BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan Alat

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Perbanyakan P. citrophthora dan B. theobromae dilaksanakan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, sedangkan perbanyakan planlet mutan dilakukan di Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari sampai Agustus Bahan dan Alat Bahan tanaman yang dipakai yaitu biji buah JC, planlet mutan jeruk batang bawah JC hasil peningkatan keragaman genetik dengan induksi mutasi fisik dengan dosis radiasi sinar gamma 1000, 2000, 3000 rad. Isolat P.citrophthora dan B. theobromae. Media yang dipakai media dasar MS (Murashige-Skoog), KVMV (Kontrol Vitamin Morel Wetmore), PDA (Potato Dextros Agar), dan V8. Bahan Sterilisasi yang digunakan Alkohol 70%, alkohol 96%, dan aquades steril. Bahan lain yang digunakan yaitu HCL 1.0 N dan 0.1 N, NaOH 1.0 N dan 0.1 N, alumunium foil, plastik wrap, spirtus, tisu, agar. Peralatan untuk pembuatan media yaitu gelas ukur, labu takar, Erlenmeyer, gelas piala, pipet volumetrik, magnetic stirrer, spatula, hot plate, botol kultur, corong, timbangan analitik, ph meter, autoclave, dan oven. Peralatan untuk menanam antara lain Laminar Air Flow Cabinet, petridhis, lampu bunsen, pinset, hand sprayer, pisau, dan gunting. Peralatan lain yang digunakan yaitu ruang gelap, ruang kultur, rak kultur, penggaris, kamera digital.

2 11 Metode Penelitian Persiapan Inokulum P. citrophthora Isolat P. citrophthora merupakan hasil isolasi dari batang kayu jeruk yang berasal dari Desa Oehala, Kabupaten Soe, Nusa Tenggara Timur. Batang kayu yang menunjukan gejala terlebih dahulu dicuci menggunakan air mengalir, kemudian bagian yang sakit dipotong dengan ukuran 1x1cm, dan didesinfeksi dengan larutan klorok 0.5% selama 30 detik. Selanjutnya dibilas dengan air steril, dikeringkan dengan kertas tisu dan ditanam pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Setelah 3 sampai 4 hari masa inkubasi cendawan yang menunjukan ciri koloni Phytophthora sp. dibiakan pada media V8 untuk merangsang sporulasi. Persiapan Inokulum B. theobromae Isolat B. theobromae hasil dari isolasi tanah yang berasal dari Lampung. Isolasi dilakukan dengan metode trapping. Tanah diinokulasikan pada buah apel. Setelah tiga hari masa inkubasi pada baki steril, bagian buah apel yang berwarna coklat diambil secara aseptik dan diletakkan di atas media PDA. Setelah 3 hari masa inkubasi cendawan yang menunjukan ciri koloni Botryodiplodia dibiakan pada media PDA untuk mendapatkan biakan murni dan diidentifikasi. Perbanyakan Planlet Japansche Citroen Planlet berasal dari biji jeruk yang masih muda, berukuran ± 1 mm. Biji jeruk yang digunakan berasal dari buah muda JC dengan diameter antara 1-2 cm. Buah disterilkan terlebih dahulu dengan cara dicuci bersih kemudian direndam dengan menggunakan alkohol 96% selama 5 menit, kemudian buah dibakar dalam laminarflow untuk mengurangi kontaminasi saat pemisahan biji dan buah. Setelah itu buah dikupas menggunakan pisau steril dan dikeluarkan bijinya. Selanjutnya biji jeruk ditanam pada media kontrol vitamin morel wetmore (KVMW). Biji diinkubasi di ruang gelap dengan suhu ± 21 o C. Setelah ± 1-2 bulan tumbuh tunas, tunas dipisahkan dari kulit biji dan ditanam pada media Murashige and Skoog (MS). Biakan kemudian disimpan di ruang kultur dengan suhu ± 21 o C, dengan penyinaran lampu TL.

