, 40 dan 60 gr/l. mdia trsbut dituangkan k dalam bakr glass yang brisi PEG (ssuai konsntrasi yang dibutuhkan),kmudian di homognkan dan di masukkan kdalam botol kultur sbanyak 20 ml. Stiap botol ditutup dngan plastik gulung. Stlah mdia yang digunakan tlah siap, maka mdia trsbut distrilkan dngan di autoklaf pada suhu 12 0 C dan tkanan 1,5 atm slama 15 mnit. Prsiapan dan Strilisasi Eksplan Strilisasi ksplan biji dilakukan 2 tahap, yaitu strilsasi tahap luar dan tahap dalam LAF. Strilisasi tahap luar yaitu biji diambil, kmudian dicuci dngan dtrgn slama 10 mnit, untuk pmbilasan dilakukan sampai busa dtrgn hilang dan pmbilasan trkhir dilakukan dngan dicuci air mngalir. Biji dirndam klorok/bayclin 20% slama 20 mnit Prhitungan Indks Snsitivitas Prhitungan indks snsitivitas kkringan (S), untuk masing-masing pubah dapat digunakan rumus dari Fischr dan Maurr (1978), yaitu : S = 1-Y/Yp 1-X/Xp Ktrangan : Y = Nilai rata-rata pngamatan untuk satu varitas trtntu pada kondisi strss PEG; Yp= Nilai rata-rata pngamatan untuk satu varitas trtntu pada kondisi non strss PEG (kontrol); X = Nilai rata-rata pngamatan untuk sluruh varitas trtntu pada kondisi strss PEG; Xp = Nilai rata-rata pngamatan untuk sluruh varitas trtntu pada kondisi non strss PEG (kontrol) Rumus di atas mmiliki kritria trhadap kkringan sprti brikut dari satu varitas kcil sbagai tolran trhadap strss kkringan apabila 10
mmpunyai nilai S<0,5 dan mdium jika 0,5< S < 1 dan pka jika S> 1 Pnlitian II Pnlitian ini trmasuk pnlitian ksprimntal mnggunakan Rancangan Acak Lngkap (RAL) 2 faktor. Faktor prtama adalah varitas kdlai yang trdiri dari 3 taraf yaitu: Wilis, Tanggamus dan Grobogan. Faktor kdua adalah konsntrasi PEG 6000 yang trdiri dari 4 taraf prlakuan yaitu: 0%, 5%, 10% dan 15% (Lampiran 1), yang masing-masing stara dngan potnsial air 0; -0,13; -0,19; -0,41. Pada pnlitian Suwarsi (2005), konsntrasi PEG 10% dan 15% mmpunyai dampak krusakan tunas kacang tanah, adapun pnlitian Kosmiatin (2005), PEG dngan konsntari 15% dan 10% mampu mrspon prtumbuhan ksplan polong kdlai. Pnlitian ini mnggunakan 12 kombinasi prlakuan dngan 4 ulangan. Dngan dmikian dalam pnlitian scara ksluruhan trdapat 48 kombinasi prlakuan prunit prcobaan Prosdur Pnlitian Pmbuatan mdia Mdia MS (Murashig-Skoog) dilakukan dngan pmbuatan larutan stok trlbih dahulu. Pmbuatan mdium padat mnggunakan agar dan mdia cair tidak mnggunakan agar. Mdium dipanaskan sampai mndidih dan diaduk, kmudian diangkat. Mdia padat tidak ditambah dngan PEG. Mdia cair ditambahkan PEG ssuai dngan prlakuan konsntarasi. Kmudian mdium diisikan k dalam botol kultur sbanyak 20 ml. Pada mdia cair diltakkan busa yang tlah dilubangi (Suwarsi, 2005). Mdia masing- masing ditutup dngan plastik tahan panas dan diikat dngan kart kmudian mdia distrilkan. Pnanaman Eksplan Epikotil Epikotil diambil dari bnih yang tlah dikcambahkan pada mdia padat tanpa PEG. Epikotil di potong spanjang 2 cm. Epikotil ditanam pada mdia cair mngandung PEG yang sudah disiapkan. Epikotil kdlai ditanam pada tiga buah lubang dngan diamtr 2 mm pada bagian busa. Epikotil diinkubasi dalam ruang kultur pada suhu 25 0 C dan klmbaban ruang 70% slama 1 bulan (Suwarsi, 2005). HASIL DAN PEMBAHASAN PENELITIAN I Prsntas Prkcambahan Bbrapa Varitas Kdlai Pada 14 dan 28 HST Brdasarkan hasil pngamatan pada 14 HST, diktahui bahwa ada pngaruh antara varitas