3 12 Perbanyakan Mutan Japansche Citrus Perbanyakan mutan dilakukan dengan cara mengisolasi 1-2 buku tunas terminal dari planlet penelitian sebelumnya, uji ketahanan mutan jeruk dengan dosis radiasi 1000, 2000, 3000 rad dan tanpa perlakuan iradiasi terhadap cekaman kekeringan. Eksplan dikulturkan pada media KVMW dengan penambahan ekstrak malt 500 mg/l. Sumber karbon yang digunakan adalah sukrosa 30 g/l dan dipadatkan dengan phytagel 2,5 g/l. Kemasaman media diatur 5,8 dengan menambahkan KOH atau HCl 1N. Planlet diinkubasi di ruang kultur dengan temperatur ± 21 o C, dengan penyinaran lampu TL. Uji Media Tanam Jeruk, P. citrophthora dan B. theobromae Pembuatan media menggunakan media yang biasa digunakan untuk media tumbuh jeruk, P. citrophthora, B.theobromae, antara lain Murashige and Skoog (MS) merupakan media yang biasa digunakan untuk planlet, Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan media yang biasa digunakan untuk B. theobromae dan P. citrophthora, V-8 merupakan media selektif yang baik untuk tumbuh P. citrophthora, MSPDA merupakan media campuran MS dan PDA, MSV8 merupakan media campuran MS dan V8. Peubah yang diamati adalah pertumbuhan patogen dan planlet pada masing-masing media. Pertumbuhan patogen diamati dengan mengukur diameter dalam waktu seminggu. Sedangkan pada planlet yang diamati adalah tinggi planlet, jumlah buku, jumlah daun, serta visual planlet dalam waktu satu bulan. Uji Ketahanan In vitro Planlet Planlet jeruk yang berumur ± 4-5 bulan dengan jumlah buku tiga dalam keadaan sehat disubkultur ke dalam tabung kultur berisi media MSPDA bersamaan dengan inokulasi patogen. Biakan patogen dilubangi dengan menggunakan cork borer dengan diameter 2 mm diletakkan di bagian pangkal batang. Tabung kultur diletakan pada ruang kultur dengan suhu ± 21 o C, dan penyinaran lampu TL. Pengamatan terhadap keparahan penyakit dilakukan setiap hari selama 2 minggu.

4 13 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Percobaan dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan dua faktor perlakuan dan empat ulangan. Faktor pertama adalah dosis radiasi yaitu tanpa iradiasi (JC), dosis iradiasi 1000 rad (J1000), 2000 rad (J2000), dan 3000 rad (J3000), sedangkan faktor kedua adalah patogen yaitu P.citrophthora dan B. theobromae. Pengamatan Tingkat Keparahan Penyakit dan Laju Infeksi Persentase kerusakan nekrosis dan gumosis pada planlet digunakan untuk menentukan tingkat keparahan penyakit dengan menggunakan metode pemberian skor skala 0 sampai 4 yang dilakukan secara kualitatif (Tabel 1). Tabel 1 Nilai skoring penyakit pada planlet yang terinfeksi penyebab penyakit BPB (Sinaga, komunikasi pribadi) Nilai skor % nekrosis dan gumosis Keterangan 0 0 x < 5 Tidak ada infeksi 1 5 x < 20 Serangan ringan 2 20 x < 40 Serangan sedang 3 40 x < 60 Serangan cukup berat 4 60 x < 100 Serangan sangat berat Keparahan penyakit dihitung menggunakan rumus Townsend & Heuberger dalam Aripin et al. (2003): KP = x 100% KP n i v i N Z = keparahan penyakit = jumlah planlet = nilai skor dari masing masing kategori = jumlah planlet yang diamati = nilai skor tertinggi

5 14 Laju infeksi penyakit dapat diukur dengan menggunakan rumus: r = 1/ t2 t1 (ln x 2 / 1- x 2 ln x 1/1- x 1) r = laju infeksi t = waktu pengamatan x = proporsi bagian tanaman atau bagian dari populasi tanaman yang terkena infeksi atau sakit 1 x = bagian atau populasi tanaman sehat