dan pmbrian PEG pada paramtr prsntas prkcambahan. Adapun data rata-rata prkcambahan kdlai dari bbrapa varitas slama 14 HST dapat dilihat pada Gambar 1. P r s n t a s % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 PEG 0 gr/l PEG 20 gr/l PEG 40 gr/l PEG 60 gr/l Gambar 1. Pngaruh pmbrian PEG trhadap prsntas prkcambahan (%) pada bbrapa varitas kdlai slama 14 HST Brdasarkan hasil pngamatan yang dilakukan slama 14 hari, prsntas prkcambahan varitas Wilis, Pandrman dan Kaba brlangsung baik, bahkan pada konsntrasi 11
rata-rata (cm) Evika Sandi Savitri 60gr/l masih mampu brkcambah dngan mnujukkan prsntas prkcambahan yang lbih tinggi dibandingkan dngan prsntas prkcambahan varitas Grobogan, tanggamus dan Argomulyo (gambar 1). Prlakuan dngan pnambahan PEG pada mdia tlah mampu mnurunkan kmampuan prkcambahan pada smua varitas yang digunakan. Konsntrasi 60 gr/l PEG ini mampu mnylksi varitas pada pngamatan prsntas prkcambahan, shingga dapat diktahui bahwa pada mdia dngan pnambahan PEG 60gr/l ini dapat digunakan sbagai acuan rkomndasi untuk digunakan sbagai simulasi ckaman kkringan buatan pada mdia tumbuh. Indks Snsivitas Kkringan Bbrapa Varitas Kdlai Pada Mdia MS Padat mnggunakan PEG (Politilna glikol) 6000 Hasil prkcambahan pada pnlitian ini juga dapat dihitung indks snsivitas kkringan dngan tujuan untuk mnglompokkan varitas kdlai k dalam klompok tolran, mdium dan pka kkringan. Pada umur kcambah 14 HST varitas Pandrman dapat diklompokkan k dalam sifat tolran kkringan dngan nilai indks snsivitas kkringan S<0.5 dan varitas Grobogan, 4 Rata-rata Prtambahan Tinggi Tunas Tanggamus, Kaba dan Argomulyo diklompokkan k dalam klompok pka kkringan dngan nilai S>1 sdangkan nilai S untuk Wilis yaitu 0.5<S<1 yang brarti bahwa varitas ini trmasuk k dalam klompok mdium tolran. Sdangkan pada umur kcambah 28 HST nilai indks snsivitas sluruh varitas kdlai tidak brbda dngan nilai indks umur kcambah 14 HST, kcuali untuk nilai indks snsivitas pada varitas Tanggamus. Varitas Tanggamus ini mmiliki nilai indks snsivitas 0,5<S<1 yang brarti varitas ini dapat diklompokkan dalam mdium tolran. PENELITIAN II Pngaruh Politilna glikol (PEG) 6000 Pada Mdia MS Cair Trhadap Prtambahan Tinggi Tunas Bbrapa Eksplan Epikotil Varitas Kdlai Hasil pnlitian mnunjukkan rspon pikotil bbrapa varitas kdlai trhadap ckaman kkringan dngan mdia PEG 6000 pada konsntasi (5%, 10%, 15%) trhadap paramtr prtambahan tinggi tunas, mnunjukkan rata-rata prtamabahan tinggi tunas (cm) yang brbda. 3 2 Wilis 1 Tanggamus Grobogan 0 0% 5% 10% 15% Gambar 2. Rata-Rata Prtambahan Tinggi Tunas (cm) Pngamatan 4MST PEG Gambar 2; Indks Snsivitas Kkringan Eksplan Epikotil Bbrapa Varitas Kdlai Pada Mdia MS Cair Politilna glikol (PEG) 6000 Hasil dari prhitungan indks snsivitas tingkat tolransi tanaman kdlai trhadap ckaman kkringan dapat dilakukan brdasarkan indks snsivitas kkringan pada pubah prosntas prtumbuhan ksplan. Swilis = 1 x = xp 1 72,21 91,67 1 52,77 = 1 0,79 1 0,593 = 0,21 = 0,52 = Mdium 0,407 1 61,1 STanggamus = 1 x 91,67 = xp 1 52,77 = 1 0,67 1 0,593 = 0,33 0,407 = 0,81 = Mdium 1 25 Sgrobogan = 1 x 83,3 = xp 1 52,77 = 1 0,30 1 0,593 = 0,7 = 1,7 = Pka 0,407 12
Brdasarkan indks snsivitas trhadap ckaman mnggunakan prsntas prtumbuhan ksplan pr tanaman disimpulkan bahwa kdlai varitas Grobogan trgolong pka trhadap ckaman kkringan. Hasil indks snsivitas Grobogan sjalan dngan prhitungan paramtr tinggi tunas, jumlah daun normal, jumlah daun layu dan prsntas prtumbuhan pikotil yang mnunjukkan varitas trsbut pka trhadap kkringan. Pada varitas Wilis dan Tanggamus brdasarkan hasil indks snsifitas trhadap ckaman mnggunakan prsntas prtumbuhan ksplan pr tanaman disimpulkan mdium. Pningkatan tinggi tunas dan jumlah daun normal dalam kondisi lingkungan ckaman kkringan dapat digunakan sbagai indikator tolransi ckaman kkringan pada kdlai. Dalam dskripsi varitas Tanggamus mrupakan varitas yang tolran trhadap kkringan bgitu juga sjalan dngan pnlitian (Azizah, 2010), prtumbuhan kalus pada mdia PEG pada prhitungan indks snsivitas pada pubah brat kalus mnyatakan Tanggamus mrupakan varitas yang tolran trhadap ckaman kkringan. Pngujian kalus sama dngan pngujian gnotip yang dimiliki pada varitas trsbut ttapi pada pnlitian ini yang dilakukan dngan pngujian pikotil bnih pada prhitungan indks snsivitas, varitas Tanggamus masuk katgori masuk katgori mdium kmungkinan disbabkan kondisis vaibilitas bnih awal yang kurang optimal, pada pnlitian Azizah (2010), uji in vitro dngan mdia padat pada prhitungan indks snsivitas pada pubah prsntas prkcambahan 28HST, Tanggamus masuk dalam katgori mdium. Hasil pnlitian (Hanum, 2007) Wilis mrupakan varitas yang adaptif trhadap tolran ckaman kkringan, yang ditunjukkan bahwa kmampuan gnotip pada prlakuan ckaman kkringan hasil mnunjukkan pnurunan bobot kring akar paling rndah. mnsimulasikan ckaman kkringan pada paramtr tinggi tunas, jumlah daun normal, jumlah daun layu, prsntas prtumbuhan, skor krusakan ksplan dan indks snsivitas. DAFTAR PUSTAKA Hanum, C. dkk. 2007. Prtumbuhan Akar Kdlai pada Ckaman Alumunium, Kkrinagan dan Ckaman Ganda Alumunium dan Kkringan. Agritop (26) 1: 13-18 Kosmiatin, M, S. Hutami, A. Husni, dan I. Mariska. 2005. Pnapisan Cpat Tolransi Kdlai Trhadap Kkringan scara In Vitro.Pnlitian Prtanian Tanaman Pangan: Vol. 24 No.3. Michl, B.E and M.R Kaufman. 1973. Th Osmotic Potntial of PEG 6000. Plant Physiol. Rahayu. 2004. Strs olh PEG dalam Mdia In Vitro dan Pnapisan tolransi Kacang Tanah trhadap Kkringan. Prosiding Simposium PERIPI: 5-7 Agustus. Rahayu. 2005. Politilna Glikol (PEG) dalam Mdia In Vitro Mnybabkan Kondisi Ckaman yang Mnghambat Tunas Kacang Tanah. Pnlitian Hayati: 11 (39-48). Sirait, B. 2001. Evaluasi karaktr morfofisiologis dan produksi galur kdlai (Glycin max (L) Mrr) tolran aluminium yang dislksi scara in vitro. Tsis. Program Pascasarjana IPB. Widortno, dkk. 2002. Efktivitas Polythlna Glycol untuk Mngvaluasi Tanggapan Gnotip Kdlai trhadap Ckaman Kkringan pada Fas Prkcambahan. Hayati 9: 33-36. Widortno, W. Sudarsono. 2004. Evaluasi Sjumlah Galur kdlai Varian Somaklonal Hasil Slksi In Vitro trhadap Strs Kkringan. Hayati, 11: 11-20. KESIMPULAN 1. Pada mdia padat, brdasarkan hasil indks snsivitas kkringan, varitas Grobogan, Argomulyo dan Kaba yang ditanam pada mdia dngan pnambahan PEG 6000 mnunjukkan rspon pka kkringan, sdangkan Varitas Wilis dan Argomulyo mnunjukkan rspon tolran kkringan dan Varitas Tanggamus mnunjukkan rspon mdium tolran. Pada mdia cair, brdasarkan indks snsivitas mnunjukkan varitas Tanggamus dan Wilis Mdium dan Grobogan Pka. 2. Konsntrasi PEG yang mampu mnsimulasi kkringan pada mdia padat yaitu yaitu konsntrasi 60 gr/l. Konsntrasi PEG 5% pada mdia MS cair in vitro mampu 13